1.本发明涉及的领域是基于脂质纳米囊的药物递送系统及其在治疗glp-1相关病症中的用途。
背景技术：
：：2.开发能够使治疗性肽被吸收至体循环中的口服剂型是制药业面临的最大挑战之一。所选择的糖尿病肽已进入开发后期，但它们的口服生物利用度低(估计在0.5-1.0％之间)。然而，口服递送肽相比静脉内或皮下施用的益处显著，尤其是在抗糖尿病药物例如胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，glp-1)的情况下。肠降血糖素拟似肽的口服施用具有额外的治疗优势，即拟似了天然肽的常规生理途径。glp-1激动剂靶向肝门静脉区，其通过肝门静脉的可及浓度高于皮下递送，由此减少了全身暴露及其相关副作用。尽管正在进行大量努力开发口服途径施用的肠降血糖素拟似肽，但目前市场上仅有一种口服施用的glp-1拟似物(索马鲁肽(semaglutide)，由novonordisk开发)，其需要共同施用功能性辅料即n-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(sodiumn-[8-(2-hydroxybenzoyl)amino]caprylate，snac)。[0003]肠道生理学提供了一个刺激环境，但在药物递送领域尚未充分发挥其全部潜力。胃肠上皮散布有各种各样的细胞。其中，肠内分泌l细胞因其分泌肽(例如，glp-1和glp-2)的多效性而引起了特别的注意。这些细胞具有5-7天的相对快速的更新，并且它们的密度在病理条件如2型糖尿病(type2diabetesmellitus，t2dm)和炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)下增加，使它们成为治疗这些疾病的有吸引力的靶标。在t2dm的情况下，肠道l细胞分泌的glp-1刺激餐后胰岛素分泌，并被二肽基肽酶-iv(dipeptidylpeptidase-iv，dpp-iv)迅速水解。因此，已经开发出数种具有改善的血浆半衰期的glp-1拟似物(例如，艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、索马鲁肽(semaglutide))，它们已被证明可成功治疗t2dm。目前，研究人员已将注意力从分泌肽转移至l细胞本身作为治疗肥胖症、t2dm和ibd的靶标。事实上，增强内源性glp-1分泌代表了基于肠降血糖素的糖尿病治疗中更具生理性和新颖性的替代方案(burant,diabetescare.2013；36suppl2,s175-179)。尽管在肠腔中发现的某些内源性配体，例如包括丁酸酯和丙酸酯在内的短链脂肪酸可以激活l细胞，但纳米载体(nanocarrier)的使用可以代表一种刺激肠道肽产生的替代治疗策略。事实上，可以将纳米载体工程化以拟似某些配体，并且可以将其设计为具有增加的胃肠道停留，从而引起l细胞的长期激活。[0004]目前的口服肽递送策略仅将递送系统用作媒介物(vehicle)。没有一种策略利用载体(carrier)本身的生理特性来实现制剂的最大治疗潜力。[0005]发明人开发了一种通过口服途径使用肠降血糖素拟似物的前所未有的方法，来治疗和/或预防与功能失调性糖血病相关的代谢病症。事实上，他们提供的证据表明，纳米载体与glp-1拟似物的组合足以使肥胖/糖尿病小鼠在急性或慢性治疗后的血糖正常化。本发明的基于脂质纳米囊的药物递送系统使自身的生物学作用(刺激glp-1释放)和所包封的生物活性分子(肠降血糖素拟似物)的生物学作用协同。有趣的是，除了使用口服途径的强大优势外，这种方法至少与目前上市的药物一样有效，甚至可以更有效地改善口服葡萄糖耐受、胰岛素抵抗、脂质分布和肝脂肪变性。因此，此种策略提供了优于目前的口服肠降血糖素拟似肽递送方法的额外优势，产生了增加的内源性glp-1水平。技术实现要素：[0006]本发明涉及一种用于口服施用的脂质纳米囊，其包含：[0007]-固体脂质外壳(outershell)；和[0008]-亲脂性液体内核(innercore)，其包含装载有一种或多种肠降血糖素(incretin)拟似物(mimetics)的反胶束。[0009]在一个实施方案中，固体脂质外壳包含一种或多种选自包含以下的组的表面活性剂：离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。[0010]在一个实施方案中，亲脂性液体内核包含一种或多种油。在一个实施方案中，所述一种或多种油是甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯或其混合物。[0011]在一个实施方案中，反胶束包含一种或多种选自包含表面活性剂、油及其混合物的组的组分。[0012]在一个实施方案中，脂质纳米囊的平均直径范围为约100nm至约300nm。[0013]在一个实施方案中，脂质纳米囊在体内诱导内源性glp-1分泌。[0014]在一个实施方案中，所述一种或多种肠降血糖素拟似物选自包含阿必鲁肽(albiglutide)、度拉糖肽(dulaglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利西拉肽(lixisenatide)和索马鲁肽(semaglutide)的组。在一个实施方案中，所述一种或多种肠降血糖素拟似物是艾塞那肽。[0015]在一个实施方案中，纳米囊包含：[0016]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯、非离子性亲脂性表面活性剂和任选的聚乙二醇化脂质，尤其是聚乙二醇化磷脂；和[0017]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0018]在一个实施方案中，脂质纳米囊包含：[0019]-固体脂质外壳，其包含表面活性剂hs15、s100和任选的dspe-peg2000-och3；和[0020]-亲脂性液体内核，其包含油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0021]在一个实施方案中，艾塞那肽具有的药代动力学谱特征在于在高脂肪饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠中至少4％的相对生物利用度。[0022]本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含：[0023]-治疗有效量的用于口服施用的脂质纳米囊，其包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束，和[0024]-药学上可接受的媒介物。[0025]本发明还涉及一种药物，其包含治疗有效量的用于口服施用的脂质纳米囊，所述脂质纳米囊包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束。[0026]本发明进一步涉及一种脂质纳米囊，其包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束，用于在有此需要的受试者中治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症。[0027]在一个实施方案中，病症选自包含以下的组：2型糖尿病(type2diabetesmellitus，t2dm)、肥胖症、炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)、胰腺炎、血脂异常(dyslipidemia)、非酒精性脂肪性肝病、高血糖症、肝脂肪变性(liversteatosis)、超重、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、前期糖尿病(prediabetes)、空腹血糖受损(impairedfastingglucose)、食欲过盛(hyperphagia)、食物摄入行为改变、肝脏胰岛素抵抗、全身胰岛素抵抗、加速转运(acceleratedtransit)、脂肪组织炎症、心脏功能障碍、急性心肌梗塞、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变和胃轻瘫(gastroparesis)。在一个实施方案中，所述病症选自包含2型糖尿病(t2dm)、肥胖症和炎性肠病(ibd)的组。[0028]本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症的试剂盒，其包含：[0029]-一种或多种脂质纳米囊，其包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束；和[0030]-一种或多种口服降血糖剂。[0031]定义[0032]在本发明中，下列术语具有以下含义：[0033]-数值前面的“约(about)”意指所述值的加或减10％。应理解，术语“约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。[0034]‑“包含(comprise)”旨在意指“含有(contain)”、“涵盖(encompass)”和“包括(include)”。在一些实施方案中，术语“包含”还涵盖术语“由……组成(consistof)”。[0035]‑“药学上可接受的赋形剂(pharmaceuticallyacceptableexcipient)”是指当施用给动物，优选人类时不产生有害的、过敏的或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。对于人类施用，制备物应符合fda生物制品办公室标准所要求的无菌、一般安全和纯度标准。[0036]‑“受试者(subject)”是指哺乳动物，优选人类。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。在一个实施方案中，受试者可以是“患者(patient)”，即温血动物，更优选是人类，他/它正在等待接受或正在接受医疗护理或曾经/现在/将是医疗程序的对象，或被监测glp-1相关病症的发展。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如18岁以下的受试者)。[0037]‑“治疗有效量(therapeuticallyeffectiveamount)”意指在不对靶标造成显著负面或不利副作用的情况下目的在于以下的药剂的水平或量：(1)延迟或预防glp-1相关病症的发作；(2)减缓或停止glp-1相关病症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)导致glp-1相关病症的症状的改善；(4)降低glp-1相关病症的严重程度或发生率；或(5)预防glp-1相关病症。在一个实施方案中，为了预防或防止作用，在glp-1相关病症发作之前施用治疗有效量。在另一个实施方案中，为了治疗作用，在glp-1相关病症发作后施用治疗有效量。[0038]‑“治疗(treatment)”是指治疗性治疗(therapeutictreatment)和预防性或防止性措施(prophylacticorpreventativemeans)，其中目的是预防或减缓(减轻)glp-1相关病症。需要治疗的那些包括已经患有所述病症的那些以及易于患有所述病症的那些或需要预防所述病症的那些。如果在接受治疗量的本发明的脂质纳米囊后，受试者或哺乳动物表现出一种或多种以下可观察和/或可测量的变化，则所述受试者或哺乳动物被成功“治疗”：涉及一个或多个与glp-1相关病症相关的症状的改善、发病率和死亡率的降低以及生活质量问题的改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以通过医师熟悉的常规程序容易地测量。具体实施方式[0039]本发明人配制了用于口服施用的装载有肠降血糖素拟似物的脂质纳米囊，用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症如2型糖尿病(t2dm)、肥胖症的目的。本发明的纳米囊在结构上明显不同于例如us2017087096和wo2018157202公开的基于脂质的制剂，shresthaetal.(nanoscale.2018；10:603-613)和beloquietal.(molpharm.2016；13:4222-4230)公开的纳米颗粒。此外，如本文公开的比较研究所证明的(参见比较例3)，来自现有技术的这些纳米颗粒在进一步的体内研究中不能诱导glp-1分泌，也不能降低高血糖症和高胰岛素血症，而本发明的纳米囊可以。此外，本发明的聚乙二醇化纳米囊进一步改善了肠降血糖素拟似物的半衰期及其全身吸收。[0040]本发明涉及一种用于口服施用的脂质纳米囊，其包含：[0041]-固体脂质外壳；和[0042]-亲脂性液体内核，其包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束。[0043]在一些实施方案中，用于制备本发明的脂质纳米囊的组分属于“公认安全”(generallyrecognizedassafe，gras)的组分列表。[0044]如本文所用，术语“纳米囊(nanocapsule)”和“纳米颗粒(nanoparticle)”可以彼此替换。[0045]根据第一个实施方案，本发明的脂质纳米囊的固体脂质外壳包含一种或多种(或至少一种)表面活性剂。[0046]在一个实施方案中，所述一种或多种表面活性剂是聚乙二醇化的。[0047]在一个实施方案中，至少一种表面活性剂的亲水亲脂平衡(hydrophilic-lipophilicbalance，hlb)范围为约4至约40，优选约6至约16，更优选约10至约14。[0048]hlb值由c.larpent在editionstechniquesdel'ingénieur的traiték.342中定义。[0049]在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂为离子、非离子或两性的表面活性剂。在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂选自包含乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化脂肪酸的部分甘油酯和聚乙氧基化脂肪酸甘油三酯及其混合物的组。在一个具体的实施方案中，所述至少一种表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂，是脂肪酸的聚氧乙烯酯，优选hs15(也称为hs15)。[0050]乙氧基化脂肪醇的示例包括但不限于环氧乙烷与月桂醇的加合物，尤其是包含9至50个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的laureth-9至laureth-50)；环氧乙烷与山萮醇的加合物，尤其是包含9-50个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的beheneth-9至beheneth-50)；环氧乙烷与鲸蜡硬脂醇(鲸蜡醇和硬脂醇的混合物)的加合物，尤其是包含9-30个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的ceteareth-9至ceteareth-30)；环氧乙烷与鲸蜡醇的加合物，尤其是含有9-30个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的ceteth-9至ceteth-30)；环氧乙烷与硬脂醇的加合物，尤其是含有9-30个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的steareth-9至ceteareth-30)；环氧乙烷与异硬脂醇的加合物，尤其是含有9-50个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的isosteareth-9至isosteareth-50)；及其混合物。[0051]乙氧基化脂肪酸的示例包括但不限于环氧乙烷与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或山萮酸的加合物及其混合物，尤其是包含9至50个氧乙烯基团的那些，例如peg-9至peg-50月桂酸酯(ctfa命名：peg-9月桂酸酯至peg-50月桂酸酯)；peg-9至peg-50棕榈酸酯(ctfa命名：peg-9棕榈酸酯至peg-50棕榈酸酯)；peg-9至peg-50硬脂酸酯(ctfa命名：peg-9硬脂酸酯至peg-50硬脂酸酯)；peg-9至peg-50棕榈硬脂酸酯；peg-9至peg-50山萮酸酯(ctfa命名：peg-9山萮酸酯至peg-50山萮酸酯)；及其混合物。[0052]在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂是热敏性的亲水性的非离子表面活性剂。[0053]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的固体脂质外壳进一步包含至少一种亲脂性表面活性剂。[0054]在一个实施方案中，所述至少一种亲脂性表面活性剂是磷脂。在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂选自包含磷脂酰胆碱(也称为卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的组。亲脂性表面活性剂的示例包括但不限于lipoids45、lipoids75-3、lipoids100、lipoidgpc、lipoide80、脱水山梨糖醇油酸酯(span80)、epikurontm135和在一个具体的实施方案中，亲脂性表面活性剂是lipoids100和/或脱水山梨糖醇油酸酯(span80)。[0055]在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂，尤其是亲脂性表面活性剂，更尤其是脂质，更尤其是磷脂，是聚乙二醇化脂质，更尤其是聚乙二醇化磷脂。聚乙二醇化磷脂的示例包括但不限于dppe-pegx(其中dppe代表二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)、dspe-pegx(其中dspe代表二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、dope-pegx(其中dope代表二油酰基磷脂酰乙醇胺)和pope-pegx(其中pope代表棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺)，其中x代表peg分子的大小，单位为g/mol。在一些实施方案中，x包含约400至约20,000，优选约800至约5,000，更优选约1,000至约3,000。如本文所用，约400至约20,000包括约400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000和20,000。[0056]在一个实施方案中，x是1,000、2,000、3,000、4,000或5,000。在一个实施方案中，x是6,000、7,000、8,000或9,000。在一个实施方案中，x是10,000。[0057]如本文所用，术语“peg”是指通式(i)的聚乙二醇化合物，如现有技术中普遍接受的：[0058]h-[o-ch2-ch2]x-r(i)，[0059]其中x包含约400至约20,000(代表peg分子的大小，单位为g/mol)并且其中r代表-oh、-o(c1-c12)烷氧基、-(c1-c12)羧基、-nh2。[0060]在一个实施方案中，r代表-o(c1-c6)烷氧基，包括-och3(甲氧基)、-oc2h5、-oc3h7、-oc4h9、-oc5h11、-oc6h13及其异构体。在一个实施方案中，r代表-(c1-c6)羧基，包括-cooh(甲酸)，-ch2-cooh(乙酸)、-c2h4-cooh(丙酸)、-c3h6-cooh(丁酸)、-c4h8-cooh(戊酸)、-c5h10-cooh(己酸)及其异构体。[0061]在一个实施方案中，聚乙二醇化磷脂是dspe-peg2000-och3(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚(乙二醇)2000)，其是包含式(i)的peg的dspe-peg，其中x是2,000，r是-och3。[0062]在一个实施方案中，聚乙二醇化磷脂是dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[聚(乙二醇)-2000]-丙酸酯)，其是包含式(i)的peg的dspe-peg，其中x是2,000，r是丙酸。[0063]在实践中，聚乙二醇化磷脂提供了增强的粘液扩散(mucusdiffusion)、增加的稳定性和延长的血液循环。增加的粘液穿透(mucopenetration)可以有助于增加纳米囊与l细胞表面的接触。在实践中，聚乙二醇化磷脂可以从例如或nanosoft商购获得。[0064]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种选自包含非离子表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物的组的组分。[0065]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种选自包含热敏性亲水性非离子表面活性剂、磷脂及其混合物的组的组分。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的固体脂质外壳包含热敏性亲水性非离子表面活性剂和磷脂。