通过高剪切溶解来分离蜘蛛丝蛋白的方法与流程

技术特征：
1.一种从宿主细胞分离重组蜘蛛丝蛋白的方法，其包括：a.提供包含重组蜘蛛丝蛋白的不溶性团块；b.将所述不溶性团块添加到包含溶剂的水性溶液中；c.向包含所述不溶性团块的所述水性溶液施加剪切力，从而使所述重组蜘蛛丝蛋白溶解在所述水性溶液中。2.如权利要求1所述的方法，其中所述剪切力是通过微流体化施加的。3.如权利要求2所述的方法，其中所述微流体化产生约6
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至10
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的剪切速率。4.如权利要求2所述的方法，其中所述微流体化产生至少约6
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的剪切速率。5.如权利要求2所述的方法，其中所述微流体化产生至少约10
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的剪切速率。6.如权利要求2-5所述的方法，其中所述微流体化在20,000psi至30,000psi下进行。7.如权利要求6所述的方法，其中所述微流体化在30,000psi下进行。8.如权利要求6所述的方法，其中所述微流体化在23,000psi下进行。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中微流体化器是m-110p或lm10微流体化器。10.如权利要求9所述的方法，其中所述微流体化器包括g10z相互作用室。11.如权利要求9所述的方法，其中所述微流体化器包括f12y相互作用室。12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述剪切力施加至少两次。13.如权利要求12所述的方法，其中所述剪切力施加至少三次。14.如权利要求12所述的方法，其中所述剪切力在至少两次施加中是相同的。15.如权利要求12所述的方法，其中所述剪切力在至少两次施加中是不同的。16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不溶性团块来源于包含宿主细胞的细胞培养物，其中所述宿主细胞表达所述重组蜘蛛丝蛋白。17.如权利要求16所述的方法，其还包括收集来源于所述细胞培养物的所述不溶性团块，其中所述不溶性团块包含所述重组蜘蛛丝蛋白。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述溶剂是离散剂。19.如权利要求18所述的方法，其中所述离散剂是尿素、硫氰酸胍(gdnscn)或氯化胍(gdnhcl)。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述不溶性团块以约5％、10％、15％、20％、25％或30％不溶性团块/溶剂体积添加到所述水性溶液中。21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述离散剂以0.1-10m的浓度存在于所述水性溶液中。22.如权利要求19或20所述的方法，其中所述水性溶液包含约10m尿素、约4m-8m gdnhcl或约3m-6m gdnscn。23.如权利要求19或20所述的方法，其中所述水性溶液包括不多于包含10m尿素的水性溶液、包含8m gdnhcl的水性溶液或包含6m gdnscn的水性溶液的离液活性。24.如权利要求23所述的方法，其中所述离液活性使用琼脂-胶凝测定进行量化。25.如权利要求20所述的方法，其中所述水性溶液包括约15％不溶性部分团块与85％体积的3m gdnscn。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述水性溶液包括约15％不溶性部分团块与85％体积的4m gdnhcl。27.如权利要求20所述的方法，其中所述水性溶液包括约15％不溶性部分团块与85％体积的10m尿素。28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述不溶性团块在20℃与30℃之间温育。29.如权利要求28所述的方法，其中所述不溶性团块在室温下温育。30.如权利要求28所述的方法，其中所述不溶性团块在不高于30℃下温育。31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述不溶性部分在包含所述溶剂的所述水性溶液中温育60至120分钟。32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述不溶性团块包含细胞沉淀。33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中收集来源于所述细胞沉淀的所述不溶性团块包括裂解所述宿主细胞。34.如权利要求33所述的方法，其中裂解包括热处理、化学处理、剪切破坏、物理匀化、声处理或化学匀化。35.如权利要求33至34所述的方法，其中收集所述细胞培养物的所述不溶性团块还包括离心所述裂解细胞以获得第一细胞沉淀。36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中收集所述不溶性团块还包括：a.以10:1尿素体积与沉淀质量的比率将所述细胞沉淀与包含4m尿素的溶液一起温育；以及b.离心所述包含4m尿素的溶液以获得第二细胞沉淀，之后在包含溶剂的所述水性溶液中温育所述第二细胞沉淀。37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其还包括从所述水性溶液分离所述重组蜘蛛丝蛋白，从而产生分离的重组蜘蛛丝蛋白。38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述重组蜘蛛丝蛋白是高度结晶的丝蛋白、高β折叠含量丝蛋白或低溶解度丝蛋白。39.如权利要求38所述的方法，其中所述重组蜘蛛丝蛋白包括如seq id no:23中所示的差异妩蛛misp蛋白。40.如权利要求38所述的方法，其中所述重组蜘蛛丝蛋白在非离液溶剂中的溶解度阈值低于90％、80％、70％、60％或50％。41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物包含真菌、细菌或酵母细胞。42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用elisa测量分离的重组蜘蛛丝蛋白的量。44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中使用尺寸排阻色谱法测量分离的重组蜘蛛丝蛋白的量。45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述分离的重组蜘蛛丝蛋白是全长重组蜘蛛丝蛋白。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述分离的重组蜘蛛丝蛋白包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％全长重组蜘蛛丝蛋白。47.如权利要求45所述的方法，其中使用elisa测量全长重组蜘蛛丝蛋白的量。48.如权利要求45所述的方法，其中使用尺寸排阻色谱法测量全长重组蜘蛛丝蛋白的量。49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述分离的重组蜘蛛丝蛋白的纯度是5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、09-95％或95-100％。50.一种从宿主细胞分离重组蜘蛛丝蛋白的方法，其包括：a.提供包含重组蜘蛛丝蛋白的不溶性团块；b.将所述不溶性团块添加到包含溶剂的水性溶液中，其中所述水性溶液以最终10m尿素浓度包含15％(重量/体积)不溶性部分；c.通过微流体化向包含所述不溶性团块的所述水性溶液施加剪切力，从而使所述重组蜘蛛丝蛋白溶解在所述水性溶液中；以及d.从所述水性溶液分离所述重组蜘蛛丝蛋白，从而产生分离的重组蜘蛛丝蛋白。51.一种从宿主细胞分离重组蜘蛛丝蛋白的方法，其包括：a.提供包含重组蜘蛛丝蛋白的不溶性团块；b.将所述不溶性团块添加到水性溶液中，其中所述水性溶液以最终10m尿素浓度包含约15％(重量/体积)不溶性部分；c.通过微流体化向所述水性溶液施加剪切力，从而使所述重组蜘蛛丝蛋白溶解在所述水性溶液中，其中所述剪切力是约10
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；以及d.从所述水性溶液分离所述重组蜘蛛丝蛋白，从而产生分离的重组蜘蛛丝蛋白。52.一种组合物，其包含通过如权利要求1-51中任一项所述的方法产生的重组蜘蛛丝蛋白。53.如权利要求52所述的组合物，其中所述重组蜘蛛丝包含至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％全长重组蜘蛛丝。54.一种丝纤维，其包含通过权利要求1-53中任一项所述的方法产生的重组蜘蛛丝蛋白。

技术总结
本公开涉及通过应用溶剂和高剪切微流体化方法来分离和纯化合成嵌段共聚物蛋白的方法。法。法。


技术研发人员：R
受保护的技术使用者：保尔特纺织品公司
技术研发日：2020.09.16
技术公布日：2022/4/1