一种猪瘟和猪伪狂犬二联疫苗及其制备方法和应用与流程

制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体pshuttle-e2/gb线性酶切插入到复制缺陷型黑猩猩腺病 毒载体，构建重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒；
12.(3)、制备重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒液：将复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒转染 hek293细胞，获得基因组结构均一的重组腺病毒，收集重组腺病毒病毒感染的病变细 胞，连同上清液冻存，根据需要制备成所需病毒液。
13.步骤(1)采用引物扩增法制备，其中猪瘟病毒抗原蛋白e2的
14.上游引物:5'-taggcttctatctagtctgcgcaata-3'，
15.下游引物:5'-gaatgaagattatgctatggtacgtag-3'。
16.猪伪狂犬病毒蛋白gb的
17.上游引物为:5
’‑
ccagtcgcaggccaccgtgagtg-3'，
18.下游引物为:5
’‑
atcgcgtgctcttcatggagatc-3'。
19.一种如前所述的猪瘟和猪伪狂犬二联疫苗在用于制备防疫猪瘟和伪狂犬病毒药品或药盒 中的应用。
20.在实践中，获得复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒的具体方法如下：
21.将获得的重组腺病毒穿梭载体pshuttle-e2/gb与腺病毒骨架padc线性载体混合，使用 in-hd cloning kit进行重组反应。转化stbl2感受态细胞，鉴定阳性克隆，然后提质 粒，padc-e2/gb。
22.用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：
23.1)酶切，用pac i酶切腺病毒质粒，
24.2)转染，转染hek 293细胞，
25.3)接种hek 293细胞，
26.4)获得基因组结构均一的重组腺病毒，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存即得。
27.步骤(1)中所设计的csfv和prv抗原蛋白基因的扩增引物为，
28.csfv上游引物为:5'-gaatctggtgggtccctc-3'(含有xbai酶切位点)
29.csfv下游引物为:5'-gttaccctcacctccttgg-3'(含有kpni酶切位点)
30.prv gb上游引物为:5
’‑
ccagtcccaggccaccgtgaagtg-3'(含有kpni酶切位点)
31.prv gb下游引物为:5
’‑
atcgccgtgctcttcaaggagaac-3'(xbai酶切位点)
32.其中，csfv e2基因扩增长度294bp，prv gb基因扩增长度632bp。
33.实践中，在所述的过程(2)中，所述的腺病毒载体启动子为cmv；终止子为polya；
34.所述的重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：
35.通过分子克隆方法将e2和gb构建克隆进pshuttle载体，得到质粒pshuttle-e2/gb。
36.1)将回收得到的目的基因e2经xbai、kpni双酶切，目的基因gb经kpni、xbaii双酶 切后，形成带有粘性末端的目的基因；
37.2)同时，将腺病毒穿梭载体pshuttle经xbaii、kpnii双酶切，得到线性化的载体；
38.3)使用t4 dna连接酶对上述产物进行粘端连接；
39.4)按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌jm109，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选， 挑选克隆后，提取质粒；
40.5)采用酶切、pcr扩增方法鉴定，得到阳性重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体 pshuttle-e2/gb。
41.进一步地，在所述的过程(3)中，所述的获得复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒的过程包括 以下操作：
42.1)将重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体pshuttle-e2/gb用paci酶单酶切以线性化；
43.2)取padc与线性化重组穿梭载体混合，使用in-hd克隆试剂盒进行重组反应 获得重组腺病毒质粒padc-e2/gb。高压电转化stbl2感受态细胞；