[0066]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种表面活性剂，优选s100和/或hs15，其总量范围为相对于脂质纳米囊总重量的约1％至40％(按重量计)，优选约3％至约25％(按重量计)，更优选约5％至约15％(按重量计)。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种表面活性剂，优选s100和/或hs15，其总量为相对于脂质纳米囊总重量的约6.45％(按重量计)。[0067]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种表面活性剂，优选s100和/或hs15和/或dspe-peg2000-och3或dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh，其总量范围为相对于脂质纳米囊总重量的约1％至40％(按重量计)，优选约0.5％至约25％(按重量计)，更优选约1％至约10％(按重量计)。[0068]在本发明的范围内，表述“约0.1％至约40％(按重量计)”涵盖0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％和40％(按重量计)。[0069]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种非离子表面活性剂，优选hs15，和一种或多种亲脂性表面活性剂，优选s100和/或聚乙二醇化磷脂。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种非离子表面活性剂，优选hs15，和2种亲脂性表面活性剂，优选s100和聚乙二醇化磷脂。[0070]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的亲脂性液体内核包含一种或多种油。[0071]在一个实施方案中，油是至少一种甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯或其混合物。[0072]在一个实施方案中，脂肪酸选自饱和或不饱和c8至c26脂肪酸及其混合物。在一个实施方案中，不饱和脂肪酸可以是单不饱和或多不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，脂肪酸是多不饱和的，尤其是选自omega-3脂肪酸的组，该组包含α-亚麻酸(18:3，ala)、二十碳五烯酸(20:5，epa)和二十二碳六烯酸(22:6，dha)。在实践中，omega-3脂肪酸的来源可以是鱼油。[0073]在一个实施方案中，脂肪酸酯选自c8至c18，优选c8至c12脂肪酸酯。在一个具体的实施方案中，脂肪酸酯选自包含以下或由以下组成的组：乙基棕榈酸酯、乙基油酸酯、乙基肉豆蔻酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯及其混合物。[0074]在一个实施方案中，甘油三酯是合成的甘油三酯或天然来源的甘油三酯。甘油三酯的天然来源包括但不限于动物脂肪或植物油如大豆油，或长链甘油三酯(lct)的来源。[0075]在另一个实施方案中，甘油三酯包含中等长度的脂肪酸，也称为中链甘油三酯(medium-chaintriglyceride，mct)。中链甘油三酯(mct)油是其中的烃链含有8至12个碳原子的甘油三酯。[0076]mct油的示例包括但不限于tcr产品(甘油三酯混合物的商业命名，其中约95％的脂肪酸链含有8或10个碳原子，来自法国sociétéindustrielledesoléagineux)和812(由瑞典dynamitnobel公司出售的甘油三酯，是辛酸和癸酸甘油酯三酯的混合物)。[0077]在一个实施方案中，甘油三酯的脂肪酸单元是不饱和的，单不饱和的或多不饱和的。在一个实施方案中，亲脂性液体内核包含含有不同脂肪酸单元的甘油三酯的混合物。[0078]在一个实施方案中，油选自包含以下的组：甘油，甘油脂肪酸单甘油酯、脂肪酸甘油三酯，亚油酸和/或油酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，辛酸甘油三酯，癸酸甘油三酯，辛酸和/或癸酸的丙二醇酯，植物脂肪酸的甘油三酯，及其混合物。[0079]可包含在亲脂内核中的油的示例包括但不限于labrafactmlipophilewl1349(辛酸和癸酸的中链甘油三酯)、labrafactmpg(辛酸和癸酸的丙二醇酯)、cc497(聚甘油-6二油酸酯)、peceoltm(甘油单油酸酯)、cc(主要是亚油酸和油酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和810/812(辛酸和癸酸的甘油三酯)。在一个具体的实施方案中，亲脂内核包含labrafactmlipophilewl1349。在一个具体的实施方案中，亲脂内wl1349。[0091]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的反胶束包含如上文所述的表面活性剂和油。[0092]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊的反胶束包含至少一种肠降血糖素拟似物、80和labrafactmlipophilewl1349，或由其组成。在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊的反胶束包含艾塞那肽、80和labrafactmlipophilewl1349，或由其组成。[0093]在一个实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约5％至约50％(按重量计)，优选约10％至约35％(按重量计)，更优选约15％至约20％(按重量计)的表面活性剂，优选80。在一个具体的实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约16.67％(按重量计)的表面活性剂，优选80。[0094]在本发明的范围内，表述“约5％至约50％(按重量计)”涵盖5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％和50％(按重量计)。[0095]在一个实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约50％至约95％(按重量计)，优选约75％至约90％(按重量计)，更优选约80％至约85％(按重量计)的油，优选labrafactmlipophilewl1349。在一个具体的实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约83.33％(按重量计)的油，优选labrafactmlipophilewl1349。[0096]在本发明的范围内，表述“约50％至约95％(按重量计)”涵盖50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和95％(按重量计)。[0097]在一个实施方案中，反胶束为相对于脂质纳米囊总重量的约0.01％至约40％(按重量计)，优选约1％至约35％(按重量计)，更优选约10％至约25％(按重量计)。[0098]在本发明的范围内，表述“约0.01％至约40％(按重量计)”涵盖0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％和40％(按重量计)。[0099]在一个实施方案中，表面活性剂/油的重量比范围为1:10至1:1。在一个实施方案中，表面活性剂/油的重量比范围为1:8至1:3。在一个实施方案中，表面活性剂/油的重量比为1:5。在本发明的范围内，表述“1:10至1:1”涵盖1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2和1:1。[0100]在一个实施方案中，肠降血糖素拟似物/表面活性剂的重量比范围为0.001至0.2，优选0.005至0.05，更优选0.01至0.03。在一个实施方案中，肠降血糖素拟似物/表面活性剂的重量比为约0.03。在本发明的范围内，表述“0.001至0.2”涵盖0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175和0.2。[0101]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径(meandiameter)是至少约100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190或200nm。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径是至多约200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300nm。[0102]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径范围为约100nm至约300nm，优选约150nm至约250nm，更优选约180nm至约230nm。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径范围为约200nm至约300nm。在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径为约200nm。在实践中，平均直径约200nm以上的脂质纳米囊具有诱导内源性glp-1分泌的能力，并因此具有促进glp-1血液水平增加的能力。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米囊在体内诱导内源性glp-1分泌。在实践中，内源性glp-1的体内分泌可以根据现有技术的任何合适的方法或从其改编的方法来测量。作为示例，可以通过elisa试剂盒的方式如商业的totalglp-1elisa试剂盒(来自mesoscale)测量血液样品，尤其是血浆样品中的glp-1水平。内源性glp-1分泌可以表示为与治疗前获得的参考值相比的倍数变化。[0103]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的肠降血糖素拟似物选自包括艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽、利西拉肽和索马鲁肽的组。[0104]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊至少包含艾塞那肽。[0105]在一个实施方案中，艾塞那肽具有的药代动力学谱的特征在于在高脂肪饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠中至少4％的相对生物利用度。[0106]在本发明的范围内，表述“至少4％”包括4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％或更多。[0107]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0108]-固体脂质外壳；和[0109]-亲脂性液体内核，其包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0110]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0111]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯和亲脂性表面活性剂；和[0112]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0113]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0114]-固体脂质外壳，其包含表面活性剂hs15和s100；和[0115]-亲脂性液体内核，其包含油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0116]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0117]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15和s100组成；和[0118]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm、氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0119]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0120]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯、非离子亲脂性表面活性剂和任选的聚乙二醇化脂质，尤其是聚乙二醇化磷脂；和[0121]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0122]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0123]-固体脂质外壳，其包含表面活性剂hs15、s100和任选的dspe-peg2000-och3；和[0124]-亲脂性液体内核，其包含油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0125]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0126]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15、s100和任选的dspe-peg2000-och3组成；和[0127]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm、氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0128]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0129]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯、非离子亲脂性表面活性剂和聚乙二醇化脂质，尤其是聚乙二醇化磷脂；和[0130]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0131]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0132]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15、s100和dspe-peg2000-och3组成；和[0133]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0134]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0135]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15、s100和dspe-peg2000-ch2ch2cooh组成；和[0136]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0137]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊在两个步骤中制备。在一个实施方案中，用于制备本发明的脂质纳米囊的方法包括以下步骤：[0138]1.将一种或多种肠降血糖素拟似物包封在反胶束内，和[0139]2.将反胶束包封在脂质纳米囊内。[0140]在第一步骤结束时，获得装载有肠降血糖素拟似物的反胶束。在第二步结束时，获得装载有肠降血糖素拟似物的反胶束脂质纳米囊。[0141]在一个实施方案中，第一步骤包括高速搅拌一种或多种选自包含表面活性剂、油及其混合物(优选表面活性剂和油)的组的组分(步骤1a)。[0142]在一个实施方案中，第一步骤进一步包括将一种或多种肠降血糖素拟似物(优选艾塞那肽)滴入一种或多种组分的混合物，优选上述表面活性剂和油的混合物中(步骤1b)。[0143]在一个实施方案中，第二步骤包括相转化过程，其中将脂质纳米囊的组分在磁搅拌下混合在一起(步骤2a)。在一个实施方案中，脂质纳米囊的组分包含如上文所述的固体脂质外壳和亲脂性液体内核的组分。在一个实施方案中，脂质纳米囊的组分包含油、表面活性剂、盐和水。在一个实施方案中，这个步骤在30℃至50℃，优选35℃至45℃，更优选约40℃的温度下进行。在一个实施方案中，这个步骤在100rpm至1000rpm，优选200rpm的速度下进行。在一个实施方案中，进行这个步骤至少1分钟、2分钟或5分钟。[0144]在一个实施方案中，第二步骤进一步包括渐进式加热/冷却温度循环(步骤2b)。在一个实施方案中，温度循环在40℃至85℃，优选45℃至75℃，更优选50℃至68℃的温度范围内进行。在一个实施方案中，在温度循环的最后一个循环期间，将步骤1中获得的包含肠降血糖素拟似物的反胶束添加到步骤2b中获得的混合物中(步骤2c)。在一个实施方案中，在比相转化区(phaseinversionzone，piz)高约3℃的温度下进行步骤2c。在一个实施方案中，在约58℃至约70℃，优选约60℃至约68℃，更优选约62℃至约64.5℃的温度范围内进行步骤2c。在一个实施方案中，在最后一个温度循环中温度冷却至piz后，将冷水(0℃至5℃之间，优选约4℃)添加到在步骤2c结束时获得的混合物中(步骤2d)。在一个实施方案中，在步骤2d结束时，混合物的温度为约57℃至约63℃，优选约58℃至约62℃，更优选约59.5℃至约61.5℃。[0145]在一个实施方案中，用于制备本发明的脂质纳米囊的方法不包括使用任何有机溶剂。换句话说，所述方法是用于制备本发明的脂质纳米囊的无有机溶剂的方法。[0146]在一个实施方案中，可以将本发明的脂质纳米囊冻干，并且然后以胶体悬浮液的形式重配。在一个实施方案中，可以将渗透剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、防腐剂或其混合物添加到待冻干的脂质纳米囊的悬浮液中。在一个实施方案中，在这些化合物完全溶解后，悬浮液可经历在约-50℃下的快速冷冻的第一步骤。在一个实施方案中，这些悬浮液随后可通过在减压下在低温以蒸汽形式直接穿过水来进行冻干。在一个实施方案中，干燥形式的脂质纳米囊可在使用前以无菌形式长期储存。[0147]本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上文所述的脂质纳米囊和药学上可接受的媒介物。[0148]本发明进一步涉及如上文所述的脂质纳米囊或药物组合物，用作药物。[0149]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊用于制备药物。本发明的目的是本发明的脂质纳米囊用于制备药物的用途。[0150]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症。[0151]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物用于治疗和/或预防选自包含以下的组的病症：2型糖尿病(t2dm)、肥胖症、炎性肠病(ibd)、胰腺炎、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病、高血糖症、肝脂肪变性、超重、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、前期糖尿病、空腹血糖受损、食欲过盛、食物摄入行为改变、肝脏胰岛素抵抗、全身胰岛素抵抗、加速转运、脂肪组织炎症、心脏功能障碍、急性心肌梗塞、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变和胃轻瘫。[0152]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物用于治疗和/或预防2型糖尿病(t2dm)、肥胖症或炎性肠病(ibd)。[0153]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊具有显著降低肝脏重量、肝脏脂质积累以及脂滴的数量和大小的优势。[0154]本发明还涉及一种治疗和/或预防有此需要的受试者中与glp-1功能障碍相关的病症的方法，包括向所述受试者口服施用本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0155]在一个实施方案中，所述方法用于治疗和/或预防选自包含以下的组的病症：2型糖尿病(t2dm)、肥胖症、炎性肠病(ibd)、胰腺炎、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病、高血糖症、肝脂肪变性、超重、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、前期糖尿病、空腹血糖受损、食欲过盛、食物摄入行为改变、肝脏胰岛素抵抗、全身胰岛素抵抗、加速转运、脂肪组织炎症、心脏功能障碍、急性心肌梗塞、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变和胃轻瘫。