眼用制剂的制作方法

1.本发明涉及眼用制剂，尤其涉及一种抑制细菌和真菌生长的眼用制剂。


背景技术：

2.眼用制剂系指直接用于眼部发挥治疗作用的无菌制剂，含β-内酰胺类或氨基糖苷类等物质的眼用制剂可用于抑制细菌微生物的生长，含三唑类、多烯类等物质的眼用制剂可用于抑制真菌的生长。
3.抗菌肽是一种具有广谱抗菌的多肽，目前，抗菌肽阿克索肽可应用于化妆品中，例如专利授权公开号为“cn110868886a”，名称为“用于快速合成抗菌化妆品粉扑的生物相容性组合物及其制备方法”的发明专利，为阿克索肽作为抗菌剂应用于粉扑中。阿克索肽为广谱抗菌肽，可应用于其他领域尤其是药品中。


技术实现要素：

4.抗菌眼用制剂中，同一制剂不能既抑制真菌的生长又抑制细菌的生长，本发明目的在于提供抗一种能够同时抑制细菌和真菌生长的眼用制剂。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案。
6.一种眼用制剂，包括抗菌肽，所述抗菌肽为阿克索肽，所述阿克索肽用于抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的生长。
7.优选的，所述阿克索肽包括is和os中至少一种。
8.优选的，所述is氨基酸序列为ilrwpwwpwrrk，所述os氨基酸序列为rgglcycrgrfcvcvgr。
9.优选的，所述阿克索肽用于阻止细菌感染后眼球中细菌进入膜间质，减少细胞细胞死亡，抑制血管增生，抑制眼球表面膜结构增厚，抑制膜间质增多。
10.优选的，所述阿克索肽用于降低眼角膜和视网膜的vegf表达水平。
11.优选的，所述阿克索肽的浓度为100μm至420μm。
12.优选的，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌和副溶血弧菌，所述革兰氏阳性菌为大肠杆菌，所述真菌为白色念珠菌。
13.优选的，所述眼用制剂为液体制剂或半固体制剂。
14.优选的，所述液体制剂为滴眼剂或洗眼剂，所述半固体制剂为眼用凝胶剂或眼用乳膏剂。
15.优选的，所述滴眼剂包括溶解阿克索肽的生理盐水和药学上的辅料。
16.相对于现有技术，本发明提供的眼用制剂可用于抑制眼部感染中，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的生长，为广谱抗菌制剂，在眼球感染中，既能抑制细菌生长又能抑制真菌生长。
附图说明
17.图1是本发明提供的眼用制剂中阿克索肽抗菌实验金黄色葡萄球菌培养基示意图；
18.图2是本发明提供的眼用制剂中阿克索肽抗菌实验大肠杆菌培养基示意图；
19.图3是本发明提供的眼用制剂中阿克索肽抗菌实验副溶血弧菌培养基示意图；
20.图4是本发明提供的眼用制剂中阿克索肽抗菌实验白色念珠菌培养基示意图；
21.图5是本发明提供的眼用制剂中阿克索肽28天防腐挑战is组菌落形成示意图；
22.图6是本发明提供的眼用制剂中阿克索肽28天防腐挑战os组菌落形成示意图；
23.图7是金黄色葡萄球菌感染组pbs与眼球分泌物培养菌落计数统计示意图；
24.图8是大肠杆菌感染组pbs与眼球分泌物培养菌落计数统计示意图；
25.图9是泪液吉姆萨染色结果显微图；
26.图10是大鼠金葡菌感染中的裂隙灯拍摄结果示意图；
27.图11是大鼠大肠杆菌感染中的裂隙灯拍摄结果示意图；
28.图12是眼角膜he染色结果显微图；
29.图13是眼球表面和眼球底部免疫组化结果示意图；
30.图14是眼角膜vegf相对表达水平示意图；
31.图15是视网膜vegf相对表达水平示意图。
具体实施方式
32.为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
33.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