44.3)电转后将细胞在培养液中复苏，挑选阳性克隆，小量提取质粒dna,用0.8％琼脂糖凝 胶进行电泳迁移率分析，并进行限制性内切酶图谱分析；
45.4)将所得的重组腺病毒质粒以上述同样条件电转化入宿主菌，在此宿主菌中可获得大量 高质量的质粒，挑取目的克隆。
46.进一步地，在所述的过程(4)中，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒 的各操作的具体做法为：
47.1)用pac i酶切，暴露其反转末端重复序列itr；
48.2)转染，脂质体介导的转染，在组织培养皿中接种hek 293细胞进行转染，步骤如下：
49.①
稀释pac i酶切线性化的重组腺病毒质粒至dmem培养液中；
50.②
然后将脂质体lipofectamine2000悬液加至dmem培养液中，充分将二者混匀，室温 下温育；
51.②
在此期间吸弃细胞原培养液，用dmem培养液洗细胞一次；
52.④
往每平皿加dna/脂质体复合物，在5％co2培养箱中温育后吸弃含dna/脂质体复合 物的培养液；
53.⑤
补加含10％小牛血清的dmem完全培养液，继续培养，脂质体转染后收集细胞，反 复冻融。
54.3)接种，取病毒上清接种hek 293细胞，以含2％小牛血清的完全dmem培养液于培 养箱中培养，逐日观察细胞病变cpe,到hek 293细胞完全病变；
55.4)检测e2和gb抗原蛋白基因已经整合到腺病毒载体中，检测e2和gb抗原蛋白基因 获得表达，检测项目如下：
56.①
检测基因已经整合到腺病毒载体中，其做法是釆用pcr和限制性内切酶鉴定，进行琼 脂糖凝胶电泳分析检测。
57.②
检测:获得表达，其做法是釆用wb监测蛋白表达的办法。
58.本发明中猪伪狂犬病病毒抗原蛋白gb基因来自基因库no.kp710982，猪瘟病毒抗原蛋 白e2基因来自基因库no.dq907718。复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体由上海巴斯德所惠赠， 是经过改造的黑猩猩腺病毒载体(padc)，padc与野生型腺病毒adc基因组相比，该复制 缺陷型黑猩猩腺病毒载体删除野生型腺病毒基因组的第458-3026位部分e1编码区和第 27094-31799位全部e3编码区，在该载体序列的2348位和2380位引入i-ceui和pi-sce作为 外源基因的插入位点。
59.复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体(padc)构建具体方法如下：
60.a.将来源于pneb193的origin序列、来源于adc腺病毒基因组的litr片段、来源于 adc腺病毒基因组的ndei-agei片段通过融合pcr融合成片段oln，用spe i与age i酶切 片段oln；用nde i、age i与spe i酶切adc腺病毒基因组，将切下的片段 age(4028)-spei(10610)与已酶切过的片段oln相连接形成质粒poin。
61.b.用hind iii和avr ii酶切adc基因组，将切下的目的片段hind iii(7153)-avr ii(23363) 插入到质粒poin的hind iii和avr ii位点中，获得的质粒命名为poinh。
62.c.从adc腺病毒基因组中扩增位于adc腺病毒基因中31800-36535之间的片段，在5
’ꢀ
端引入avr ii与rsr ii酶切位点，在3’端引入pac i与asis i位点，将扩增的片段插入到poinh 的avr ii与asis i位点中，获得的质粒命名为poinhr；
63.d.从adc腺病毒基因组中扩增位于adc腺病毒基因中23165-27093之间的片段，在3
’ꢀ
端引入rsr ii位点，将扩增的片段插入到poinhr的avr ii与rsr ii位点中，获得复制缺陷 型的重组腺病毒表达载体。
64.实践中，重组腺病毒高剂量1剂接种28天，刺激的抗猪瘟病毒抗体和抗伪狂犬病毒抗体 比市兽商业猪瘟疫苗和伪狂犬病疫苗诱导的抗体水平更显著；相比市兽商业猪瘟疫苗和伪狂 犬病疫苗，重组腺病毒高剂量1剂接种后7天即可产生抗体，抗体反应更快速，可更好的保 护母源抗体降低的“空窗期”仔猪；相比市兽商业猪瘟疫苗2剂间隔21天接种，重组腺病毒 高剂量仅需接种1剂，具有极高的经济价值和市场价值；重组腺病毒高剂量1剂接种，未出 现猪瘟活病毒疫苗和猪伪狂犬病疫苗同时免疫而引起的免疫抑制反应，可解决实际生产中上 述两种疫苗无法同时免疫的问题，具有极高的生产价值。
65.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
66.本发明采用特定的猪瘟病毒抗原蛋白e2基因与猪伪狂犬病病毒抗原蛋白gb基因插入到 腺病毒载体上，能够避免猪伪狂犬病病毒和猪瘟病毒同时作为抗原时发生的免疫干扰现象， 提升了猪瘟病毒抗体产生的速度，使得注射疫苗后注射对象获得保护效率得到提升，获得了 免疫受体能够在免疫7天内产生猪瘟抗体的意想不到的效果。