[0156]本发明的另一个目的是一种提高有此需要的个体的glp-1血液水平的体内方法，包括向所述个体口服施用治疗有效量的本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0157]本发明的另一个目的是一种降低有此需要的个体的血糖水平的体内方法，包括向所述个体口服施用治疗有效量的本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0158]应当理解，本发明的脂质纳米囊、药物组合物和药物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体药剂的活性；所采用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体药剂的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所采用的具体药剂组合使用或同时使用的药物；以及医学领域中公知的类似因素。例如，药剂的剂量以低于达到所需治疗效果所需的水平开始并逐渐增加剂量直至达到所需效果，这完全在本领域技术范围内的。[0159]然而，产品的每日剂量可在大范围内变化，从约0.01至约1000mg/成人/天，优选0.1至约500，更优选约1至约200mg/成人/天。在一个实施方案中，以约0.1mg至约20mg/成人/天的剂量施用本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0160]有效量的脂质纳米囊通常以每天0.1mg/kg至约1000mg/kg体重的剂量水平来供应。[0161]在一个实施方案中，有效量的脂质纳米囊可每天施用一次、两次或三次。[0162]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物通过口服施用或适应于口服施用。[0163]本发明还涉及一种用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症的试剂盒，其包含：[0164]-一种或多种本发明的脂质纳米囊；和[0165]-一种或多种口服降血糖剂。[0166]在一个实施方案中，口服降血糖剂选自包含以下的组：α-葡萄糖苷酶抑制剂，优选阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)或伏格列波糖(voglibose)；双胍(biguanide)，优选二甲双胍(metformin)；塞克洛瑟(cycloset)，优选溴隐亭(bromocriptine)；dpp-4抑制剂，优选西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、利格列汀(linagliptin)或阿格列汀(alogliptin)；美格列奈(meglitinide)，优选瑞格列奈(repaglinide)或那格列奈(nateglinide)；sglt2抑制剂，优选达格列嗪(dapagliflozin)或坎格列嗪(canagliflozin)；磺酰脲(sulfonylurea)，优选格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、格列齐特(gliclazide)或格列美脲(glimepiride)；噻唑烷二酮(thiazolidinedione)，优选罗格列酮(rosiglitazone)或吡格列酮(pioglitazone)。[0167]本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症的药物递送系统，其包含：[0168]-一种或多种本发明的脂质纳米囊；和[0169]-一种或多种口服降血糖剂。附图说明[0170]图1a-1f是直方图和曲线图的组合，显示了仿生肠液中脂质纳米囊的稳定性和艾塞那肽的释放。图1a显示了装载有艾塞那肽的反胶束(rm)脂质纳米囊(exermlnc)以预定时间间隔在在胃蛋白酶存在下在fassgf中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1b显示了exermlnc以预定时间间隔在胃蛋白酶不存在下在fassgf中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1c显示了exermlnc以预定时间间隔在fassif中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1d显示了exermlnc以预定时间间隔在fessif中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1e显示了exermlnc以预定时间间隔在fessif-v2中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。exermlnc的颗粒大小在任何情况下均没有显著改变(p》0.05)，并且在测定介质中表现出单分散性(pdi《0.2)。图1f显示了在37℃下在fassif(ph6.5)中6小时的累积艾塞那肽释放图谱，通过hplc测量(平均值±sem；n＝9)。[0171]图2a-2b是显示在体外和正常血糖小鼠体内的rmlnc介导的glp-1分泌的图组合。图2a显示了在2小时共孵育期后glutag(左)和nci-h716(右)细胞(分别为鼠和人l细胞)中rmlnc介导的体外glp-1分泌(2mg/ml)(平均值±sem；n＝6-10)。图2b显示了在rmln口服施用后60和180分钟，正常血糖小鼠的体内总glp-1分泌(平均值±sem；n＝7-8)。图2a和图2b中的p值由学生t检验或曼-惠特尼检验(mann-whitneytest)确定。[0172]图3表示显示正常血糖小鼠中艾塞那肽血浆水平的图。艾塞那肽血液谱是在向血糖正常小鼠口服施用水溶液(exe)或rmlnc内的包封物(exermlnc)(500μg/kg艾塞那肽剂量，对应于约1.62mg/g脂质纳米囊剂量)通过elisa测量的(平均值±sem；n＝4)。根据双向anova和随后的tukey事后检验，具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。[0173]图4a-4d是显示l细胞和肠细胞样细胞的体外细胞毒性研究的直方图组合。图4a显示了在37℃下孵育2小时后exermlnc对caco-2细胞的细胞活力(viability)，以针对药物浓度的细胞活力表示。图4b显示了在37℃下孵育2小时后exermlnc对caco-2细胞的细胞活力，以针对纳米颗粒浓度的细胞活力表示。图4c显示了在与增加的脂质纳米囊浓度(1mg/ml至10mg/ml)共孵育2小时后，rmlnc对glutag细胞的细胞活力。图4d显示了在与增加的脂质纳米囊浓度(1mg/ml至10mg/ml)共孵育2小时后，rmlnc对人nci-h716细胞的细胞活力。数据显示为平均值±sem(n＝9)。虚线对应于80％的活力。数据对应于三个独立实验。[0174]图5表示显示在葡萄糖激发(glucosechallenge)之前30分钟和之后120分钟测量的血浆葡萄糖水平(mg/dl)的图(n＝8-9)。根据双向anova和随后的tukey事后检验，具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。[0175]图6表示显示在葡萄糖激发之前30分钟和之后120分钟测量的曲线下平均面积(auc，mg/dl/min)的直方图(n＝8-9)。[0176]图7表示显示通过将血液葡萄糖auc乘以胰岛素auc来确定的胰岛素抵抗指数的直方图(n＝8-9)。[0177]图8表示显示在皮下施用(exes.c.)(50μg/kg艾塞那肽剂量)和口服施用后溶液中的和rmlnc内的艾塞那肽(分别为exe和exermlnc)(500μg/kg艾塞那肽剂量对应于约1.62mg/g脂质纳米囊剂量)的浓度-时间图谱和auc。数据表示为平均值±sem(n＝8-10)。根据单向anova和随后的tukey事后检验，具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。[0178]图9a-9b是显示在8周龄和10周龄的hfd诱导的糖尿病小鼠中对exermlnc的ogtt评估的图组合。图9a显示了在2g/kg葡萄糖口服激发后在喂食对照饮食和hfd(8周)的小鼠(c57bl6/j小鼠)中测量的血浆葡萄糖水平和auc。图9b显示了在2g/kg葡萄糖口服激发后在喂食对照饮食和hfd(10周)的小鼠(c57bl6/j小鼠)中测量的血浆葡萄糖水平和auc，通过双向anova测定。数据表示为平均值±sem(n＝7-8)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。对于ogtt，通过双向anova来确定p值，对于比较各组之间的auc，通过单向anova和随后的tukey事后检验来确定p值。[0179]图10a-10b是显示exermlnc对肥胖/糖尿病小鼠的葡萄糖稳态的影响的图的组合。图10a显示了处理5周期间(hfd喂养13周)的血浆葡萄糖水平，表示为mg/dl。图10b显示处理5周后(hfd喂养13周)的血浆葡萄糖浓度，表示为mg/dl。数据表示为平均值±sem(n＝10)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过双向anova和随后的tukey事后检验来确定p值。[0180]图11表示显示exermlnc对肥胖/糖尿病小鼠高胰岛素血症的影响的直方图。从门静脉测量胰岛素血浆水平(n＝8-10)。数据表示为平均值±sem。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验(kruskalwallis)和随后的dunn事后检验来确定p值。[0181]图12表示显示exermlnc处理对肝脏重量(g)的影响的直方图。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过单向anova和tukey事后检验来确定p值。[0182]图13a-13c是显示exermlnc处理对脂质稳态的影响的直方图组合。图13a显示了肝脏总脂质含量(mg-1每100mg组织)。图13b显示了肝脏甘油三酯(nmol.mg-1)。图13c显示了肝脏胆固醇(nmol.mg-1)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验来确定p值。[0183]图14a-14e是直方图的组合。图14a显示了exermlnc处理对脾脏重量的影响。图14b显示了exermlnc处理对内脏脂肪组织(visceraladiposetissue，vat)重量的影响。图14c显示了exermlnc处理对皮下脂肪组织(subcutaneousadiposetissue，sat)重量的影响。图14d显示了exermlnc处理对心外膜脂肪组织(epicardialadiposetissue，eat)重量的影响。图14e显示了exermlnc处理对棕色脂肪组织(brownadiposetissue，bat)重量的影响。数据表示为平均值±sem(n＝9-10)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过单向anova和tukey事后检验来确定p值。[0184]图15a-15b是直方图的组合，显示了聚乙二醇化纳米囊(有或没有作为配体植入的丙酸酯)在glutag细胞(小鼠l细胞)和正常血糖小鼠中对glp-1刺激的影响。在与0.5mg/ml至2mg/ml的增加的纳米囊浓度共孵育2小时后，聚乙二醇化rmlnc(有或没有作为配体植入的丙酸酯)在小鼠glutag细胞中对glp-1刺激的影响(平均值±sem；n＝4；n＝3)。描述了每个小图和每个测试浓度，从左至右：培养基、rmlnc、rmlncpeg和rmlncpeg-pro。图15a(a)表示总glp-1水平；图15b(b)表示细胞外总glp-1水平(表示为pg/ml)。[0185]图16是显示在口服强饲后(post-oralgavage)60和180分钟，健康对照小鼠的总glp-1水平的直方图，其中培养基作为对照(黑色条)，rmlnc(深灰色条)、rmlncpeg(浅灰色条)和rmlncpeg-pro(白色条)使用相同的纳米囊剂量(1.62mg/g)(平均值±sem；n＝8)。不同的上标字母代表基于单向anova和随后的tukey事后检验的各组之间的显著差异(*p《0.05)。[0186]图17a-17f是曲线图和直方图的组合，显示了单个口服施用剂量后肥胖/糖尿病小鼠的药理学和药代动力学研究。图17a：在施用葡萄糖之前30分钟和之后120分钟测试了血液葡糖糖值(bloodglucosevalue，mg/dl)和平均auc(mg/dl·min)(n＝7-8)。hfd(黑色菱形)，exe(方形)，exermlnc(倒三角形)，rmlncpeg(三角形)，exermlncpeg(灰色菱形)。图17b：在施用葡萄糖之前30分钟和之后15分钟测量了血浆总glp-1浓度(n＝6-8)。对于条件的顺序，参见图17a的插入图。图17c：ogtt后在肥胖/糖尿病小鼠门静脉中测量的活性glp-1水平(施用制剂后3小时)(n＝6-8)。图17d：在口服施用葡萄糖之前30分钟和之后15分钟从尾静脉血液收集的血浆中，测量胰岛素浓度(n＝6-8)。对于条件的顺序，参见图17a或图17c的插入图。图17e：胰岛素抵抗指数(n＝7-8)。图17f：在口服施用药物溶液或装载有药物的聚乙二醇化纳米囊(分别为exe和exermlncpeg)(剂量：500μg/kg)后，糖尿病小鼠(hfd喂养10周)的血浆艾塞那肽浓度-时间图谱和艾塞那肽auc(n＝9-10)。数据显示为平均值±sem。不同的上标字母表示各组之间的显著差异(*p《0.05)，利用双向方差分析(anova)和tukey事后检验(图17a、f)、克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验(图17b)或单向anova和随后的tukey事后检验(图17c-e)[0187]图18a-18c是显示不同口服施用频率的聚乙二醇化和非聚乙二醇化的装载有exe的脂质纳米囊通过长期治疗对hfd饮食诱导的糖尿病小鼠的高血糖症和高胰岛素血症的影响的图组合。图18a：施用4周后的血浆葡萄糖值(mg/dl)(hfd喂养总共14周)(平均值±sem；n＝7-10)。图18b：在来自尾静脉取回的血液的血浆中测试胰岛素浓度(平均值±sem；n＝6-9)。图18c：使用公式[空腹血糖(mg/dl)x空腹胰岛素(ng/ml)]/405来计算homa-ir(平均值±sem；n＝8-9)，如之前amrutkaretal.(diabetes.2015；64:2791-2804)所定义。不同的上标字母表示各组之间的统计学显著差异(*p《0.05)，基于双向方差分析和随后的tukey事后检验(图18a)，或克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验(图18b-c)。[0188]图19a-19g是显示通过纳米结构的脂质载体(nlc)，在葡萄糖激发之前30分钟和之elisa试剂盒购自mercodiaab(uppsala，瑞典)。获自bdbioscience(比利时)。二肽基肽酶iv(dpp-iv)抑制剂购自millipore(st.charles，美国)。还使用了达尔伯克改良伊格尔氏培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem)-glutamax(5.5mm葡萄糖)、洛斯维帕克纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute，rpmi)-1640培养基、青霉素-链霉素(p/s)、胎牛血清(fbs)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、含有乙二胺四乙酸(edta，0.02％)的胰蛋白酶(0.25％)，它们购自thermofisherscientific(invitrogen，比利时)。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级。[0197]1.3–装载有反胶束的脂质纳米囊的制备和表征[0198]装载有反胶束的脂质纳米囊(rmlnc)在两个步骤中配制，在所述步骤中，首先将药物包封在反胶束中，然后进一步包封在lnc中。首先，通过高速搅拌表面活性剂(80)和油(wl1349)混合物(1:5重量比)来制备装载有艾塞那肽的反胶束(exerm)。然后，将50μlexe(30mg/ml，于milliq水中)滴入混合物中并保持搅拌。装载有艾塞那肽的反胶束脂质纳米囊(exermlnc)是按照heurtaultetal.(pharmres.2002；19:875-880)描述的改进的相转化方法来制备的。简言之，将所有组分(如表1所示)，包括亲脂性wl1349、s100、hs15、氯化钠(nacl)和milliq水，在40℃下以200rpm磁力搅拌5分钟来进行混合。[0199]表1：exermlnc的组成[0200][0201]渐进式加热/冷却的温度循环在50℃和67℃之间进行。在最后一个循环期间，在比相转化区(piz；59℃至61.5℃)高约3℃的温度下将500μl预热的装载有药物的rm添加到混合物中。将溶液冷却至相转化区(piz)温度，添加2.5ml冷milliq水(4℃)并高速搅拌2分钟。在不存在艾塞那肽的情况下按照相同的方案制备空白rmlnc。[0202]1.4–艾塞那肽的定量[0203]使用shresthaetal.(nanoscale.2018；10:603-613)先前描述的梯度方法，通过高效液相色谱法(hplc，shimadzu，日本)对包封在rmlnc内的艾塞那肽进行定量。简言之，在室温下使用evoc18柱(2.6μm，150x4.6mm)(phenomenex，美国)和安全保护柱(phenomenex，美国)。水性流动相包含0.05％(v/v)三氟乙酸(tfa)的水溶液，有机流动相由0.05％(v/v)的乙腈溶液组成。建立初始比例为10:90(v/v，水相:有机相)、流速为1ml/min的梯度系统，将其在10分钟内线性改变为90:10(v/v)，并且在下一分钟保持不变。然后，将所述比率在接下来的1.5分钟内线性改变为初始组成，并保持稳定最后一分钟。所使用的注入体积为20μl，所使用的检测波长为220nm。保留时间为5.9min，检测限和定量限分别为1.1±0.4μg/ml和3.3±1.1μg/ml。[0204]1.5–exermlnc的表征[0205]使用zetasizernanozs(malverninstrumentsltd.,worcestershire,uk)通过动态光散射(dls)来测量exermlnc的颗粒大小和多分散性指数(polydispersityindex，pdi)，对其进行表征。使用zetasizernanozs通过激光多普勒测速仪(laserdopplervelocimetry，ldv)来测定zeta电位。针对测量，将5μl脂质纳米囊悬浮液分散在995μl超纯水中。所有测量均一式三份进行。[0206]还基于exermlnc的药物包封效率(ee，％)对其进行表征。为了计算总药物含量，将50μlexermlnc溶解在950μl甲醇中，然后进行强力涡旋。使用离心过滤器(mwco30kda，4000g，4℃，20分钟)(millipore)通过超滤将游离和包封的艾塞那肽分开。使用1:2稀释因子进一步稀释滤液。使用上述hplc方法对滤液中的艾塞那肽和溶于甲醇中的艾塞那肽进行定量。使用以下公式计算ee：[0207]ee(％)＝(艾塞那肽总量-游离艾塞那肽)/(艾塞那肽总量)×100。[0208]1.6–在受刺激的胃肠液中的脂质纳米囊稳定性和药物释放[0209]在五种不同的仿生介质中对exelnc的体外稳定性进行了测试：含和不含胃蛋白酶的禁食状态模拟胃液(fastedstate-simulatedgastricfluid，fassgf)、禁食状态模拟肠液(fastedstate-simulatedintestinalfluid，fassif)、进食状态模拟肠液(fedstate-simulatedintestinalfluid，fessif)和fessif版本2(fessif-v2)(biorelevant.com，uk)。表2中给出了对所用模拟液的组成的详细描述。[0210]表2：仿生肠液的组成[0211]组成fassgffassiffessiffessif-v2牛磺胆酸钠0.08mm3mm15mm10mm卵磷脂0.02mm0.75mm3.75mm2mm甘油单油酸酯‑‑‑5mm油酸钠‑‑‑0.8mm氯化钠34.2mm34.2mm203.18mm126mm无水磷酸二氢钠-28.65mm‑‑氢氧化钠-8.71mm101.02mm82mm乙酸‑‑144.04mm-马来酸‑‑‑55mm胃蛋白酶0.1mg/ml‑‑‑ph1.66.555.8[0212]基于脂质纳米囊的大小和pdi来评估胃和肠道条件对脂质纳米囊稳定性的影响。在37℃下将exermlnc在含和不含胃蛋白酶的fassgf、fassif、fessif和fessif-v2中(含100μl脂质纳米囊的10ml培养基)在温和搅拌下孵育。在预定的时间间隔(对于受刺激的胃液培养基是0、0.5、1和2小时，对于受刺激的肠液培养基和fessif是0、0.5、1、3和6小时)下取样，然后通过dls进行分析。[0213]1.7–体外药物释放研究[0214]分别在不存在胃蛋白酶的fassgf中(2小时)和在fassif培养基中(6小时)来评估exermlnc的药物释放。使用渗析法进行研究。简言之，将1mlexermlnc置于一次性渗析膜(mwco100kda)(g2,microfloat,spectrumlabs,美国)中，并于37℃下在磁力搅拌下引入含有35ml培养基的50mlfalcon管中。在预定时间取样50μl并溶解在950μl甲醇中。