34.本发明提供一种眼用制剂，所述眼用制剂包括阿克索肽，所述阿克索肽为抗菌肽，所述阿克索肽包括is和os中至少一种。其中，所述is，氨基酸序列为ilrwpwwpwrrk，分子量大小为1.78kda，摩尔质量为1779.1g/mol；所述os氨基酸序列为rgglcycrgrfcvcvgr，分子量大小为1.90kda，摩尔质量为1900.3g/mol。
35.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
36.根据美国化妆品协会(cosmetic toiletry and fragrance association，ctfa)标准，将初始的霉菌和细菌的接种量分别控制在10000cfu/ml，和1000000cfu/ml，要求在第7天时霉菌降低90％，细菌降低99.9％，并且在28天内菌数持续下降。
37.实施列中所有实验数据都是经过三次测量后得出的，相关性分析及统计是通过graphpad prism8.0进行。组间比较采用t检验分析。*代表p《0.05，#代表p《0.05，差异具有统计学意义。
38.第一实施例
39.眼用制剂中阿克索肽的抗菌实验。
40.实验步骤：本实验在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，pbs)液体培养基
体系中完成。pbs配制过程为：称取8g nacl，0.2g kcl，1.42g na2hpo4，0.27g kh2po4置于1l烧杯中，向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将ph值调节至7.4，再加入去离子定容至1l。高温高压灭菌后室温保存。
41.金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，副溶血弧菌接种量为1000000cfu/ml；白色念珠菌接种量为10000cfu/ml。
42.配制以下母液：2000000cfu/ml金黄色葡萄球菌、2000000cfu/ml大肠杆菌、3000000cfu/ml的副溶血弧菌以及50000cfu/ml的白色念珠菌。is和os用无菌的pbs进行溶解，终浓度分别为260μm和420μm。
43.将母液、pbs缓冲液、采用pbs溶解的is和采用pbs溶解的os按照下表中的量加入到10ml离心管中，以is和os均未加入组，即pbs组为对照组。混匀后保存在37℃恒温培养箱中，在第2，4，7天取各取100μl涂布于lb固体培养基中，培养后计数菌落数。
[0044][0045]
结合参照图1、图2、图3和图4实验结果表明：阿克索肽的抗菌实验，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和白色念珠菌的对照组长满菌落，加入抗菌肽的实验组未长出明显的金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和白色念珠菌菌落，is组在第七天未形成大肠杆菌菌落，os组在第七天形成多个明显大肠杆菌菌落。
[0046]
第二实施例
[0047]
28天防腐挑战实验。
[0048]
首先配制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和白色念珠菌各种菌2000000cfu/ml的母液，is和os用无菌的pbs进行溶解，终浓度分别为260μm和420μm。将母液按照下表加入到10ml离心管中，以is和os均未加入组，即pbs组为对照组。混匀后保存在37℃恒温培养箱中，在第7，14，21，28天取各取25μl涂布于12孔板的lb固体培养基中，培养后菌落计数。
[0049][0050]
参照图5和图6，实验结果表明：28天防腐挑战中，通过涂布实验，对照组在28天内，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和白色念珠菌均在培养皿内形成明显菌落；is组在28天内，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和白色念珠菌均未在培养皿中形成明显菌落；os组在28天内，金黄色葡萄球菌，副溶血弧菌和白色念珠菌均未在培养皿中形成明显菌落。