附图说明
67.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不 构成对本发明实施例的限定。在附图中：
68.图1为重组猪瘟和伪狂犬病二联疫苗感染细胞液west blot图。
69.图2为重组猪瘟和伪狂犬病二联疫苗感染hek293细胞病变图。
70.图3为重组猪瘟和伪狂犬病二联疫苗仔猪攻毒后体温曲线图。
71.图4为空白对照组仔猪攻毒后体温曲线图。
72.图5为组织病变对比图(仔猪攻毒后组织剖检监测)。
具体实施方式
73.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明 作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本 发明的限定。
74.实施例1
75.疫苗的制备
76.(一)制备目的基因
77.设计引物，通过pcr的方法扩增岀猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒抗原蛋白基因；在本过程 一中所设计的抗原蛋白基因的扩增引物为：
78.cfsv e2上游引物:5'-taggcttctatctagtctgcgcaata-3'(含有xbai酶切位点)
79.cfsv e2下游引物:5'-gaatgaagattatgctatggtacgtag-3'(含有kpni酶切位点)
80.prv gb上游引物为:5
’‑
ccagtcgcaggccaccgtgagtg-3'(含有kpni酶切位点)
81.prv gb下游引物为:5
’‑
atcgcgtgctcttcatggagatc-3'(xbai酶切位点)
82.其中，csfv e2基因扩增长度294bp，prv gb基因扩增长度632bp。
83.(二)构建重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体
84.将所述的猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒抗原蛋白抗原蛋白基因插入到复制缺陷型黑猩猩腺 病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，构建成含有目的基因的重组复制缺陷型黑猩猩腺 病毒穿梭载体pshuttle-e2/gb；
85.在本过程中，
86.所述的腺病毒载体启动子为cmv；终止子为polya；
87.所述的重组腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：
88.1.将回收得到的目的基因经i-ceu i和pi-sce双酶切，形成带有粘性末端的目的基因；
89.2.同时，将腺病毒穿梭载体pshuttle经i-ceu i和pi-sce双酶切，得到线性化的载体；
90.3.使用t4 dna连接酶对上述产物进行粘端连接；
91.4.按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克 隆后，提取质粒；
92.5.采用酶切、pcr扩增方法鉴定，得到阳性重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体 pshuttle-e2/gb。
93.(三)获得复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒
94.将获得的重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒穿梭载体pshuttle-e2/gb与腺病毒骨架载体padc 通过在大肠杆菌中质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；在本过程三中，所述的获得复 制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒的过程包括以下操作：
95.进一步地，根据权利要求1所述的利用腺病毒载体表达猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒抗原 蛋白基因制备重组腺病毒(重组猪瘟病毒和猪伪狂犬病二联活疫苗)疫苗的方法，其特征是： 在所述的过程(4)中，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒的各操作的具体 做法为：
96.1.将重组穿梭载体pshuttle-e2/gb分别用pme i单酶切以线性化；
97.2.取0.lmg padc与1.0mg线性化重组穿梭载体混合，高压电转化大肠杆菌；
98.3.电转后将细胞在lb培养液中于37℃复苏30min，取细胞涂入含50mg/ml卡那霉素的 培养板中，于37℃培养16～20h；