如上所述，通过hplc测定艾塞那肽的浓度。[0215]1.8–体外细胞研究[0216]1.8.1–细胞培养[0217]人nci-h716l细胞系获自美国模式培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)(manassas，va)，并使用第15至20代。完全培养基包含洛斯维帕克纪念研究所(rpmi)1640培养基和1％(v/v)青霉素-链霉素(p/s)和10％(v/v)胎牛血清(fbs)。将细胞悬浮在75cm2烧瓶(corning,lowell,ma,usa)中，于37℃下在5％co2/95％空气(v/v)的环境中生长。每隔一天添加一些新鲜培养基。更换培养基后，离心培养物并随后以合适密度重悬。[0218]使用第16代至29代的肠道鼠l细胞系glutag细胞。将细胞于37℃下在5％co2供应下，在补充有10％(v/v)灭活fbs和1％(v/v)p/s的dmemglutamax(5.5mm葡萄糖，完全dmem培养基)中生长。每4-5天使用含有edta(0.02％)的胰蛋白酶(0.25％)将细胞传代。[0219]使用第25至30代的caco-2细胞(克隆-1)。将caco-2细胞系保持在由补充有10％(v/v)hyclonetmfbs、1％(v/v)l-谷氨酰胺、1％(v/v)非必需氨基酸和1％(v/v)p/s的dmem组成的培养基中，37℃，10％co2/95％空气(v/v)。每隔一天更换一次培养基。[0220]1.8.2–细胞毒性研究[0221]基于如前所述使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-(2,5-二苯基溴化四唑)(mtt)比色测定法(beloquietal.,journalofcontrolledrelease.2013；166,115-123)计算的药物和脂质纳米囊浓度，在caco-2细胞中进行exermlnc的体外细胞毒性研究。还在glutag和nci-h716细胞中测试了未装载的rmlnc对细胞活力的影响。将caco-2细胞(每孔5×104个细胞)接种在96孔组织培养板(costarcorningcellbindsurface，美国)中，并允许其粘附过夜。对于glutag和nci-h716的细胞毒性研究，将每孔5×104个细胞接种在包被(10μl/ml培养基)的96孔板上。用预温的pbs缓冲液(x3)洗涤平板后，将药物浓度增加(0.5-10mg/ml)的100μlexermlnc(对应于增加的脂质纳米囊浓度(2-18mg/ml))分散在dmem(不含fbs)中，并与caco-2细胞在37℃下共孵育2小时。将增加的未装载的rmlnc浓度(从1mg/ml至10mg/ml)分散在dmemglutamax或rpmi-1640培养基(不含fbs)中，并分别与glutag或nci-h716细胞在37℃下共孵育2小时。孵育后，用100μl0.5mg/mlmtt替换上清液3h。将紫色甲瓒晶体溶解在200μldmso中，使用multisksanex平板读取器(thermofisherscientific，美国)测定560nm处的吸光度。利用triton-x100的细胞(100％死亡)和利用培养基的细胞(100％存活)分别视为阳性和阴性对照。测试一式三份进行。[0222]1.9–体外glp-1分泌[0223]将glutag和nci-h716细胞(每孔1.8×105个细胞)接种到包被的24孔细胞培养板上并使其粘附24小时。第二天，使用预温的pbs轻柔洗涤平板。然后，将glutag细胞与不含fbs的dmemglutamax或未装载的rm-lnc共孵育。另一方面，将nci-h716细胞与不含fbs的rpmi-1640培养基和未装载的rm-lnc一同孵育。两种培养基均含有最终浓度为50μm的dpp-iv抑制剂(millipore,st.charles,mo,美国)。为了证实脂质纳米囊与之前测试的脂质纳米囊(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)相比的功效，我们使用了2mg/ml的脂质纳米囊浓度。在37℃下孵育2小时后，收集上清液，在4℃下以250g离心5分钟(离心机5804r,eppendorfag,hamburg,德国)，并在-80℃下保存直到进一步分析。细胞收集在具有dpp-iv抑制剂的pbs中。在三次冻融循环和随后在4℃下以250g离心5分钟后获得含有glp-1的细胞提取物。使用totalglp-1elisa试剂盒(mesoscaledelivery，gaithersburg，美国)测定总glp-1浓度。glp-1分泌表示为上清液加上细胞中检测到的glp-1的量。glp-1分泌通过以下公式计算：[0224]glp-1分泌＝c细胞外/(c细胞内 c细胞外)[0225]其中c细胞外是在上清液中测定的glp-1浓度，c细胞内是在细胞中测定的glp-1浓度。[0226]1.10–正常血糖小鼠中的总glp-1分泌[0227]将正常血糖小鼠(c57bl/6j雄性小鼠，20-25g，10周；janvierlaboratories，法国)随机分为两组，每组8只小鼠。实验前，使动物禁食整夜，并可以自由饮水。用空白rmlnc(对应于约1.62mg/g纳米颗粒剂量)处理小鼠。通过口服强饲用等体积的milliq水处理对照小鼠。在口服施用后60和180分钟，从尾静脉端抽取血液样品。在dpp-iv抑制剂的存在下(每ml血液20μl)收集样品，并保存在冰上。研究结束后，立即将血液样品离心(3,000rpm，4℃下10分钟)，并且将血浆在-80℃下保持冷冻直到分析。使用totalglp-1elisa试剂盒对总glp-1水平进行定量(mesoscaledelivery，美国)。总glp-1血浆值表示为与未处理的对照组相比的倍数变化。[0228]1.11–高脂肪饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠的口服葡萄糖耐受测试[0229]将8周龄雄性小鼠每笼5只饲养，并分为5组(每组10只)。适应2周后，在实验前给小鼠喂食高脂肪饮食(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)，d12492i，researchdiets，美国)(hfd和艾塞那肽处理组)或正常饮食(对照，ain93mi，researchdiets，美国)3周、8周或10周，禁食一整晚，然后用口服艾塞那肽溶液(exe，500μg艾塞那肽/kg体重)、装载有艾塞那肽-反胶束的脂质纳米囊(exermlnc，500μg艾塞那肽/kg体重)或装载有未装载的胶束的脂质纳米囊(rmlnc，以与每exermlnc相等的浓度)处理，1小时后用口服强饲葡萄糖激发(challenge)。对照组(对照饮食组和hfd组)用口服强饲相同体积的无菌milliq水处理。1h后，用口服强饲养葡萄糖(2g/kg葡萄糖剂量)激发小鼠。在口服葡萄糖前30分钟(-30分钟)和口服葡萄糖载荷后0、15、30、90和120分钟测量血液葡萄糖(bloodglucose)。用葡萄糖计(accu-check，roche，瑞士)从尾静脉端采集的血液样品中测定血液葡萄糖。在-30分钟和15分钟收集血液样品，使用elisa试剂盒(分别为mesoscaledelivery，美国和mercodia，uppsala，瑞典)检测总glp-1和胰岛素血浆浓度。胰岛素抵抗指数通过相乘口服葡萄糖耐受测试(oralglucosetolerancetest，ogtt)获得的血浆中的血液葡萄糖和胰岛素曲线下面积来确定。[0230]1.12–正常血糖和肥胖/糖尿病小鼠中的药代动力学研究[0231]将8周龄雄性小鼠随机分为三组(每个时间点10只小鼠)，并将其置于受控环境中(室温23±2℃，12小时日光周期)，可以自由获取食物和无菌水。适应两周后，小鼠经历3周的hfd(60％脂肪)。在实验之前，将小鼠禁食整夜，并可以自由饮用无菌milli-q水。艾塞那肽溶液和exermlnc以500μg/kg剂量口服施用。还以50μg/kg剂量皮下施用艾塞那肽。在不同时间点(0、0.5、1、1.5、2、4、6和8小时)，从尾静脉端收集血液样品。然后将血液样品离心(1500g，4℃下10分钟)，并使用elisa试剂盒(ek-070-94，phoenixeuropegmbh，karlsruhe，德国)对艾塞那肽血浆浓度进行定量。艾塞那肽的相对生物利用度(fr％)使用以下公式计算：[0232][0233]使用pksolver分析药代动力学参数(zhangetal.,computmethodsprogramsbiomed.2010；99,306-314)。对于血糖正常小鼠，在每个时间点使用4只小鼠。在相同条件下测量艾塞那肽。[0234]1.13–肥胖/糖尿病小鼠的慢性艾塞那肽长期治疗研究[0235]将8周龄雄性小鼠随机分为7组(每组10只)，并且每笼5只饲养于受控环境中(室温为23℃±2℃、12小时日光周期)，并可以自由获取无菌食物(ain93mi；researchdiet)和无菌水。两周适应期后，小鼠经历8周的hfd(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)，d12492i，researchdiets，美国)(艾塞那肽处理组)或正常周饮食(对照)。在这个阶段之后，在接下来的5周处理期间，每天记录小鼠体重，并每周一次监测血糖。每天下午4点用以下处理小鼠：(i)口服施用在溶液中或将包封在rmlnc内的艾塞那肽(500μg/kg剂量)(exermlnc)或相应浓度的未装载的rmlnc，或(ii)皮下施用艾塞那肽溶液(10μg/kg)或(10μg/kg)(市售艾塞那肽皮下注射)。对照组(健康和hfd)每天用口服等体积的无菌milliq水来处理。在葡萄糖测试之前，每周一次将小鼠禁食6小时。在治疗期结束时，用异氟醚(forene，abbott，england)麻醉动物，并从门静脉和腔静脉采集血液样品。放血后，通过颈椎脱位将小鼠安乐死。精确解剖皮下脂肪组织、肝脏和脾脏，称重，并立即浸入液氮中，然后在-80℃下储存用于进一步分析，或保存在4％多聚甲醛(pfa)中用于组织学分析(肝脏)。通过皮下(sat)、附睾(eat)、内脏脂肪组织(vat)和棕色脂肪组织(bat)的重量(mg)来评估对身体组成和脂肪组织的影响。在外周血和门静脉血中测量与食物摄入和体重有关的葡萄糖和胃肠激素水平，包括总glp-1(elisa试剂盒，mesoscaledelivery，gaithersburg，美国)和胰岛素(超敏胰岛素elisa，mercodia，uppsala，瑞典)。通过油红o染色将肝脏脂肪变性可视化。将肝组织包埋在tissue-tekoptimalcuttingtemperature化合物(sakuraeurope，leiden，荷兰)中，并在冷异戊烷中快速冷冻。将5微米厚的组织切片用油红o染色，用于脂质含量分析。每只小鼠分析五个高倍视野(20x)。使用imagej软件(版本2.0.0-rc-69/1.52i，nationalinstitutesofhealth，bethesda，maryland，美国)对平均液滴面积(meandropletarea)进行定量。通过苏木精和伊红(h&e)染色切片来评估肝脏的整体形态。对于实时定量pcr(qrt-pcr)分析，使用tripure试剂(roche)从组织中分离总rna。通过使用reversetranscriptionsystem试剂盒(promega，madison，wisconsin，美国)反转录1μg总rna，来制备互补dna。使用cfx96实时pcr系统和cfxmanager3.1软件(bio-rad，hercules，california，美国)，根据制造商的说明使用qpcrmastermix(promega，madison，usa)进行实时pcr，用于检测。选择核糖体蛋白l19(rpl19)作为管家基因。所有样品在两个96孔反应平板中一式两份运行，并根据2-δct法分析数据。扩增结束时，通过熔融曲线分析来评估扩增产物的身份和纯度。所靶向的小鼠基因的引物序列如表3所示。[0236]表3：通过rt-qpcr进行基因表达分析的引物序列[0237]seqidno:序列1rpl19正向gaaggtcaaagggaatgtgttca2rpl19反向ccttgtctgccttcagcttgt3f4/80正向tgacaaccagacggcttgtg4f4/80反向gcaggcgaggaaaagatagtgt5cd11c正向acgtcagtacaaggagatgttgga6cd11c反向atcctattgcagaatgcttctttacc7mcp1正向gcagttaacgccccactca8mcp1反向tccagcctactcattgggatca9tnfa正向tcgagtgacaagcctgtagcc10tnfa反向ttgagatccatgccgttgg11fasn正向caggcccctctgttaattgg12fasn反向tccagggataacagcacctt13pparg正向ctgctcaagtatggtgtccatga14pparg反向tgagatgaggactccatctttattca15cpt1a正向agaccgtgaggaactcaaacctat16cpt1a反向tgaagagtcgctcccact[0238]如前所述(everardetal.,natcommun.2019；10,457)，根据改进的folch方法(biolchem.1957；226,497-509)，在用氯仿-甲醇提取后测量总脂质。甘油三酯和胆固醇浓度使用结合酶反应和最终产物的分光光度检测的试剂盒(diasysdiagnosticandsystem,holzheim,德国)进行测量。所有样品一式两份运行。[0239]1.14–统计学分析[0240]使用graphpadprism7程序(ca，美国)进行统计学分析。对于所有分析和每个组，通过使用grubbs检验进行异常检测(outlierdetection)，来支持任何排除。当各组之间的方差显著不同时，在进行分析之前通过对数转换将数值标准化。采用双向或单向anova和随后的tukey事后检验进行多组之间的比较。如果组间的方差即使在标准化后还存在显著差异，则进行非参数检验。结果表示为平均值±平均值的标准误差(sem)。将p《0.05的差异认为是统计学显著的。[0241]2.结果和讨论[0242]2.1–艾塞那肽被成功包封并保存在基于脂质的脂质纳米囊内[0243]最近发现，当大小为约200nm时，基于脂质的脂质纳米囊(lnc)在小鼠中触发体内内源性glp-1分泌(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)。但尚不清楚将lnc的生物学效应与所包封的glp-1类似物的药理学作用协同起来是否可行。因此，作为概念证明，选择glp-1类似物艾塞那肽(exe)作为肠降血糖素拟似物，将其包封在亲水性分子lnc内。为了评估这种可能性，将艾塞那肽包封在脂质纳米囊的液体脂质内核内，并同时保留纳米载体的物理化学特性，这很重要，所述物理化学特性是利用脂质纳米囊本身所观察到的体内生物效应(例如，触发内源性glp-1分泌)的原因(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)。根据相转化方法制备lnc(heurtaultetal.,pharmres.2002；19,875-880)。与之前描述的用于制备lnc的方法(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)相比，将油性内核替换为辛酸/癸酸甘油三酯(wl1349)和油酸的甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯的混合物。这种变化允许将渐进式加热/冷却的温度循环从60℃至90℃降至50℃至67℃，从而使exe能够并入lnc。在将exe包封到lnc中之前，使用包含脱水山梨糖醇油酸酯(80)和辛酸/癸酸甘油三酯混合物(wl1349)的表面活性剂-油组合，将exe捕获在反胶束(rm)中(antonetal.,intjpharm.2010；398,204-209)。然后，在lnc制备方法的最后一个循环期间，将这些exerm并入制剂中。上文表1中描述了制剂的最终组成，表4中详细说明了物理化学表征。[0244]表4：装载有exe和未装载exe的rmlnc的物理化学表征(n＝9)[0245]制剂平均大小(nm)pdizeta电位(mv)ee(％)exermlnc224.4±3.20.185±0.013-3.060±0.40084.95±3.76rmlnc215.7±3.30.165±0.012-2.993±0.290-[0246]exe-rm-lnc和包封有不含肽的rm的脂质纳米囊(rmlnc)的平均颗粒大小为约220nm。pdi指数小(pdi《0.2)表明所得脂质纳米囊在大小分布上的均一性。除了大小和pdi外，艾塞那肽包封后对脂质纳米囊的表面电荷也没有显著影响(p》0.05)。值得注意的是，exermlnc的捕获效率(entrapmentefficiency)为约85％。[0247]脂质纳米囊在体外仿生胃肠液中保持稳定并防止艾塞那肽降解(图1)。脂质纳米囊的稳定性在五种仿生介质中得到证实，包括禁食和喂食状态的模拟胃液或肠液(分别为含或不含胃蛋白酶的fassgf、fassif、fessif和fessif-v2)(图1a-e)。这些结果证实，新开发的脂质纳米囊保留了与先前描述的传统脂质纳米囊相同的胃耐受特性(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115；rogeretal.,intjpharm.2009；379,260-265)。在胃培养基(不含胃蛋白酶的fassgf，ph值1.6)和肠培养基(fassif，ph值6.5)中进一步评估艾塞那肽的体外释放图谱(图1a-f)。艾塞那肽逐渐从rmlnc释放6小时，在此时间后，在fassif中达到60％的累积艾塞那肽释放，这在fassgf中无法检测到(图1f)。[0248]2.2–rmlnc在体外和体内均诱导glp-1分泌，并增加正常血糖小鼠中的exe血液浓度[0249]首先，在鼠l细胞(glutag细胞)和人l细胞(ncl-h716)两者中体外研究了rmlnc引发glp-1分泌的能力(图2a)。在两种体外模型中，颗粒大小为约220nm的rmlnc均能够触发内源性glp-1分泌(图2a)。重要的是，尽管在rmlnc的内核中并入了额外的液体脂质，但对glp-1分泌的刺激与先前描述的含有辛酸/癸酸甘油三酯内核的脂质纳米囊相当(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)。因此，这些数据证实，通过保持纳米系统的外部物理-化学性质(例如，表面电荷)，可以维持纳米载体诱导glp-1分泌的能力。[0250]进一步研究了rmlnc在正常血糖小鼠中是否能体内触发glp-1分泌(图2b)。值得注意的是，由于口服施用rmlnc后，观察到glp-1水平增加高达约3倍，因此药理作用在体内得以保留(图2b)。因此，纳米载体的药理作用在体外的细胞系中(无论细胞的性质如何(小鼠或人))和在体内的正常血糖小鼠中均得到重现。[0251]为了验证rmlnc不仅引发glp-1的内源性分泌，而且用作口服递送肠降血糖素拟似肽的纳米载体的双重作用这一假设，评估了纳米载体增加这些肽的吸收的能力。为了这个目的，在口服施用水溶液或包封在rmlnc内的艾塞那肽(艾塞那肽剂量为500μg/kg)后，测量艾塞那肽的血浆浓度。包封在rmlnc内的艾塞那肽的血浆水平高于在溶液中作为游离艾塞那肽递送时的血浆水平(图3)。总之，这些数据证实了rmlnc在增强内源性glp-1水平和增加exe血浆水平从而使肽能够被吸收两方面的功效这一假设。[0252]此外，在增加药物浓度0.5-10mg/ml(图4a)或纳米颗粒浓度2-18mg/ml(图4b)后，在人肠上皮caco-2细胞中均未观察到exermlnc细胞毒性的证据。图4c和图4d分别描述了rm-lnc在glutag和nci-h716细胞中的细胞毒性。[0253]2.3–内源性glp-1释放与增加的艾塞那肽血浆水平的组合改善了糖尿病小鼠的血糖[0254]在饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠模型中，评估了关于纳米载体介导的内源性glp-1水平与增加的exe血浆浓度的组合的治疗重要性。急性处理(一个单施用)后，在鼠高脂饮食(hfd)诱导的t2dm模型(c57bl/6j小鼠)中进行exermlnc的施用。首先，证实了hfd小鼠在禁食状态下具有显著的高血糖症和高胰岛素血症，并表现出程度强的胰岛素抵抗(例如，胰岛素抵抗指数)。[0255]在口服施用葡萄糖(2g/kg)前60分钟，口服施用一次500μg/kg剂量的艾塞那肽(游离和包封在rm-lnc内)和同等浓度的rm-lnc或水。引人注意的是，我们发现exermlnc处理使血糖完全正常化，因为这些小鼠的血糖在整个口服葡萄糖激发过程中与血糖正常的对照瘦小鼠的血糖图谱相同(图5)。与之相反，exe处理的小鼠在30分钟时测得的葡萄糖水平与hfd喂养的小鼠的葡萄糖水平相似，然后保持高于exermlnc处理的小鼠的葡萄糖水平至90分钟(图5)。exermlnc能够显著降低血浆葡萄糖水平和葡萄糖曲线下面积(auc)(图6)。重要的是，观察到与对照组(对照和hfd)相比，rmlnc和exermlnc处理组的总glp-1水平均显著增加，这证实了纳米系统本身在病理条件下刺激glp-1释放的能力。仅exermlnc组与hfd组相比显著降低了胰岛素抵抗指数(图7)。[0256]有趣的是，与未经处理的hfd小鼠相比，单独rmlnc具有降低血液葡萄糖水平的作用。然而，从降低高血糖症的角度来看，这种作用是不够的。一项测量hfd小鼠中艾塞那肽水平的药代动力学研究证实，与溶液中的艾塞那肽相比，当在rmlnc内口服施用艾塞那肽(exe-rm-lnc)时，艾塞那肽血液浓度显著增加(与lnc的相对生物利用度为4.32％，p《0.001)。