[0051]
在28天的实验中，is对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和白色念珠菌杀菌率达到100％。os对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和白色念珠菌杀菌率达到100％。
[0052]
第三实施例
[0053]
取清洁级大鼠60只，对所有大鼠的眼睛进行裂隙灯显微镜检查，确保大鼠眼部没有缺陷，随机分为a1、a2、b1、b2、c1、c2六组，每组10只。所述a1、a2组为对照组，所述b1、b2组为抗生素治疗组，所述c1、c2组为阿克索肽治疗组。
[0054]
6组大鼠全部使用腹腔注射2％苯巴比妥钠(苯巴比妥钠的用量为35mg/kg)进行麻醉，使用26号针头刮除大鼠左眼角膜上皮，形成浅层伤口，不破坏基质层，大鼠右眼作为对照眼，不进行造模处理。其中a1、b1、c1组用等浓度金黄色葡萄球菌悬液滴在角膜表面即刻感染，a2、b2、c2组用等浓度大肠杆菌悬液滴在角膜表面即刻感染。a1、a2组作为模型对照组，给予生理盐水滴眼。b1组：感染后6h，所有大鼠均给予等体积头孢唑林滴眼液治疗，每2h给药1次，连续3天。b2组：感染后6h，所有大鼠均给予等体积妥布霉素滴眼液治疗，每2h给药1次，连续3天。c1、c2组：感染后6h，所有大鼠均给予采用生理盐水溶解，浓度为100μm的阿克索肽is溶液100μl滴眼液治疗，每2h给药1次，连续3天。在第3天实验结束时，大鼠利用2％苯巴比妥钠深度麻醉后，进行脱颈处死。通过下腹腔主静脉进行采血，离心后取血清，在-80℃下保存备用。取实验侧左眼及对照侧右眼进行组织固定，用于制作石蜡切片，部分眼角膜组织液氮速冻后-80℃保存，用于免疫印迹及qpcr等检测。
[0055]
为评价阿克索肽在大鼠眼球中的抑菌效果，进行了活菌计数测定。在第3天对各组大鼠进行麻醉。向大鼠实验侧眼球表面注射10μl无菌pbs后，再用枪头吸出pbs与眼球分泌物的混合液(共10μl)。将10μl的混合液滴加到lb固体培养基中进行涂布，37℃恒温培养16h
过夜后进行拍照。通过ipp 6.0对平板菌落形成数进行计数。
[0056]
活菌计数测定的结果参照图7和图8，结果显示阿克索肽治疗的c1和c2组菌落形成的数量是最少的。
[0057]
为评价阿克索肽在大鼠眼球中的抑菌效果，还进行了泪液的吉姆萨染色实验。从眼表收集感染3天后的大鼠泪液，将泪液滴加在载玻片上制作涂片，待自然晾干后，滴加100μl吉姆萨染色液染色30秒。再滴加200μl pbs于吉姆萨染液表面，5分钟后用自来水冲洗。结果通过光学显微镜(dm500，leica)进行拍摄。
[0058]
大鼠泪液染色的结果参照图9，结果显示a1金葡菌模型组中正常眼球上皮细胞数量减少，并且细胞核丢失，细胞形态固缩。b1给予头孢唑林滴眼液治疗后，正常上皮细胞的数量增加，少量细胞侵入到细胞内部。c1阿克索肽组治疗后，细胞正常上皮细胞数量增加，细胞内部未见明显细菌侵入现象，但部分上皮细胞细胞核异型。a2大肠杆菌模型组中上皮细胞固缩，细胞核异型。b2妥布霉素治疗组上皮细胞数量恢复，但细胞内可见大量细菌侵入。c2组正常细胞的数量较b2要少，但是在仅剩的细胞中，未见其被细胞侵入的现象。
[0059]
为评价阿克索肽在防治眼部损伤后细菌感染中的保护作用，进行了对大鼠进行了眼球裂隙灯检查、角膜荧光素钠染色和眼球组织he染色实验。
[0060]
眼球裂隙灯检查：用裂隙灯分别在第0和3天对大鼠眼睛进行裂隙灯显微镜检查。
[0061]
角膜荧光素钠染色：在感染3天后，将大鼠麻醉，对所有大鼠的眼睛进行角膜荧光素钠染色，在其眼角部位滴加5μl 1％荧光素钠(solarbio)进行染色3分钟，再通过钴蓝灯对大鼠眼球进行拍摄。结果通过image-pro plus 6.0(ipp 6.0)进行计算。
[0062]
眼球裂隙灯检查和角膜荧光素钠染色鉴定标准如下：
[0063]