99.4.挑选卡那霉素抗性克隆，小量提取质粒dna,用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析， 并进行限制性内切酶图谱分析；
100.5.将所得的重组腺病毒质粒以上述同样条件电转化入宿主菌,在此宿主菌中可获得大量高 质量的质粒，挑取目的克隆。
101.(四)用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒
102.1.酶切：取从宿主菌中提取的各重组腺病毒质粒4ug，用pac i酶切，完全消化以切去ori 和kan抗性基因等质粒构件，并暴露其反转末端重复序列itr；
103.2.转染：脂质体介导的转染，在35mm组织培养皿中接种hek 293细胞进行转染。所述 的脂质体介导的转染包括以下分操作：
104.(1)稀释pac i酶切线性化的重组腺病毒质粒至250ul dmem培养液中；
105.(2)然后将脂质体lipofectamine2000悬液加至250ul dmem培养液中，充分将二者混 匀，室温下温育20min；
106.(3)在此期间吸弃细胞原培养液，用dmem培养液洗细胞一次；
107.(4)往每平皿加500ul dna/脂质体复合物，在37℃，5％c02培养箱中温育3～5h后吸 弃含dna/脂质体复合物的培养液，
108.(5)补加3ml含10％小牛血清的dmem完全培养液，继续培养7天，脂质体转染后， 收集细胞，反复冻融3次。
109.3.接种，取病毒上清接种hek 293细胞，以含2％小牛血清的完全dmem培养液于37℃， 5％c02培养箱中培养，逐日观察细胞病变cpe，至hek 293细胞完全病变；
110.4.冻存，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存于-20℃检测过程五：包括pcr检测 e2和gb抗原蛋白基因已经整合到腺病毒载体中和wb检测e2和gb抗原蛋白基因获得表达。
111.5.所述的检测e2和gb抗原蛋白基因已经整合到腺病毒载体中，釆用pcr和限制性内切 酶鉴定，进行琼脂糖凝胶电泳分析。将所获得的含有目的基因的重组穿梭载体pshuttle-e2/gb 经i-ceu i和pi-sce双酶切鉴定可切出约e2 294bp、g b632bp的目的片段。同时pcr鉴定也 可扩增出大小相符的e2和gb抗原蛋白基因目的片段，通过与标准分子量对比可判断。
112.所述的检测e2和gb抗原蛋白基因获得表达，采用蛋白表达的办法：包括利用倒置显微 镜观测细胞病变，可见对照细胞正常生长,而转染细胞岀现明显的细胞病变。利用wb检测可 直接观测到蛋白的表达。将经检测合格的细胞病毒液重组腺病毒(表达猪瘟e2蛋白和猪伪狂 犬g b蛋白)接注射动物进行免疫。
113.重组猪瘟病毒和狂犬病病毒疫苗的免疫效力实验动物试验
114.1.试验动物筛选
115.选取3～4周龄的仔猪。
116.2.免疫接种
117.试验组共免疫2次间隔21天。
118.一免：0d，共注射1ml；
119.二免：21d，共注射1ml。
120.3.血清采集
121.在免疫后7、14、21；攻毒后21日采血。
122.4.攻毒
123.免疫21天用狂犬病毒攻击(prv 2018株，10
5.5
tcid
50
/ml,川大杨鑫教授赠送)，观察21 天。
124.5.攻毒后观察
125.体温：攻毒后测温
126.组织：攻读后剖检所有存活试验猪，观察各脏器病变及抗原含量。
127.1.1重组狂犬病病毒(黑猩猩腺病毒载体)病毒含量测定
128.用tcid
50
法测定各样品中的病毒效价。具体方法如下：
129.tcid
50
(tissue culture infective dose)，半数组织培养感染剂量，由于腺病毒在hek293 细胞内复制感染导致典型的细胞病变效应(cpe)，通过显微镜观察，cpe的程度反映病毒 的毒力。
130.(1)将96孔板中培养的hek293细胞提前1天铺板，培养箱中过夜至细胞贴壁形成单 层。
131.(2)次日病毒样品做连续的10倍梯度稀释后，每孔100ul加入细胞中，培养箱中培养10 天，将抗原液进行10倍系列稀释，取10-4
、10-5
、10-6 3个稀释度，分别接种hek293细胞单层 的96孔细胞培养板，每孔接种100μl，每个稀释度接种6孔，同时设立正常细胞与阳性对照， 吸附1h后每孔补加100μl含细胞维持液，置37℃含5％co2的培养箱中继续培养。
132.(3)逐日观察细胞的病变情况，根据观察结果，依据karber法计算感染滴度，公式简化 为t＝7
×
10
(s 0.5)
。原液感染滴度应≥5.0
×
107pfu/ml。
133.1.2重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)免疫原性和攻毒保护分析
134.本试验选取21日龄csfv和prv抗原、抗体均为阴性的健康仔猪共8头，随机分为2 组，疫苗免疫组5头，对照组3头。试验组，采用颈部肌肉注射方式进行接种，接种剂量为 1.0ml/头(含1头份)，，病毒含量为10