由于已知肽已进入开发后期，预估其生物利用度为0.5-1％，因而可以认为该相对生物利用度是一个高数值且改善巨大。表5中总结了所计算的药代动力学参数。[0257]表5：肥胖/糖尿病小鼠体内研究中s.c.艾塞那肽(50μg/kg)、口服艾塞那肽(500μg/kg)和口服exermlnc(500μg/kg)的药代动力学参数。根据单向anova和随后的tukey事后检验，p值具有显著差异(ap《0.01和bp《0.001)。显著性表示为与艾塞那肽口服组相比。[0258][0259]我们在正常血糖(图3)中相比hfd小鼠(图8)观察到了不同的艾塞那肽药代动力学图谱(例如，不同的cmax、auc、tmax)。结合增加的艾塞那肽血液水平和增加的内源性glp-1水平，这些数据作为有力的概念证明，显示了所开发的纳米系统在改善t2dm症状方面的有效性。[0260]进一步研究了exe与exermlnc在用hkd处理8周和10周的小鼠中的影响，因为这个模型是在小鼠中饮食诱导糖尿病和代谢紊乱的更有力的模型。对于ogtt期间exermlnc对降低血液葡萄糖水平的效果，获得了相同的结果，而无论疾病的长期性(chronicity)如何(图9a-b)。[0261]2.4–慢性exermlnc长期治疗改善了肥胖和糖尿病小鼠的葡萄糖代谢[0262]为了评估exermlnc的慢性长期治疗对葡萄糖代谢的影响，将易患肥胖/糖尿病的小鼠进行8周的hfd，然后进行5周的hfd并每天施用500μg/kg艾塞那肽(口服)(exe-rm-lnc)或等量的未装载的脂质纳米囊(rm-lnc)或溶液或水中的游离艾塞那肽(exe)。为了比较这个实验性治疗与现有治疗策略的作用，还包括了用市售的皮下形式的艾塞那肽处理的组。将口服施用艾塞那肽与皮下注射(s.c.)10μg/kg艾塞那肽溶液或进行比较。[0263]每天处理持续5周后，处死小鼠，并从门静脉和腔静脉(cavavein)采血。有趣的是，处理5周后，仅exermlnc能够降低血浆葡萄糖水平，达到与对照组相当的水平(图10a-b)。值得一提的是，exermlnc处理的小鼠与rmlnc处理的小鼠相比具有显著降低的血糖水平。rmlnc组的血浆葡萄糖水平也显著低于exe处理组。因此，这些数据证明了exermlnc对葡萄糖稳态的协同作用。这种作用可能归因于rmlnc引发的内源性glp-1分泌和升高的艾塞那肽血浆水平的结合。此外，exermlnc处理的小鼠和皮下处理的小鼠表现出与对照组相当的胰岛素水平(图11)。尽管当通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验分析数据时，这种与hfd组相比的降低没有达到统计学显著性，但当通过曼-惠特尼检验分析时具有显著差异(exermlnc相比于hfd的p＝0.04)。[0264]2.5–exermlnc慢性(chronic)治疗减少了肥胖/糖尿病小鼠中饮食诱导的脂肪变性[0265]我们发现，在处理5周(hfd喂养13周)后exermlnc处理组中的肝脏重量与hfd喂养组相比显著较低(图12)。油红o染色后的组织学分析显示，与hfd小鼠相比，exermlnc处理的小鼠中的肝脏脂质累积较低，且脂滴更少和更小(数据未显示)，证明了肝脏脂肪变性显著减少。[0266]尽管对甘油三酯水平的影响很小，但exermlnc处理的小鼠和皮下处理的小鼠中的肝脏总脂质含量和胆固醇水平是相当的，并且显著低于hfd组(图13a-c)。[0267]最重要的是要注意，与所有其他治疗方法相比，使用exermlnc的本发明方法在降低肝脏重量方面更有效，并且与典型施用途径(s.c.)的市售药物一样有效，由此清楚地证明了，与目前的皮下方法相比，对葡萄糖参数的作用更好且对肝脏标志物具有非劣效性。[0268]除了生化和组织学分析外，还通过定量pcr分析了肝脏和内脏脂肪组织(vat)中与免疫细胞群体的浸润/募集(f4/80、cd11c、mcp1)、炎症(tnfa)和脂质代谢(fasn、pparg、cpt1a)相关的关键标志物。在肝脏中，exermlnc处理的小鼠的cd11c和mcp1mrna表达显著低于hfd组(分别为p＝0.05和p＝0.0355)，并且在处理组中观察到同样的作用(分别为p＝0.0015和p＝0.0007)。[0269]内脏脂肪量被认为是发生肝病和胰岛素抵抗的危险因素(perseghin,diabetescare.2011；34suppl2,s367-370；lebovitz&banerji,diabetescare.2005；28,2322-2325)。发现exermlnc处理组和处理组均显示与hfd喂养小鼠相比较少的脂肪，这些组的脂肪含量与未经处理的对照组的脂肪含量无显著差异(图14a-e)。当通过曼-惠特尼检验进行分析时，它们的重量有非常显著的差异(exermlnc相比于hfd的p＝0.0057，相比于hfd的p＝0.0004)。有趣的是，根据anova，在hfd组中观察到的f4/80的较高表达仅在exermlnc处理的小鼠中显著下调。与hfd组相比，对其他标志物(cd11c、mcp1、fasn、pparg、tnfa)没有显著影响。[0270]2.6–讨论[0271]尽管不间断地进行着大量努力，但将t2dm的可注射疗法转变为口服药物递送策略仍然是一个挑战。因此，目前市面上glp-1类似物的治疗仍仅限于皮下施用。旨在提供肽的替代药物递送系统的研究极为重要，从而充分利用口服施用途径的潜力。然而，目前口服肽递送的现有策略仅将递送系统用作媒介物，而都没有探究载体可能对最终制剂具有额外治疗作用的可能性。在基于肠降血糖素的糖尿病治疗的情况下，内源性glp-1分泌的增强代表了一种新的替代性治疗，其更近似于肽的生理学。本发明提供了一种基于脂质的药物递送系统，即脂质纳米囊，其对(i)所包封的合成glp-1类似物的递送和(ii)内源性glp-1分泌的刺激具有双重治疗作用。[0272]该递送系统开发中的一个主要挑战是将亲水性肽包封在脂质核心内，同时保留脂质纳米囊的物理-化学性质。为了这个目的，首先将艾塞那肽捕获在反胶束内，而反胶束本身转而又被包括在脂质纳米囊的内部脂质核心中。这种策略能够使glp-1拟似物包封在基于脂质的纳米载体中，而不会改变它们的结构并保持它们对l细胞激活的效力，从而引发内源性glp-1分泌。[0273]装载有艾塞那肽的脂质纳米囊诱导glp-1分泌的能力已在体外在鼠和人l细胞中以及在体内在正常血糖小鼠中得以证实(图2a-b)。此外，我们进行了药代动力学研究，证实了艾塞那肽被吸收到体循环中(图3)。本文提供了关于以下的证据：制剂稳定性、纳米系统保持肽完整性的能力、其在体内增加glp-1水平同时能够使肽被吸收到体循环中的能力，以及最终所述制剂在hfd诱导的肥胖/糖尿病小鼠模型的病理学背景下的功效。[0274]首先评估了我们的双重作用纳米系统在急性治疗(actuetreatment)后改善肥胖/糖尿病小鼠体内血糖的效用。在单急性施用和随后的ogtt测试之后，exermlnc处理的小鼠的血糖水平恢复正常，与对照组相当。尽管空白的和装载有exe的脂质纳米囊与未处理的组或exe溶液处理的组相比均显示出glp-1水平升高，但观察到仅exermlnc处理的小鼠显示出胰岛素抵抗指数显著降低。肥胖/糖尿病小鼠的药代动力学分析证实，exermlnc将艾塞那肽的生物利用度提高至超过4％。这些数据提供了证据，证明了双重作用药物递送纳米系统通过结合增加的内源性glp-1水平和增加的肽生物利用度来改善血糖的有效性。[0275]为了证明该纳米系统代表了t2dm治疗中用于递送肠降血糖素肽的当前皮下方案的替代方案，进行了由五周每日施用方案组成的慢性/长期治疗。评估了纳米系统对葡萄糖稳态和脂质代谢的影响。5周的治疗之后，exermlnc处理的小鼠显示出正常化的血糖水平，与未处理的对照小鼠相当，同时胰岛素水平降低。因此，观察到的有益作用不仅限于纳米载体的急性作用，还转化为对口服葡萄糖耐受的治疗作用。[0276]总之，装载有艾塞那肽的脂质纳米囊可有效降低高血糖症和高胰岛素血症。[0277]值得注意的是，这种方法在葡萄糖稳态方面与目前市售的皮下施用药物具有相当的结果。因此，这些结果证明了这种方法的非劣效性以及口服施用途径对慢性治疗的益处。[0278]这些数据还表明了降低肝脏和内脏脂肪组织中与免疫细胞群体(巨噬细胞、树突细胞)的浸润和募集相关的关键标记物和炎症标记物的强烈趋势，再次凸显了这种方法对此类标记物的有益作用。f4/80是炎性细胞浸润(成熟的巨噬细胞)的标志物，而已知cd11c、mcp1和tnfa反映了肥胖相关炎症期间的m1巨噬细胞表型。需要注意的是，exermlnc是唯一显著降低内脏脂肪组织中f4/80基因表达的处理。在肥胖中，脂肪组织中的巨噬细胞浸润导致慢性炎症，它被认为是胰岛素抵抗和糖尿病的触发因素(weisbergetal.,clininvest.2003；112,1796-1808)。然而，小鼠中巨噬细胞的消融(ablation)与葡萄糖稳态的正常化相关(hernandezetal.,cellmetab.2014；20,499-511)。从机理的角度来看，我们先前表明了rmlnc增加glp-1以及可能的辅肽(co-peptide)glp-2的分泌(这已证明可以增强肠道屏障功能)，从而减少肥胖啮齿动物中的细菌化合物易位、炎症和脂肪变性(canietal.,gut.2009；58,1091-1103)。[0279]在不希望受到理论约束的情况下，使用exermlnc或rmlnc，每日口服强饲(oralgavage)可以全天刺激肠道肽的产生，并因此可有助于维持hfd喂养的小鼠的更好的代谢状况。无论如何，每日慢性施用足以改善新陈代谢，并且甚至使其他标志物正常化。最后，脂质纳米囊可以调节dpp-iv的活性，从而保持增加的体内循环总glp-1水平。[0280]实施例2：工作例2[0281]1.材料和方法[0282]1.1–材料[0283]艾塞那肽(醋酸艾塞那肽)(exe)购自(bubendorf，瑞士)。wl1349(辛酸/癸酸甘油三酯)和(油酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)由gattefossé(saint-priest，法国)友情提供。s100(磷脂酰胆碱含量为94％的大豆卵磷脂)受赠于lipoidgmbh(ludwigshafen，德国)。hs15(游离peg660和peg66012-羟基硬脂酸酯的混合物，mw870da)和80(脱水山梨糖醇油酸酯)购自sigma-aldrich(st.louis，美国)。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚(乙二醇)2000(dspe-peg2000-ch3)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[聚(乙二醇)-2000]-丙酸酯(dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh)获自nanosoftpolymers(winston-salem，美国)。卵磷脂、氯化钠(nacl)、皂苷(saponin)、胃蛋白酶、triton-x100、牛磺胆酸钠和二甲基亚砜(dmso)、3-(4,5-二甲基-噻唑基-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)购自sigma-aldrich(st.louis，美国)。totalglp-1(版本2)和活性glp-1测定试剂盒购自mesoscalediscovery(maryland，美国)。exendin-4酶免疫测定试剂盒购自phoenixeuropegmbh(karlsruhe，德国)。ultrasensitivemouseinsulinelisa试剂盒购自mercodiaab(uppsala，瑞典)。matrigeltm获自bdbioscience(比利时)。二肽基肽酶iv(dpp-iv)抑制剂购自millipore(st.charles，美国)。还使用了达尔伯克改良伊格尔氏培养基(dmem)-glutamax(5.5mm葡萄糖)、胎牛血清(fbs)、青霉素-链霉素(p/s)、胰蛋白酶(0.25％)-edta(0.02％)和磷酸盐缓冲盐水(pbs)，且它们购自thermofisherscientific(invitrogen，比利时)。did(diic18(5)固体(1,1'-十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰菁,4-氯苯磺酸盐))从thermofisherscientific(invitrogen，uk)获得。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级。[0284]1.2–非靶向纳米颗粒和靶向纳米颗粒的制备和表征[0285]1.2.1–非靶向和靶向的基于脂质的纳米系统的制备[0286]如实施例1所述地制备含有包封有艾塞那肽的反胶束(exerm)和修饰的脂质纳米囊(lnc)的非靶向脂质纳米系统(exermlnc)。首先，通过高速搅拌由比例1:5w/w的80(表面活性剂)和wl1349(油)组成的混合物，来制备包封有艾塞那肽的反胶束(exerm)。在搅拌过程中，将50μl药物溶液(含艾塞那肽30mg/ml的milliq水)滴入混合物中。然后，通过稍作修饰的相转化方法产生lnc。将769.5mgwl1349、85.5mg13.4mgs100、120mghs15、50mg氯化钠(nacl)和1.025mlmilliq水的混合物以200rpm搅拌5分钟。进行三次渐进式加热/冷却循环(在50℃和67℃之间)。在最后一个循环中，当温度比相转化区(piz；59至61.5℃)高约3℃时，向混合物中添加500μl预热的exerm。最后，在高速搅拌2分钟下添加2.5ml冷水以达到piz温度。使用相同方案但不添加药物溶液来产生空白的非靶向纳米系统(rmlnc)。[0287]1.2.2–did标记的非靶向和靶向的基于脂质的纳米系统的制备[0288]通过向混合物中添加225μgdid来制备did标记的rmlnc。即，向小瓶中添加45μldid(5mg/ml的乙醇溶液)，然后在水浴中加热直至有机溶剂完全蒸发。随后，将wl1349添加到同一小瓶中，并在水浴中与did混合，直至did完全溶解在油相中。然后将混合物冷却至室温(约20℃)，添加其他组分，并如上所述地继续制备过程。[0289]1.2.3–含或不含丙酸酯的聚乙二醇化的装载有反胶束的脂质纳米囊的制备[0290]通过分别将dspe-peg2000-ch3或dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh与浓度为5mg/ml的rm-lnc在37℃下温和搅拌4小时，来制备含或不含丙酸酯的聚乙二醇化的装载有反胶束的脂质纳米囊(分别为rmlncpeg或rmlncpeg-pro)。在孵育过程中，每15分钟将悬浮液涡旋一次，然后在冰浴中冷却1min。[0291]1.3–艾塞那肽的定量[0292]通过高效液相色谱法(hplc，shimadzu，日本)，使用如实施例1所述的梯度法(参见1.4)来定量包封在聚乙二醇化rmlnc内的艾塞那肽。[0293]1.4–np的表征[0294]如实施例1所公开地(参见1.5)，测定聚乙二醇化rmlncnp的平均直径、多分散性指数(pdi)、zeta电位和药物包封效率(ee，％)。[0295]1.5–受刺激的胃肠液中的纳米囊稳定性和药物释放[0296]1.5.1–聚乙二醇化纳米囊在受刺激的胃肠液中的稳定性[0297]如实施例1所公开地(参见1.6)，评估含或不含作为配体的丙酸酯的聚乙二醇化exermlnc的体外稳定性。[0298]1.5.2–体外药物释放研究[0299]如实施例1中所公开地(参见1.7)，分别在不存在胃蛋白酶的fassgf中2小时和在fassif培养基中6小时，来评估聚乙二醇化exermlnc的药物释放。[0300]1.6–体外细胞研究[0301]1.6.1–细胞培养[0302]鼠肠道l细胞系glutag由danieldrucker博士(加拿大多伦多大学)友情提供。使用第17代至25代的glutag细胞。将细胞于37℃下在5％co2供应下，在补充有10％(v/v)灭活fbs和1％(v/v)p/s的dmemglutamax(5.5mm葡萄糖，完全dmem培养基)中生长。每4-5天将细胞传代一次。[0303]1.6.2–细胞毒性研究[0304]使用先前使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-(2,5-二苯基溴化四唑)(mtt)比色测定法(xuetal.molpharm.2018；15:108-115)计算的纳米颗粒浓度，在glutag细胞中对未装载的聚乙二醇化rmlnc纳米囊进行体外细胞毒性研究。将glutag细胞(每孔5x104个细胞)接种在matrigeltm包被(10μl/ml培养基)的96孔板上。[0305]用预温的pbs缓冲液(x3)洗涤平板后，将100μl的纳米颗粒悬浮液以增加的纳米囊浓度(0.5-10mg/ml)分散在dmem-glutamax培养基(不含fbs)中，并在37℃下与glutag细胞共孵育2小时。孵育后，用100μl0.5mg/mlmtt替换上清液3小时。将紫色甲瓒晶体溶解在200μldmso中，使用multisksanex平板读取器(thermofisherscientific，美国)在560nm处测定吸光度。利用triton-x100的细胞(100％死亡)和利用培养基的细胞(100％存活)分别视为阳性和阴性对照。测试一式三份进行。[0306]1.6.3–体外glp-1分泌[0307]将glutag(每孔1.8x105个细胞)接种到matrigeltm包被的24孔细胞培养板上，并使其粘附24小时。第二天，使用预温的pbs轻柔洗涤平板。然后将glutag细胞与不含fbs的dmem-glutamax或未装载的聚乙二醇化np(含或不含配体的rmlnc纳米囊)共孵育。培养基中含有最终浓度为50μm的dpp-iv抑制剂(st.charles，mo，美国)。为了测试不同纳米颗粒浓度对glp-1分泌的影响，我们分别使用了0.5-2mg/ml纳米囊和0.1-3mg/ml纳米颗粒浓度。方案描述在实施例1中(参见1.9)。[0308]1.7–体内研究[0309]1.7.1–动物[0310]所有涉及动物研究的方案均经鲁汶天主教大学(universitécatholiquedelouvain)动物实验伦理委员会批准(2018/ucl/md/45；实验室协议la1230418)，并根据比利时关于保护实验动物的立法(2013年5月29日皇家法令)进行。[0311]1.7.2–正常血糖小鼠中结合有配体和未结合有配体的聚乙二醇化np的总glp-1分泌[0312]为了测试聚乙二醇化rmlnc(含或不含丙酸酯)，将c57bl/6j雄性小鼠(20-25g，10周；janvierlaboratories，法国)随机分为四组(每组8只小鼠)，并用约1.62mg/g纳米囊剂量处理，如实施例1中所公开(参见1.10)。[0313]1.7.3–纳米囊在肥胖/糖尿病小鼠小肠和结肠中的分布[0314]将雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)随机分为4组(每组n＝4)。适应(2周)后，小鼠接受10周hfd喂养(含60％脂肪和20％碳水化合物(kcal％)的啮齿动物饮食)(d12492i，researchdiets，美国)。在实验前，将小鼠禁食整夜，并可以自由饮水。为了评估纳米囊在小肠和结肠中的分布，通过口服强饲施用did标记的纳米囊，包括rmlnc、聚乙二醇化rmlnc和聚乙二醇化rmlnc-pro(约1.62mg/g纳米颗粒剂量)。对照小鼠口服施用等量的milliq水。在施用后1小时切下十二指肠、空肠、回肠和结肠切片，随后在最佳切割温度化合物(optimalcuttingtemperature，oct)中迅速冷冻。对于所有组织，使用leicacm-3050-s低温控制器切割6μm厚的切片。将组织切片在4％多聚甲醛中短暂固定5分钟。用含有0.02％聚山梨酯20的pbs洗涤后，用含有dapi的vectashieldhardset封固培养基来封固载玻片。使用zeiss共聚焦显微镜(lsm150)通过clsm检查样品，以捕获系列图像。使用axiovision软件(版本4.8)分析数据。[0315]1.7.4–从肥胖/糖尿病小鼠肠道中提取粘液[0316]将未经处理的10周hfd诱导的糖尿病小鼠禁食整夜，并且可以自由饮水。在提取粘液之前，通过颈椎脱位处死小鼠。以下方案改编自wangetal.(bio-protocol.2017；7:e2394)。简言之，将十二指肠和空肠顶端解剖并置于petri皿中，然后用pbs轻柔冲洗以去除肠内的贴附物质。使用带有19.5号针头的注射器通过肠段的一个开口端轻柔递送pbs。使用外科剪刀纵向切割肠段。然后，使用细胞刮刀(1.8cm刀片，)刮去肠段的粘液并转移到干净的管中。将分离的粘液储存在-20℃下，用于进一步的粘液扩散和粘液稳定性研究。[0317]1.7.5–单颗粒跟踪和共聚焦显微镜[0318]将didrmlnc、didrmlncpeg和didrmlncpeg-pro稀释于水或小鼠的小肠粘液中，并通过轻柔搅拌进行混合。将5μl体积置于显微镜玻片上，玻片用粘合垫片(s24737，secure-sealtmspacer，thermofisher)和盖玻片(#1.5)密封。[0319]对于单颗粒跟踪，使用配备有mlc400b激光箱(agilenttechnologies,santaclara,ca,美国)、yokogawacsu-x1共聚焦旋转盘装置(andor,belfast,uk)、ixonultra-emccd摄像机(andorbelfast,uk)和niselements软件(nikon，日本)的旋转盘共聚焦显微镜(nikoneclipseti,tokyo,日本)记录荧光信号。使用100x油浸物镜(planapovc100xoil，1.4na，nikon，日本)。在成像过程中，使用台顶孵育箱(stage-topincubator)(37℃，tokaihit)和物镜加热器(biotechs)。