(1)结膜充血：0级为无明显充血；1级为血管轻度充血，但小于2个象限，不伴有球结膜水肿；2级为血管充盈迂曲明显，大于2个象限，伴球结膜水肿；3级为全部球结膜血管充血迂曲，伴有球结膜水肿和睫状充血。
[0064]
(2)角膜溃疡面积：2％角膜荧光素钠染色后，裂隙灯显微镜钴蓝光下放大16倍采集照片，采用imagej软件对溃疡区面积进行测量。
[0065]
(3)角膜新生血管：0级无新生血管；1级新生血管少于1个象限；2级新生血管占1或2个象限；3级新生血管占2或3个象限；4级新生血管占3或4个象限，甚至覆盖整个角膜表面。
[0066]
he染色：将新鲜取材的眼球组织置于10％中性甲醛液中固定24h后，酒精脱水。石蜡包埋后，制作成5μm石蜡切片。切片在65℃烘箱中进行石蜡熔解20分钟。二甲苯中浸泡20分钟，梯度酒精复水后，进行苏木精染色3分钟后自来水冲洗1分钟，1％酒精盐酸分化3秒。0.1％nahco3进行反蓝后，伊红染色5秒。95％酒精脱水后烘干，二甲苯透明后中性树胶封片。结果通过光学显微镜进行拍摄。
[0067]
眼球裂隙灯检查和角膜荧光素钠染色实验结果参照图10和图11，裂隙灯显微镜检查和角膜荧光色钠染色实验的结果表明，a1和a2组大鼠在分别感染金葡菌和大肠杆菌3天后，眼球表明浑浊，血管出现增生。钴蓝灯下，能看到出现大面积的细菌侵入损伤(眼球表面绿色荧光部位)。c1和c2组阿克索肽治疗后，均减少了荧光素钠染色的面积，阿克索肽在大肠杆菌感染中的荧光素钠染色面积的减少效果更强。
[0068]
he染色病理检测结果参见图12，结果表明，金葡菌和大肠杆菌感染后，大鼠眼球表明的膜结构明显增厚，尤其是金葡菌模型组。a1金葡菌模型组眼球表面细胞出现大量死亡，
并且膜间质增多，与裂隙灯下浑浊的眼球特征相符。c1组眼角膜结构较a1组要明显变薄，在膜间质中存在少量死亡的细胞。c2组眼球表面细胞结构较完整，膜间质内未见明显细菌侵入。
[0069]
为检测眼球表面及底部的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)表达水平，采取免疫组化对眼部vegf进行检测。
[0070]
取石蜡切片进行脱蜡复水后，置入0.01m枸橼酸缓冲液(ph＝6.0)中，在121℃高压蒸汽灭菌锅中进行抗原修复20分钟。抗原修复后自然冷却至室温。滴加3％h2o2(3％过氧化氢)对内源性过氧化酶灭活15分钟后，采用pbs溶解的1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)进行抗原封闭30分钟。滴加兔抗大鼠vegf(1：50稀释，用1％bsa溶解)在4℃下孵育过夜。第二天，倾去一抗后，采用洗膜缓冲液(tris buffered saline tween，tbst)清洗3次，tbst配制过程为：取8.8gnacl，20ml 1mol/l tris-hcl缓冲液置1l烧杯中，向1l烧杯中加入800ml去离子水，搅拌溶解后加入0.5ml吐温20(tween 20)后充分混匀，加入去离子水定容至1l后于4℃条件下保存。滴加偶联辣根过氧化物酶羊抗兔-igg二抗(1:100稀释)室温孵育60分钟，采用洗tbst清洗3次。dab显色液显色。苏木精复染后酒精梯度脱水。二甲苯透明后中性树胶封片。结果通过光学显微镜观察，并利用ipp 6.0进行分析。
[0071]
免疫组化结果结合参见图13、图14和图15，结果提示，阿克索肽的治疗显著降低眼球表面和底部vegf的表达水平，阿克索肽治疗组同对照组相比，差异均具有统计学意义(p《0.05)。
[0072]
本发明提供的眼用制剂中包含的阿克索肽为广谱抗菌物质，可抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的生长，因此本发明提供的眼用制剂可用于抑制眼部感染中，革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的生长，保护眼球。
[0073]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。