6.0
vp/ml，同时不接种1组为空白对照。一次免疫后21 日再次接种，颈部肌肉注射1.0ml/头(含1头份)。二次免疫后14日，每头仔猪滴鼻接种prv 2018株2.0ml/头(10
6.0
tcid
50
)。攻毒后连续观察21日，每次监测体温、临床症状，记录仔 猪死亡数，21日后对所有存活猪进行剖杀，观察组织病变。
135.临床观察：每日定时测定体温1次，攻毒后每日定时测定体温1次，连续观察21日，同 时观察试验猪精神、食欲状态等全身反应。攻毒后21日，剖检所有存活猪观察组织病理情况。
136.1.3重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)不同剂量免疫原性分析
137.本试验选取21日龄csfv和prv抗原、抗体均为阴性的健康仔猪，随机分为4组，疫 苗免疫3组(每组4头)，对照组1组(3头)。试验组，采用颈部肌肉注射方式进行接种， 接种高中低三个不同剂量(病毒含量从低到高依次为：10
6.0
vp/ml、10
7.0
vp/ml和10
8.0
vp/ml) 的重组腺病毒疫苗1.0ml/头，免疫程序为间隔21天2剂。
138.免疫原性观察：免疫前和免后每隔7天采血测猪瘟和伪狂犬抗体。
139.临床观察：免疫后连续14日每日定时测定体温1次；免疫后连续观察21日，包括试验 猪精神、食欲状态等全身反应。
140.1.4重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)免疫抑制分析
141.本试验选取21日龄csfv和prv抗原、抗体均为阴性的健康仔猪20头，随机分为4组， 每组5头。试验组，采用颈部肌肉注射方式进行接种，接种剂量为1.0ml/头(含1头份)。实 验
组仔猪免疫重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)按照最高免疫剂量10
8.0
vp/头份免疫仔猪； 对照组共三组，实验1组仔猪同时免疫市售猪瘟活疫苗(批号2019064)和猪伪狂犬活疫苗(批 号201901)，试验2组仔猪免疫市售猪瘟活疫苗，试验3组仔猪免疫市售猪伪狂犬活疫苗， 对照组参照市售疫苗说明书进行免疫接种。
142.免疫原性观察：免疫前和免后每隔7天采血测猪瘟和伪狂犬抗体。观察重组腺病毒(表 达猪瘟和伪狂犬蛋白)免疫仔猪的猪瘟抗体和伪狂犬抗体与相比单一猪瘟疫苗或伪狂犬疫苗 免疫的差异，分析重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)是否会导致猪瘟抗体或伪狂犬抗体 下降。
143.2.结果
144.2.1重组猪瘟和伪狂犬病联合疫苗(黑猩猩腺病毒载体)构建
145.将猪瘟病毒e2序列和伪狂犬病毒g b序列插入至非复制型黑猩猩腺病毒载体构建重组腺 病毒质粒，质粒转染hek293细胞收集病毒感染的病变细胞培养液，即获得重组猪瘟和伪狂 犬病联合病毒(黑猩猩腺病毒载体)。
146.2.结果
147.2.1重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)构建
148.将猪瘟病毒e2序列和伪狂犬病毒g b序列插入至非复制型黑猩猩腺病毒载体构建重组腺 病毒质粒，质粒转染hek293细胞收集病毒感染的病变细胞培养液，即获得重组腺病毒(表 达猪瘟和伪狂犬蛋白)。
149.2.1.1 west blot分析
150.重组猪瘟和伪狂犬病联合病毒(黑猩猩腺病毒载体)感染细胞培养液经west blot分析可 见猪瘟病毒e2和伪狂犬病毒g b蛋白。结果详见图1。
151.2.1.2病毒含量分析
152.重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)感染hek293细胞后，细胞出现明显病变
153.(cpe)，经半数组织感染量(tcid
50
)检测，重组腺病毒含量不低于5.0
×
10
7.0
pfu/ml。结 果详见图2。图2为重组猪瘟和伪狂犬病二联疫苗感染hek293细胞病变图。图2中a：质 粒转染hek293细胞；b：hek293细胞
154.2.2重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)免疫原性及攻毒保护分析
155.2.2.1免疫原性：抗体监测
156.重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)按照最低免疫剂量10
6.0
vp/头份免疫仔猪后按计划 采血，通过idexx猪瘟和伪狂犬抗体检测试剂盒进行分析，重组二联疫苗可诱导仔猪产生猪 瘟病毒抗体和伪狂犬病毒抗体。二联疫苗一免后21天伪狂犬病毒抗体阳转率100％，二免后 7天，猪瘟抗体和伪狂犬病毒抗体阳转率100％。结果详见表2.2.1-1。