在盖玻片上方5-10μm处记录100帧时间分辨率为43.9ms的影片。由于纳米囊累积在粘液的不同部分或荧光标记泄漏，无法进行进一步分析，因此无法再看到或分析单个纳米囊。[0320]用激光扫描共聚焦显微镜对为单颗粒跟踪制备的样品进行研究。使用流电扫描仪(galvanoscanner)在配有60x/1.27planapoir浸水物镜(srplanapoirac，nikon)的nikona1rhd共聚焦激光扫描显微镜上记录图像。使用637nm波长(lu-n4laserunit)激发did。用multi-alkalipmt(a1-dag-2gaaspmultidetectorunit)检测荧光信号。记录奈奎斯特分辨率(nyquistresolution)下，玻璃表面上方19.5μm的步长为0.5μm的堆栈(stack)，并创建最大强度投影用于可视化。所有成像均在rt下进行。[0321]1.7.6–hfd诱导的肥胖/糖尿病小鼠的药理学研究[0322]随机饲养雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)(每笼5只)。在利用正常饮食(ain93mi，research美国)的适应期(2周)后，给小鼠喂食hfd10周。在实验前将笼子随机分为5组(每组10只小鼠)。将小鼠禁食整夜，然后口服强饲游离药物溶液(exe)(剂量：500μg/kg)、非聚乙二醇化或聚乙二醇化的装载有药物的纳米系统(exermlnc或exermlncpeg)(剂量：500μg/kg)或空的聚乙二醇化纳米系统(rmlncpeg)(剂量：与其他组相等的纳米囊浓度)。对照hfd组口服施用等体积的无菌水。如实施例1中所示，在口服施用上述制剂后1小时，进行口服葡萄糖耐受测试(ogtt)。简言之，口服施用葡萄糖(2g/kg)，然后用葡萄糖计(accucheck，roche，瑞士)测定血液葡萄糖，在葡萄糖载荷前30分钟(-30分钟)和葡萄糖施用后0、15、30、90和120分钟测量尾静脉端的血液。还使用elisa试剂盒(分别为mercodia,uppsala,swedenandmesoscaledelivery,美国)在-30分钟和15分钟从尾静脉采集的血液样品的血浆中测量血浆胰岛素和总glp-1水平。通过将ogtt期间血液葡萄糖和胰岛素两者的auc相乘来计算胰岛素抵抗指数。在ogtt测试结束时，用异氟醚(forene，abbott，england)麻醉小鼠，并从门静脉采集血液样品。通过elisa检测活性glp-1水平(mesoscaledelivery,gaithersburg,美国)。[0323]1.7.7–肥胖/糖尿病小鼠的药代动力学研究[0324]将雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)饲养2周以适应，并随机分为两组(每个时间点10只小鼠)。接下来，小鼠接受hfd喂养10周，如前节所述。所有小鼠在口服强饲前禁食过夜，并可以自由饮用无菌milliq水。以500μg/kg的剂量口服施用艾塞那肽溶液和exermlncpeg。在预定时间点(0、0.5、1、1.5、2、4、6和8小时)，从尾静脉端采集血液样品，离心(1,500g，4℃下10min)，并进行血浆提取，然后在-80℃下储存直至进一步分析。使用elisa试剂盒(ek-070-94，phoenixeuropegmbh，karlsruhe，德国)测定艾塞那肽的血浆浓度。[0325]1.7.8–肥胖/糖尿病小鼠中以不同口服施用频率的长期治疗[0326]将雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)随机分为7组(每组10只)，并以每笼5只饲养，可自由获得无菌食物(ain93mi；researchdiet)(对照饮食)和无菌水。适应2周后，小鼠接受10周hfd或正常对照饮食。在这段时间后，用我们的制剂对小鼠进行额外一个月的处理，继续hfd喂养(总共14周hfd)。在这个月内，每天一次(d)或每两天一次(t)地在下午4点向小鼠口服施用(i)用空白的或装载有药物的聚乙二醇化制剂(500μg/kg剂量)，以相等的纳米囊浓度每日进行处理(rmlncpeg-d或exermlncpeg-d)和(ii)非聚乙二醇化或聚乙二醇化的装载有药物的制剂(500μg/kg剂量)，每隔一天进行处理(exermlnc-t或exermlncpeg-t)。每天向对照组(健康组和hfd)口服施用等体积的无菌milli-q水。在这个4周的治疗期内，每天记录小鼠体重，并每周监测一次血糖。每周一次在葡萄糖测试之前将小鼠禁食6小时。[0327]1.8–统计学分析[0328]使用graphpadprism8程序(ca，美国)进行数据分析。在进行所有分析之前，在各组中针对异常检测进行grubbs检验。在进行分析之前，当各组之间的方差存在显著差异时，使用对数转换将数值标准化。对含多于两个组的研究，使用双向或单向anova和随后的tukey事后检验进行统计学分析，对于两个组，使用t检验或曼-惠特尼检验进行统计学分析。当组之间的方差即使在标准化后仍存在显著差异时，进行非参数检验。当p《0.05时，认为具有统计学显著性。所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(sem)。[0329]2.结果和讨论[0330]2.1–具有丙酸酯作为靶向部分的聚乙二醇化纳米颗粒的制备和表征[0331]为了开发靶向l细胞的基于脂质的纳米囊，选择dspe-peg2000作为聚乙二醇化连接剂，以向纳米囊提供增强的粘液扩散能力。选择插入后方法(post-insertionmethod)，以确保peg链仅位于表面上，而不保留在颗粒核心内。dspe-peg2000-och3和dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh均用于提供对存在于其表面的l细胞gpcr的特异性靶向。在dspe-peg2000-och3和dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh两者的插入后(post-insertion)方法之前(rmlnc)和之后(分别为rmlncpeg和rmlncpeg-pro)，评估空脂质纳米囊的物理化学性质(表6)。[0332]表6：具有不同修饰的装载有exe的或未装载的或did标记的rmlnc的物理化学表征[0333][0334]空白lnc显示出约200nm的颗粒大小和窄的大小分布(pdi＝0.18)。在将lnc与生物功能性聚合物孵育后，观察到rmlncpeg和rmlncpeg-pro的大小分别增加～18nm和～27nm。zeta电位值从-0.94mv(rm-lnc)显著降低至-9.93mv(rmlncpeg)。rmlncpeg-pro的表面电荷降低得甚至更多，在脂肪酸存在下达到-18.20mv。与各自的空白纳米囊相比，在用did标记纳米载体后获得了相似的颗粒大小和zeta电位(表6)。此外，当将艾塞那肽包封在聚乙二醇化纳米囊内(exermlncpeg)时，对纳米囊的大小和表面电荷也没有显著影响(表6)。[0335]2.2–聚乙二醇化np在体外和体内均诱导glp-1分泌[0336]首先在glutag细胞(鼠l细胞)中研究了未装载的、聚乙二醇化的且接支有丙酸酯的rmlnc在体外诱导glp-1刺激的能力。在低于4mg/ml的浓度未观察到细胞毒性的证据后，纳米颗粒浓度范围为0.5mg/ml至2mg/ml。如图15a-b所示，所有基于脂质的制剂均能够在l细胞中显著增加体外内源性glp-1分泌，而无论纳米颗粒浓度如何(**p《0.05)。[0337]进一步测试了这些纳米囊是否能够在正常血糖小鼠中在体内进一步增强和/或诱导glp-1刺激。当口服施用给正常血糖小鼠时，两种聚乙二醇化脂质纳米囊(分别为rmlncpeg和rmlncpeg-pro)和非聚乙二醇化脂质纳米囊(rmlnc)在施用后60分钟显著增加glp-1水平(*p《0.05)(图16)。值得注意的是，在60分钟时，rmlncpeg使glp-1水平增加高达～8倍，而rmlncpeg-pro与原始的未修饰的rmlnc具有相同的作用，与未经处理的对照组相比使glp-1分泌增加高达～4倍。此外，与对照组相比，仅rmlncpeg在180分钟时延长了这种作用(*p《0.05)。尽管聚乙二醇化np在体外与非聚乙二醇化np相比并没有发挥显著作用(图15a-b)，但聚乙二醇化能够显著改善和延长纳米载体在体内诱导glp-1分泌的能力。[0338]2.3–肥胖/糖尿病小鼠小肠和结肠中的纳米颗粒分布[0339]在对10周hfd喂养的小鼠进行体内口服强饲后，追踪纳米胶囊在肠道不同段中的分布。通过荧光纳米颗粒的方法，测试向hfd小鼠口服施用后，did标记的纳米胶囊在小肠和结肠内的累积。所有荧光颗粒(didrmlnc、didrmlncpeg和didrmlncpeg-pro)均可以在十二指肠中找到，其中didrmlncpeg组与其他组相比显示出最强的红色荧光(did)。[0340]为了研究粘液扩散的潜在差异，进行了单颗粒追踪。为了这个目的，将颗粒与小肠粘液混合，置于定制的玻璃区室中，并在旋转盘显微镜上观察。然而，由于观察到的颗粒数量与水中的颗粒相比明显减少，因此无法在体外测定小鼠小肠粘液中的颗粒扩散。使用共聚焦显微镜，观察到与仅粘液相比，针对所有制剂的荧光强度增加的大结构，这表明了与粘液组分的聚集和/或结合。由于无法对单个纳米囊的活动性进行研究，因此无法得出不同制剂之间的净活动性(netmobility)是否存在任何差异的结论。[0341]施用后1小时，观察到did标记的rmlnc主要在十二指肠中，在空肠中几乎没有。有趣的是，处理后一小时，仅rmlncpeg能够穿过空肠的肠上皮，与其他组相比，在上皮基底层观察到高水平的红色荧光。此外，仅rmlncpeg能够穿过整个小肠(十二指肠、空肠和回肠)并到达结肠。[0342]2.4–肥胖/糖尿病小鼠的药理学和药代动力学研究[0343]在评估制剂的体内功效之前，在模拟胃液和肠液中在体外证明了制剂的稳定性，并评估了艾塞那肽的释放图谱。[0344]为了确定装载有艾塞那肽的rmlncpeg(exermlncpeg)对2型糖尿病小鼠中的餐后高血糖症的治疗效果，在10周hfd喂养的小鼠中进行了药效动力学研究。在口服葡萄糖耐受测试(ogtt)之前，施用单剂量的纳米囊。在口服葡萄糖激发(葡萄糖浓度：2g/kg)前60分钟，口服施用500μg/kg艾塞那肽剂量(游离药物溶液和装载有药物的制剂(分别包括exe溶液、exermlnc和exermlncpeg))，空rmlncpeg(与每个装载有药物的纳米囊体积相等)，或相等的水体积。葡萄糖施用的时间点对应于0小时(图17a)。药物溶液处理的小鼠的血浆葡萄糖图谱显示出与接受水的hfd喂养小鼠相似的趋势。与之相反，所有纳米囊处理组，包括exermlnc、exermlncpeg和空rmlncpeg，均可显著降低血液葡萄糖水平和葡萄糖曲线下面积(auc)(图17a)。值得注意的是，空rmlncpeg与装载有艾塞那肽的rmlnc相比具有相似的降低血浆葡萄糖水平的功效和相似的auc，这表明聚乙二醇化后纳米载体独自实现的降血糖作用与包封有药物的非聚乙二醇化纳米载体相当。因此，发现了聚乙二醇化纳米囊分泌的glp-1水平(图16)对于降葡萄糖作用具有治疗重要性。值得注意的是，在所有测试的制剂中，在整个ogtt测试中，仅经exermlncpeg口服处理的小鼠显示出与未经处理的hfd小鼠相比显著降低的血糖水平。[0345]此外，与对照组相比，所有纳米囊处理组的总glp-1水平(图17b)也显著提高(*p《0.05)。尽管根据克鲁斯卡尔-沃利斯检验和dunn事后检验的分析，与hfd组相比，exermlnc组中总glp-1水平的增加并未达到显著差异，但当使用曼-惠特尼检验时观察到显著差异(p＝0.008)(图17b)。在ogtt测试后，与未经处理的hfd小鼠相比，在经exermlncpeg处理的小鼠门静脉中测量(施用制剂后3小时)的活性glp-1浓度也显著增加(*p《0.05)(图17c)。尽管当通过单向anova分析数据时，rmlncpeg和hfd之间没有显著差异，但通过学生t检验发现这些组之间存在显著差异(p＝0.028)。这些数据证实了聚乙二醇化能够在病理条件下提高纳米系统刺激glp-1释放并延长这种作用的能力。未观察到各组间胰岛素水平的差异(图17d)。然而，与未经处理的糖尿病小鼠相比，exermlncpeg可显著降低胰岛素抵抗指数(图17e)。尽管通过单向anova，exermlnc和rmlncpeg之间没有显著差异，但通过学生t检验发现这些组之间存在显著差异(分别为p＝0.035和p＝0.023)。引人注意的是，未装载的聚乙二醇化rmlnc与装载有exe的纳米囊相比获得了相当的结果，这进一步证实了通过聚乙二醇化获得的glp-1水平增加的治疗重要性。[0346]为了研究通过聚乙二醇化rmlnc口服递送艾塞那肽，进行药代动力学研究以评估在通过药物溶液或在rmlncpeg内(exermlncpeg)口服施用500μg/kg单剂量艾塞那肽后，艾塞那肽在慢性糖尿病小鼠(10周hfd；每点n＝10)中的口服吸收(图17f)。在口服强饲仅药物溶液或exermlncpeg后，在肥胖/糖尿病小鼠中观察到不同的艾塞那肽吸收模式。当以溶液口服施用时，艾塞那肽的血浆浓度在整个测试期间保持不变。与之相比，exermlncpeg在口服施引起所述肽的更大的全身吸收持续8小时，其tmax和cmax分别为1小时和27.91±1.22ng/ml。应当注意，在口服施用exermlncpeg与exermlnc后，观察到不同的艾塞那肽药代动力学图谱(例如，不同的cmax、auc、tmax)，这表明聚乙二醇化延长了制剂的循环时间(装载有药物的制剂的t1/2从1.68±0.35延长至5.69±1.02小时)，然后增加了包封的肽的全身吸收(auc从11.79±2.73增加至27.91±1.22ng·h/ml)。[0347]2.5–聚乙二醇化脂质纳米囊在肥胖/糖尿病小鼠中的长期治疗[0348]为了研究在聚乙二醇化后观察到的glp-1分泌增加对葡萄糖代谢的影响，对糖尿病小鼠(10周hfd)进行长期处理(一个月)，以不同的施用频率(每天一次或每隔一天一次)施用装载有艾塞那肽或未装载的rmlncpeg(500μg/kg)(共14周hfd，从第10周起每天或每隔一天施用，共4周)。较不频繁地通过口服施用(每隔一天一次)(exermlncpeg；500μg/kg)或使用等量未装载的聚乙二醇化纳米囊(rmlncpeg)处理的小鼠也与根据施用方案接受非聚乙二醇化的装载有exe的纳米囊(exermlnc；500μg/kg)的小鼠进行比较。[0349]处理4周后的血糖和胰岛素水平以及计算的homa-ir如图18a-c所示。每天施用的聚乙二醇化组(装载的或未装载的)和每隔一天施用的装载有exe的聚乙二醇化组表现出相当的血浆葡萄糖水平。这些水平转而与未经处理的非肥胖/糖尿病对照小鼠相当(p》0.05，图18a)。值得注意的是，只有当聚乙二醇化纳米囊包封exe时，在长期处理后才能有效降低血糖水平。更重要的是，即使较不频繁地施用，它们仍然有效，这是本研究的主要目标(图18a)。此外，通过胰岛素抵抗的稳态模型评估(homa-ir)分析，这些组表现出相等的胰岛素抵抗，其与健康对照组获得的对照值相当(p》0.05)(图18c)。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验，与hfd组相比，这些组之间的减少没有统计学显著性(图18c)。然而，当使用曼-惠特尼检验时，观察到显著差异(分别地，exermlncpeg-d相比于hfd的p＝0.0012；rmlncpeg-d处理相比于hfd的p＝0.0003；且exermlncpeg-t处理相比于hfd的p＝0.05)。[0350]2.6–结论[0351]综上，制剂的增加glp-1分泌和延长抗糖尿病作用可以通过纳米囊的聚乙二醇化实现。[0352]实施例3：比较实施例[0353]shresthaetal.(nanoscale2018，见上文)提供了与本文公开的本发明的纳米颗粒相比不同的基于脂质的纳米颗粒：纳米结构化的脂质载体(nanostructuredlipidcarrier，nlc)的体外数据。在与脂质纳米囊的区别中，nlc呈现固体核心而非本发明的脂质纳米囊的液体核心。在shresthaetal.中，艾塞那肽和利拉鲁肽被包封，并且证明了当呈现150nm的纳米颗粒大小时，这些nlc在体外诱导glp-1分泌。此外，在beloquietal.(molpharm，见上文)的研究中，开发了nlc(150nm)的glp-1分泌效应。在测试的不同纳米颗粒中，仅呈现150nm的纳米颗粒大小的nlc能够在体外诱导glp-1分泌。然而，在进一步的体内研究中，这些纳米颗粒不能诱导glp-1分泌，也不能降低高血糖症和高胰岛素血症。[0354]在4周hfd喂养的小鼠中进行体内研究(如实施例1中所示)。在口服葡萄糖耐受测试(ogtt)前，口服施用一次nlc包封的艾塞那肽(500μg/kg艾塞那肽剂量)。如图19所示，可以观察到对葡萄糖曲线下面积没有影响(图19a-b)，glp-1水平没有增加(图19c-d)，高胰岛素血症没有变化(图19e-f)，且对胰岛素耐受指数没有影响(图19g)。[0355]这些结果表明，两种基于脂质的纳米颗粒，推测呈现相似的组成，但不一定诱导相同的作用。当前第1页12当前第1页12
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：：2.开发能够使治疗性肽被吸收至体循环中的口服剂型是制药业面临的最大挑战之一。所选择的糖尿病肽已进入开发后期，但它们的口服生物利用度低(估计在0.5-1.0％之间)。然而，口服递送肽相比静脉内或皮下施用的益处显著，尤其是在抗糖尿病药物例如胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，glp-1)的情况下。肠降血糖素拟似肽的口服施用具有额外的治疗优势，即拟似了天然肽的常规生理途径。glp-1激动剂靶向肝门静脉区，其通过肝门静脉的可及浓度高于皮下递送，由此减少了全身暴露及其相关副作用。尽管正在进行大量努力开发口服途径施用的肠降血糖素拟似肽，但目前市场上仅有一种口服施用的glp-1拟似物(索马鲁肽(semaglutide)，由novonordisk开发)，其需要共同施用功能性辅料即n-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(sodiumn-[8-(2-hydroxybenzoyl)amino]caprylate，snac)。[0003]肠道生理学提供了一个刺激环境，但在药物递送领域尚未充分发挥其全部潜力。胃肠上皮散布有各种各样的细胞。其中，肠内分泌l细胞因其分泌肽(例如，glp-1和glp-2)的多效性而引起了特别的注意。这些细胞具有5-7天的相对快速的更新，并且它们的密度在病理条件如2型糖尿病(type2diabetesmellitus，t2dm)和炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)下增加，使它们成为治疗这些疾病的有吸引力的靶标。在t2dm的情况下，肠道l细胞分泌的glp-1刺激餐后胰岛素分泌，并被二肽基肽酶-iv(dipeptidylpeptidase-iv，dpp-iv)迅速水解。因此，已经开发出数种具有改善的血浆半衰期的glp-1拟似物(例如，艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、索马鲁肽(semaglutide))，它们已被证明可成功治疗t2dm。目前，研究人员已将注意力从分泌肽转移至l细胞本身作为治疗肥胖症、t2dm和ibd的靶标。事实上，增强内源性glp-1分泌代表了基于肠降血糖素的糖尿病治疗中更具生理性和新颖性的替代方案(burant,diabetescare.2013；36suppl2,s175-179)。尽管在肠腔中发现的某些内源性配体，例如包括丁酸酯和丙酸酯在内的短链脂肪酸可以激活l细胞，但纳米载体(nanocarrier)的使用可以代表一种刺激肠道肽产生的替代治疗策略。事实上，可以将纳米载体工程化以拟似某些配体，并且可以将其设计为具有增加的胃肠道停留，从而引起l细胞的长期激活。[0004]目前的口服肽递送策略仅将递送系统用作媒介物(vehicle)。没有一种策略利用载体(carrier)本身的生理特性来实现制剂的最大治疗潜力。[0005]发明人开发了一种通过口服途径使用肠降血糖素拟似物的前所未有的方法，来治疗和/或预防与功能失调性糖血病相关的代谢病症。事实上，他们提供的证据表明，纳米载体与glp-1拟似物的组合足以使肥胖/糖尿病小鼠在急性或慢性治疗后的血糖正常化。本发明的基于脂质纳米囊的药物递送系统使自身的生物学作用(刺激glp-1释放)和所包封的生物活性分子(肠降血糖素拟似物)的生物学作用协同。有趣的是，除了使用口服途径的强大优势外，这种方法至少与目前上市的药物一样有效，甚至可以更有效地改善口服葡萄糖耐受、胰岛素抵抗、脂质分布和肝脂肪变性。因此，此种策略提供了优于目前的口服肠降血糖素拟似肽递送方法的额外优势，产生了增加的内源性glp-1水平。技术实现要素：[0006]本发明涉及一种用于口服施用的脂质纳米囊，其包含：[0007]-固体脂质外壳(outershell)；和[0008]-亲脂性液体内核(innercore)，其包含装载有一种或多种肠降血糖素(incretin)拟似物(mimetics)的反胶束。[0009]在一个实施方案中，固体脂质外壳包含一种或多种选自包含以下的组的表面活性剂：离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。[0010]在一个实施方案中，亲脂性液体内核包含一种或多种油。在一个实施方案中，所述一种或多种油是甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯或其混合物。[0011]在一个实施方案中，反胶束包含一种或多种选自包含表面活性剂、油及其混合物的组的组分。[0012]在一个实施方案中，脂质纳米囊的平均直径范围为约100nm至约300nm。[0013]在一个实施方案中，脂质纳米囊在体内诱导内源性glp-1分泌。[0014]在一个实施方案中，所述一种或多种肠降血糖素拟似物选自包含阿必鲁肽(albiglutide)、度拉糖肽(dulaglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)、利西拉肽(lixisenatide)和索马鲁肽(semaglutide)的组。在一个实施方案中，所述一种或多种肠降血糖素拟似物是艾塞那肽。[0015]在一个实施方案中，纳米囊包含：[0016]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯、非离子性亲脂性表面活性剂和任选的聚乙二醇化脂质，尤其是聚乙二醇化磷脂；和[0017]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0018]在一个实施方案中，脂质纳米囊包含：[0019]-固体脂质外壳，其包含表面活性剂hs15、s100和任选的dspe-peg2000-och3；和[0020]-亲脂性液体内核，其包含油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0021]在一个实施方案中，艾塞那肽具有的药代动力学谱特征在于在高脂肪饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠中至少4％的相对生物利用度。[0022]本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含：[0023]-治疗有效量的用于口服施用的脂质纳米囊，其包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束，和[0024]-药学上可接受的媒介物。[0025]本发明还涉及一种药物，其包含治疗有效量的用于口服施用的脂质纳米囊，所述脂质纳米囊包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束。[0026]本发明进一步涉及一种脂质纳米囊，其包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束，用于在有此需要的受试者中治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症。[0027]在一个实施方案中，病症选自包含以下的组：2型糖尿病(type2diabetesmellitus，t2dm)、肥胖症、炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)、胰腺炎、血脂异常(dyslipidemia)、非酒精性脂肪性肝病、高血糖症、肝脂肪变性(liversteatosis)、超重、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、前期糖尿病(prediabetes)、空腹血糖受损(impairedfastingglucose)、食欲过盛(hyperphagia)、食物摄入行为改变、肝脏胰岛素抵抗、全身胰岛素抵抗、加速转运(acceleratedtransit)、脂肪组织炎症、心脏功能障碍、急性心肌梗塞、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变和胃轻瘫(gastroparesis)。在一个实施方案中，所述病症选自包含2型糖尿病(t2dm)、肥胖症和炎性肠病(ibd)的组。[0028]本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症的试剂盒，其包含：[0029]-一种或多种脂质纳米囊，其包含固体脂质外壳和亲脂性液体内核，所述亲脂性液体内核包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束；和[0030]-一种或多种口服降血糖剂。[0031]定义[0032]在本发明中，下列术语具有以下含义：[0033]-数值前面的“约(about)”意指所述值的加或减10％。应理解，术语“约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。[0034]‑“包含(comprise)”旨在意指“含有(contain)”、“涵盖(encompass)”和“包括(include)”。在一些实施方案中，术语“包含”还涵盖术语“由……组成(consistof)”。[0035]‑“药学上可接受的赋形剂(pharmaceuticallyacceptableexcipient)”是指当施用给动物，优选人类时不产生有害的、过敏的或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。对于人类施用，制备物应符合fda生物制品办公室标准所要求的无菌、一般安全和纯度标准。[0036]‑“受试者(subject)”是指哺乳动物，优选人类。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。在一个实施方案中，受试者可以是“患者(patient)”，即温血动物，更优选是人类，他/它正在等待接受或正在接受医疗护理或曾经/现在/将是医疗程序的对象，或被监测glp-1相关病症的发展。在一个实施方案中，受试者是成年人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如18岁以下的受试者)。[0037]‑“治疗有效量(therapeuticallyeffectiveamount)”意指在不对靶标造成显著负面或不利副作用的情况下目的在于以下的药剂的水平或量：(1)延迟或预防glp-1相关病症的发作；(2)减缓或停止glp-1相关病症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)导致glp-1相关病症的症状的改善；(4)降低glp-1相关病症的严重程度或发生率；或(5)预防glp-1相关病症。在一个实施方案中，为了预防或防止作用，在glp-1相关病症发作之前施用治疗有效量。在另一个实施方案中，为了治疗作用，在glp-1相关病症发作后施用治疗有效量。[0038]‑“治疗(treatment)”是指治疗性治疗(therapeutictreatment)和预防性或防止性措施(prophylacticorpreventativemeans)，其中目的是预防或减缓(减轻)glp-1相关病症。需要治疗的那些包括已经患有所述病症的那些以及易于患有所述病症的那些或需要预防所述病症的那些。如果在接受治疗量的本发明的脂质纳米囊后，受试者或哺乳动物表现出一种或多种以下可观察和/或可测量的变化，则所述受试者或哺乳动物被成功“治疗”：涉及一个或多个与glp-1相关病症相关的症状的改善、发病率和死亡率的降低以及生活质量问题的改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以通过医师熟悉的常规程序容易地测量。具体实施方式[0039]本发明人配制了用于口服施用的装载有肠降血糖素拟似物的脂质纳米囊，用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症如2型糖尿病(t2dm)、肥胖症的目的。本发明的纳米囊在结构上明显不同于例如us2017087096和wo2018157202公开的基于脂质的制剂，shresthaetal.(nanoscale.2018；10:603-613)和beloquietal.(molpharm.2016；13:4222-4230)公开的纳米颗粒。此外，如本文公开的比较研究所证明的(参见比较例3)，来自现有技术的这些纳米颗粒在进一步的体内研究中不能诱导glp-1分泌，也不能降低高血糖症和高胰岛素血症，而本发明的纳米囊可以。此外，本发明的聚乙二醇化纳米囊进一步改善了肠降血糖素拟似物的半衰期及其全身吸收。[0040]本发明涉及一种用于口服施用的脂质纳米囊，其包含：[0041]-固体脂质外壳；和[0042]-亲脂性液体内核，其包含装载有一种或多种肠降血糖素拟似物的反胶束。[0043]在一些实施方案中，用于制备本发明的脂质纳米囊的组分属于“公认安全”(generallyrecognizedassafe，gras)的组分列表。[0044]如本文所用，术语“纳米囊(nanocapsule)”和“纳米颗粒(nanoparticle)”可以彼此替换。[0045]根据第一个实施方案，本发明的脂质纳米囊的固体脂质外壳包含一种或多种(或至少一种)表面活性剂。[0046]在一个实施方案中，所述一种或多种表面活性剂是聚乙二醇化的。[0047]在一个实施方案中，至少一种表面活性剂的亲水亲脂平衡(hydrophilic-lipophilicbalance，hlb)范围为约4至约40，优选约6至约16，更优选约10至约14。[0048]hlb值由c.larpent在editionstechniquesdel'ingénieur的traiték.342中定义。[0049]在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂为离子、非离子或两性的表面活性剂。在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂选自包含乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化脂肪酸的部分甘油酯和聚乙氧基化脂肪酸甘油三酯及其混合物的组。在一个具体的实施方案中，所述至少一种表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂，是脂肪酸的聚氧乙烯酯，优选hs15(也称为hs15)。[0050]乙氧基化脂肪醇的示例包括但不限于环氧乙烷与月桂醇的加合物，尤其是包含9至50个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的laureth-9至laureth-50)；环氧乙烷与山萮醇的加合物，尤其是包含9-50个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的beheneth-9至beheneth-50)；环氧乙烷与鲸蜡硬脂醇(鲸蜡醇和硬脂醇的混合物)的加合物，尤其是包含9-30个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的ceteareth-9至ceteareth-30)；环氧乙烷与鲸蜡醇的加合物，尤其是含有9-30个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的ceteth-9至ceteth-30)；环氧乙烷与硬脂醇的加合物，尤其是含有9-30个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的steareth-9至ceteareth-30)；环氧乙烷与异硬脂醇的加合物，尤其是含有9-50个氧乙烯基团的那些(ctfa命名的isosteareth-9至isosteareth-50)；及其混合物。[0051]乙氧基化脂肪酸的示例包括但不限于环氧乙烷与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或山萮酸的加合物及其混合物，尤其是包含9至50个氧乙烯基团的那些，例如peg-9至peg-50月桂酸酯(ctfa命名：peg-9月桂酸酯至peg-50月桂酸酯)；peg-9至peg-50棕榈酸酯(ctfa命名：peg-9棕榈酸酯至peg-50棕榈酸酯)；peg-9至peg-50硬脂酸酯(ctfa命名：peg-9硬脂酸酯至peg-50硬脂酸酯)；peg-9至peg-50棕榈硬脂酸酯；peg-9至peg-50山萮酸酯(ctfa命名：peg-9山萮酸酯至peg-50山萮酸酯)；及其混合物。[0052]在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂是热敏性的亲水性的非离子表面活性剂。[0053]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的固体脂质外壳进一步包含至少一种亲脂性表面活性剂。[0054]在一个实施方案中，所述至少一种亲脂性表面活性剂是磷脂。在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂选自包含磷脂酰胆碱(也称为卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的组。亲脂性表面活性剂的示例包括但不限于lipoids45、lipoids75-3、lipoids100、lipoidgpc、lipoide80、脱水山梨糖醇油酸酯(span80)、epikurontm135和在一个具体的实施方案中，亲脂性表面活性剂是lipoids100和/或脱水山梨糖醇油酸酯(span80)。[0055]在一个实施方案中，所述至少一种表面活性剂，尤其是亲脂性表面活性剂，更尤其是脂质，更尤其是磷脂，是聚乙二醇化脂质，更尤其是聚乙二醇化磷脂。聚乙二醇化磷脂的示例包括但不限于dppe-pegx(其中dppe代表二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)、dspe-pegx(其中dspe代表二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、dope-pegx(其中dope代表二油酰基磷脂酰乙醇胺)和pope-pegx(其中pope代表棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺)，其中x代表peg分子的大小，单位为g/mol。在一些实施方案中，x包含约400至约20,000，优选约800至约5,000，更优选约1,000至约3,000。如本文所用，约400至约20,000包括约400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000和20,000。[0056]在一个实施方案中，x是1,000、2,000、3,000、4,000或5,000。在一个实施方案中，x是6,000、7,000、8,000或9,000。在一个实施方案中，x是10,000。[0057]如本文所用，术语“peg”是指通式(i)的聚乙二醇化合物，如现有技术中普遍接受的：[0058]h-[o-ch2-ch2]x-r(i)，[0059]其中x包含约400至约20,000(代表peg分子的大小，单位为g/mol)并且其中r代表-oh、-o(c1-c12)烷氧基、-(c1-c12)羧基、-nh2。[0060]在一个实施方案中，r代表-o(c1-c6)烷氧基，包括-och3(甲氧基)、-oc2h5、-oc3h7、-oc4h9、-oc5h11、-oc6h13及其异构体。在一个实施方案中，r代表-(c1-c6)羧基，包括-cooh(甲酸)，-ch2-cooh(乙酸)、-c2h4-cooh(丙酸)、-c3h6-cooh(丁酸)、-c4h8-cooh(戊酸)、-c5h10-cooh(己酸)及其异构体。[0061]在一个实施方案中，聚乙二醇化磷脂是dspe-peg2000-och3(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚(乙二醇)2000)，其是包含式(i)的peg的dspe-peg，其中x是2,000，r是-och3。[0062]在一个实施方案中，聚乙二醇化磷脂是dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[聚(乙二醇)-2000]-丙酸酯)，其是包含式(i)的peg的dspe-peg，其中x是2,000，r是丙酸。[0063]在实践中，聚乙二醇化磷脂提供了增强的粘液扩散(mucusdiffusion)、增加的稳定性和延长的血液循环。增加的粘液穿透(mucopenetration)可以有助于增加纳米囊与l细胞表面的接触。在实践中，聚乙二醇化磷脂可以从例如或nanosoft商购获得。[0064]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种选自包含非离子表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物的组的组分。[0065]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种选自包含热敏性亲水性非离子表面活性剂、磷脂及其混合物的组的组分。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的固体脂质外壳包含热敏性亲水性非离子表面活性剂和磷脂。[0066]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种表面活性剂，优选s100和/或hs15，其总量范围为相对于脂质纳米囊总重量的约1％至40％(按重量计)，优选约3％至约25％(按重量计)，更优选约5％至约15％(按重量计)。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种表面活性剂，优选s100和/或hs15，其总量为相对于脂质纳米囊总重量的约6.45％(按重量计)。[0067]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种表面活性剂，优选s100和/或hs15和/或dspe-peg2000-och3或dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh，其总量范围为相对于脂质纳米囊总重量的约1％至40％(按重量计)，优选约0.5％至约25％(按重量计)，更优选约1％至约10％(按重量计)。[0068]在本发明的范围内，表述“约0.1％至约40％(按重量计)”涵盖0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％和40％(按重量计)。[0069]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种或多种非离子表面活性剂，优选hs15，和一种或多种亲脂性表面活性剂，优选s100和/或聚乙二醇化磷脂。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的脂质外壳包含一种非离子表面活性剂，优选hs15，和2种亲脂性表面活性剂，优选s100和聚乙二醇化磷脂。[0070]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的亲脂性液体内核包含一种或多种油。[0071]在一个实施方案中，油是至少一种甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸酯或其混合物。[0072]在一个实施方案中，脂肪酸选自饱和或不饱和c8至c26脂肪酸及其混合物。在一个实施方案中，不饱和脂肪酸可以是单不饱和或多不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，脂肪酸是多不饱和的，尤其是选自omega-3脂肪酸的组，该组包含α-亚麻酸(18:3，ala)、二十碳五烯酸(20:5，epa)和二十二碳六烯酸(22:6，dha)。在实践中，omega-3脂肪酸的来源可以是鱼油。[0073]在一个实施方案中，脂肪酸酯选自c8至c18，优选c8至c12脂肪酸酯。在一个具体的实施方案中，脂肪酸酯选自包含以下或由以下组成的组：乙基棕榈酸酯、乙基油酸酯、乙基肉豆蔻酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯及其混合物。[0074]在一个实施方案中，甘油三酯是合成的甘油三酯或天然来源的甘油三酯。甘油三酯的天然来源包括但不限于动物脂肪或植物油如大豆油，或长链甘油三酯(lct)的来源。[0075]在另一个实施方案中，甘油三酯包含中等长度的脂肪酸，也称为中链甘油三酯(medium-chaintriglyceride，mct)。中链甘油三酯(mct)油是其中的烃链含有8至12个碳原子的甘油三酯。[0076]mct油的示例包括但不限于tcr产品(甘油三酯混合物的商业命名，其中约95％的脂肪酸链含有8或10个碳原子，来自法国sociétéindustrielledesoléagineux)和812(由瑞典dynamitnobel公司出售的甘油三酯，是辛酸和癸酸甘油酯三酯的混合物)。[0077]在一个实施方案中，甘油三酯的脂肪酸单元是不饱和的，单不饱和的或多不饱和的。在一个实施方案中，亲脂性液体内核包含含有不同脂肪酸单元的甘油三酯的混合物。[0078]在一个实施方案中，油选自包含以下的组：甘油，甘油脂肪酸单甘油酯、脂肪酸甘油三酯，亚油酸和/或油酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，辛酸甘油三酯，癸酸甘油三酯，辛酸和/或癸酸的丙二醇酯，植物脂肪酸的甘油三酯，及其混合物。[0079]可包含在亲脂内核中的油的示例包括但不限于labrafactmlipophilewl1349(辛酸和癸酸的中链甘油三酯)、labrafactmpg(辛酸和癸酸的丙二醇酯)、cc497(聚甘油-6二油酸酯)、peceoltm(甘油单油酸酯)、cc(主要是亚油酸和油酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和810/812(辛酸和癸酸的甘油三酯)。