157.表2.2.1-1仔猪免疫后猪瘟抗体和伪狂犬病抗体统计表
[0158][0159]
2.2.2攻毒保护：临床症状监测
[0160]
重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)按照最低免疫剂量10
6.0
vp/头份免疫仔猪，首免后 35天攻毒，免疫组仔猪未出现任何不良症状，对照组仔猪体温升高且出现死亡。结果详见表 2.2.2-1、图3(重组猪瘟和伪狂犬病二联疫苗仔猪攻毒后体温曲线图)和图4(空白对照组仔 猪攻毒后体温曲线图)。
[0161]
表2.2.2-1仔猪攻毒后临床症状、剖检变化和保护率统计表
[0162][0163]
注：“ ”表示3日体温40.5℃以上；或精神、食欲下降；或共济失调、划水样、转圈等临床症状； 或脑膜增厚、充血；脑脊液增多；或死亡。
“‑”
为无上述症状。
[0164]
2.2.3攻毒保护：组织病变
[0165]
重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)按照最低免疫剂量10
6.0
vp/头份免疫仔猪，首免后 49天攻毒。攻毒后剖检可见，免疫组仔猪未脑组织未出现任何病变，对照组仔猪脑组织充血、 出血。结果详见图5。左为免疫组，右为对照组。
[0166]
2.3重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)不同剂量免疫原性观察
[0167]
重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)按照高中低三个不同剂量(病毒含量从低到高依 次为：10
6.0
vp/ml、10
7.0
vp/ml和10
8.0
vp/ml)免疫仔猪后按计划采血，通过idexx猪瘟和伪 狂犬抗体检测试剂盒进行分析。
[0168]
重组二联疫苗诱导仔猪产生猪瘟病毒抗体和伪狂犬病毒抗体与免疫剂量成正相关性。高 剂量组首剂免后7天即可产生看猪瘟和伪狂犬病毒的抗体，免后14天接近100％，免疫后21 天猪瘟和伪狂犬抗体阳转率100％，且显著优于低剂量和中剂量组，结果详见表2.3-1。
[0169]
表2.3-1仔猪免疫后猪瘟抗体和伪狂犬病抗体统计表
[0170][0171]
综上，重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)免疫程序可由2剂间隔21天改为高剂量1 剂免疫预防瘟病毒和伪狂犬病毒。
[0172]
2.4重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)免疫抑制观察
[0173]
免疫重组腺病毒(表达猪瘟和伪狂犬蛋白)按照最高免疫剂量10
8.0
vp/头份1剂免疫仔猪； 对照组共三组，实验1组仔猪同时免疫市售猪瘟活疫苗和猪伪狂犬活疫苗，猪瘟活疫苗参照 市售说明，2次间隔21天免疫。试验2组仔猪免疫市售猪瘟活疫苗，参照市售说明，2次间 隔21天免疫。试验3组仔猪免疫市售猪伪狂犬活疫苗，参照市售说明，1剂免疫。
[0174]
免疫后按计划采血，通过idexx猪瘟和伪狂犬抗体检测试剂盒进行分析，重组二联疫苗仅免 疫1剂即可诱导仔猪产生猪瘟病毒抗体和伪狂犬病毒抗体水平。与对照2组(免疫商业化猪 瘟活病毒疫苗，2剂间隔21天)和对照3组(免疫商业化猪伪狂犬活病毒疫苗，1剂)相比 抗体产生水平更高，具有显著差异；与对照1组(同时免疫市售猪瘟活疫苗和猪伪狂犬活疫 苗)相比，无论是猪瘟和伪狂犬血清中和抗体均显著高于对照1组。结果详见表2.2.4-1和表 2.2.4-2。
[0175]
表2.2.4-1重组腺病毒二联疫苗(猪瘟抗体阻断率)免疫抑制统计表
[0176][0177]
表2.2.4-2重组腺病毒二联疫苗(伪狂犬抗体阻断率)免疫抑制统计表
[0178][0179]
从上述表中可以看出，重组腺病毒高剂量1剂接种28天，刺激的抗猪瘟病毒抗体和抗伪狂犬病毒抗体比市兽商业猪瘟疫苗和伪狂犬病疫苗诱导的抗体水平更显著；相比市兽商业猪瘟疫苗和伪狂犬病疫苗，重组腺病毒高剂量1剂接种后7天即可产生抗体，抗体反应更快速，可更好的保护母源抗体降低的“空窗期”仔猪；相比市兽商业猪瘟疫苗2剂间隔21天接种，重组腺病毒高剂量仅需接种1剂，具有极高的经济价值和市场价值；重组腺病毒高剂量1剂接种，未出现猪瘟活病毒疫苗和猪伪狂犬病疫苗同时免疫而引起的免疫抑制反应，可解决实际生产中上述两种疫苗无法同时免疫的问题，具有极高的生产价值。
[0180]
本发明中，未详细描述的均是现有技术。
[0181]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0182]
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[0184]
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