在一个具体的实施方案中，亲脂内核包含labrafactmlipophilewl1349。在一个具体的实施方案中，亲脂内wl1349。[0091]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的反胶束包含如上文所述的表面活性剂和油。[0092]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊的反胶束包含至少一种肠降血糖素拟似物、80和labrafactmlipophilewl1349，或由其组成。在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊的反胶束包含艾塞那肽、80和labrafactmlipophilewl1349，或由其组成。[0093]在一个实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约5％至约50％(按重量计)，优选约10％至约35％(按重量计)，更优选约15％至约20％(按重量计)的表面活性剂，优选80。在一个具体的实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约16.67％(按重量计)的表面活性剂，优选80。[0094]在本发明的范围内，表述“约5％至约50％(按重量计)”涵盖5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％和50％(按重量计)。[0095]在一个实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约50％至约95％(按重量计)，优选约75％至约90％(按重量计)，更优选约80％至约85％(按重量计)的油，优选labrafactmlipophilewl1349。在一个具体的实施方案中，本发明的反胶束包含相对于反胶束总重量的约83.33％(按重量计)的油，优选labrafactmlipophilewl1349。[0096]在本发明的范围内，表述“约50％至约95％(按重量计)”涵盖50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和95％(按重量计)。[0097]在一个实施方案中，反胶束为相对于脂质纳米囊总重量的约0.01％至约40％(按重量计)，优选约1％至约35％(按重量计)，更优选约10％至约25％(按重量计)。[0098]在本发明的范围内，表述“约0.01％至约40％(按重量计)”涵盖0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％和40％(按重量计)。[0099]在一个实施方案中，表面活性剂/油的重量比范围为1:10至1:1。在一个实施方案中，表面活性剂/油的重量比范围为1:8至1:3。在一个实施方案中，表面活性剂/油的重量比为1:5。在本发明的范围内，表述“1:10至1:1”涵盖1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2和1:1。[0100]在一个实施方案中，肠降血糖素拟似物/表面活性剂的重量比范围为0.001至0.2，优选0.005至0.05，更优选0.01至0.03。在一个实施方案中，肠降血糖素拟似物/表面活性剂的重量比为约0.03。在本发明的范围内，表述“0.001至0.2”涵盖0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175和0.2。[0101]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径(meandiameter)是至少约100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190或200nm。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径是至多约200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300nm。[0102]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径范围为约100nm至约300nm，优选约150nm至约250nm，更优选约180nm至约230nm。在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径范围为约200nm至约300nm。在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊的平均直径为约200nm。在实践中，平均直径约200nm以上的脂质纳米囊具有诱导内源性glp-1分泌的能力，并因此具有促进glp-1血液水平增加的能力。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米囊在体内诱导内源性glp-1分泌。在实践中，内源性glp-1的体内分泌可以根据现有技术的任何合适的方法或从其改编的方法来测量。作为示例，可以通过elisa试剂盒的方式如商业的totalglp-1elisa试剂盒(来自mesoscale)测量血液样品，尤其是血浆样品中的glp-1水平。内源性glp-1分泌可以表示为与治疗前获得的参考值相比的倍数变化。[0103]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊的肠降血糖素拟似物选自包括艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽、利西拉肽和索马鲁肽的组。[0104]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊至少包含艾塞那肽。[0105]在一个实施方案中，艾塞那肽具有的药代动力学谱的特征在于在高脂肪饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠中至少4％的相对生物利用度。[0106]在本发明的范围内，表述“至少4％”包括4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、15％或更多。[0107]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0108]-固体脂质外壳；和[0109]-亲脂性液体内核，其包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0110]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0111]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯和亲脂性表面活性剂；和[0112]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0113]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0114]-固体脂质外壳，其包含表面活性剂hs15和s100；和[0115]-亲脂性液体内核，其包含油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0116]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0117]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15和s100组成；和[0118]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm、氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0119]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0120]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯、非离子亲脂性表面活性剂和任选的聚乙二醇化脂质，尤其是聚乙二醇化磷脂；和[0121]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0122]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0123]-固体脂质外壳，其包含表面活性剂hs15、s100和任选的dspe-peg2000-och3；和[0124]-亲脂性液体内核，其包含油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0125]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0126]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15、s100和任选的dspe-peg2000-och3组成；和[0127]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或peceoltm、氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0128]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊包含：[0129]-固体脂质外壳，其包含脂肪酸的聚氧乙烯酯、非离子亲脂性表面活性剂和聚乙二醇化脂质，尤其是聚乙二醇化磷脂；和[0130]-亲脂性液体内核，其包含甘油三酯和脂肪酸酯，并且包含装载有艾塞那肽的反胶束。[0131]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0132]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15、s100和dspe-peg2000-och3组成；和[0133]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0134]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊由以下组成：[0135]-固体脂质外壳，其由表面活性剂hs15、s100和dspe-peg2000-ch2ch2cooh组成；和[0136]-亲脂性液体内核，其由油labrafactmlipophilewl1349和/或cc497或氯化钠、水和装载有艾塞那肽的反胶束组成。[0137]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊在两个步骤中制备。在一个实施方案中，用于制备本发明的脂质纳米囊的方法包括以下步骤：[0138]1.将一种或多种肠降血糖素拟似物包封在反胶束内，和[0139]2.将反胶束包封在脂质纳米囊内。[0140]在第一步骤结束时，获得装载有肠降血糖素拟似物的反胶束。在第二步结束时，获得装载有肠降血糖素拟似物的反胶束脂质纳米囊。[0141]在一个实施方案中，第一步骤包括高速搅拌一种或多种选自包含表面活性剂、油及其混合物(优选表面活性剂和油)的组的组分(步骤1a)。[0142]在一个实施方案中，第一步骤进一步包括将一种或多种肠降血糖素拟似物(优选艾塞那肽)滴入一种或多种组分的混合物，优选上述表面活性剂和油的混合物中(步骤1b)。[0143]在一个实施方案中，第二步骤包括相转化过程，其中将脂质纳米囊的组分在磁搅拌下混合在一起(步骤2a)。在一个实施方案中，脂质纳米囊的组分包含如上文所述的固体脂质外壳和亲脂性液体内核的组分。在一个实施方案中，脂质纳米囊的组分包含油、表面活性剂、盐和水。在一个实施方案中，这个步骤在30℃至50℃，优选35℃至45℃，更优选约40℃的温度下进行。在一个实施方案中，这个步骤在100rpm至1000rpm，优选200rpm的速度下进行。在一个实施方案中，进行这个步骤至少1分钟、2分钟或5分钟。[0144]在一个实施方案中，第二步骤进一步包括渐进式加热/冷却温度循环(步骤2b)。在一个实施方案中，温度循环在40℃至85℃，优选45℃至75℃，更优选50℃至68℃的温度范围内进行。在一个实施方案中，在温度循环的最后一个循环期间，将步骤1中获得的包含肠降血糖素拟似物的反胶束添加到步骤2b中获得的混合物中(步骤2c)。在一个实施方案中，在比相转化区(phaseinversionzone，piz)高约3℃的温度下进行步骤2c。在一个实施方案中，在约58℃至约70℃，优选约60℃至约68℃，更优选约62℃至约64.5℃的温度范围内进行步骤2c。在一个实施方案中，在最后一个温度循环中温度冷却至piz后，将冷水(0℃至5℃之间，优选约4℃)添加到在步骤2c结束时获得的混合物中(步骤2d)。在一个实施方案中，在步骤2d结束时，混合物的温度为约57℃至约63℃，优选约58℃至约62℃，更优选约59.5℃至约61.5℃。[0145]在一个实施方案中，用于制备本发明的脂质纳米囊的方法不包括使用任何有机溶剂。换句话说，所述方法是用于制备本发明的脂质纳米囊的无有机溶剂的方法。[0146]在一个实施方案中，可以将本发明的脂质纳米囊冻干，并且然后以胶体悬浮液的形式重配。在一个实施方案中，可以将渗透剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、防腐剂或其混合物添加到待冻干的脂质纳米囊的悬浮液中。在一个实施方案中，在这些化合物完全溶解后，悬浮液可经历在约-50℃下的快速冷冻的第一步骤。在一个实施方案中，这些悬浮液随后可通过在减压下在低温以蒸汽形式直接穿过水来进行冻干。在一个实施方案中，干燥形式的脂质纳米囊可在使用前以无菌形式长期储存。[0147]本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上文所述的脂质纳米囊和药学上可接受的媒介物。[0148]本发明进一步涉及如上文所述的脂质纳米囊或药物组合物，用作药物。[0149]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊用于制备药物。本发明的目的是本发明的脂质纳米囊用于制备药物的用途。[0150]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症。[0151]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物用于治疗和/或预防选自包含以下的组的病症：2型糖尿病(t2dm)、肥胖症、炎性肠病(ibd)、胰腺炎、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病、高血糖症、肝脂肪变性、超重、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、前期糖尿病、空腹血糖受损、食欲过盛、食物摄入行为改变、肝脏胰岛素抵抗、全身胰岛素抵抗、加速转运、脂肪组织炎症、心脏功能障碍、急性心肌梗塞、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变和胃轻瘫。[0152]在一个具体的实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物用于治疗和/或预防2型糖尿病(t2dm)、肥胖症或炎性肠病(ibd)。[0153]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊具有显著降低肝脏重量、肝脏脂质积累以及脂滴的数量和大小的优势。[0154]本发明还涉及一种治疗和/或预防有此需要的受试者中与glp-1功能障碍相关的病症的方法，包括向所述受试者口服施用本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0155]在一个实施方案中，所述方法用于治疗和/或预防选自包含以下的组的病症：2型糖尿病(t2dm)、肥胖症、炎性肠病(ibd)、胰腺炎、血脂异常、非酒精性脂肪性肝病、高血糖症、肝脂肪变性、超重、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症、代谢综合征、前期糖尿病、空腹血糖受损、食欲过盛、食物摄入行为改变、肝脏胰岛素抵抗、全身胰岛素抵抗、加速转运、脂肪组织炎症、心脏功能障碍、急性心肌梗塞、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变和胃轻瘫。[0156]本发明的另一个目的是一种提高有此需要的个体的glp-1血液水平的体内方法，包括向所述个体口服施用治疗有效量的本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0157]本发明的另一个目的是一种降低有此需要的个体的血糖水平的体内方法，包括向所述个体口服施用治疗有效量的本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0158]应当理解，本发明的脂质纳米囊、药物组合物和药物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的具体药剂的活性；所采用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体药剂的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所采用的具体药剂组合使用或同时使用的药物；以及医学领域中公知的类似因素。例如，药剂的剂量以低于达到所需治疗效果所需的水平开始并逐渐增加剂量直至达到所需效果，这完全在本领域技术范围内的。[0159]然而，产品的每日剂量可在大范围内变化，从约0.01至约1000mg/成人/天，优选0.1至约500，更优选约1至约200mg/成人/天。在一个实施方案中，以约0.1mg至约20mg/成人/天的剂量施用本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物。[0160]有效量的脂质纳米囊通常以每天0.1mg/kg至约1000mg/kg体重的剂量水平来供应。[0161]在一个实施方案中，有效量的脂质纳米囊可每天施用一次、两次或三次。[0162]在一个实施方案中，本发明的脂质纳米囊、药物组合物或药物通过口服施用或适应于口服施用。[0163]本发明还涉及一种用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症的试剂盒，其包含：[0164]-一种或多种本发明的脂质纳米囊；和[0165]-一种或多种口服降血糖剂。[0166]在一个实施方案中，口服降血糖剂选自包含以下的组：α-葡萄糖苷酶抑制剂，优选阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)或伏格列波糖(voglibose)；双胍(biguanide)，优选二甲双胍(metformin)；塞克洛瑟(cycloset)，优选溴隐亭(bromocriptine)；dpp-4抑制剂，优选西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、利格列汀(linagliptin)或阿格列汀(alogliptin)；美格列奈(meglitinide)，优选瑞格列奈(repaglinide)或那格列奈(nateglinide)；sglt2抑制剂，优选达格列嗪(dapagliflozin)或坎格列嗪(canagliflozin)；磺酰脲(sulfonylurea)，优选格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)、格列齐特(gliclazide)或格列美脲(glimepiride)；噻唑烷二酮(thiazolidinedione)，优选罗格列酮(rosiglitazone)或吡格列酮(pioglitazone)。[0167]本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防与glp-1功能障碍相关的病症的药物递送系统，其包含：[0168]-一种或多种本发明的脂质纳米囊；和[0169]-一种或多种口服降血糖剂。附图说明[0170]图1a-1f是直方图和曲线图的组合，显示了仿生肠液中脂质纳米囊的稳定性和艾塞那肽的释放。图1a显示了装载有艾塞那肽的反胶束(rm)脂质纳米囊(exermlnc)以预定时间间隔在在胃蛋白酶存在下在fassgf中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1b显示了exermlnc以预定时间间隔在胃蛋白酶不存在下在fassgf中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1c显示了exermlnc以预定时间间隔在fassif中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1d显示了exermlnc以预定时间间隔在fessif中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。图1e显示了exermlnc以预定时间间隔在fessif-v2中孵育后的颗粒大小和pdi变化(平均值±sem；n＝9)。exermlnc的颗粒大小在任何情况下均没有显著改变(p》0.05)，并且在测定介质中表现出单分散性(pdi《0.2)。图1f显示了在37℃下在fassif(ph6.5)中6小时的累积艾塞那肽释放图谱，通过hplc测量(平均值±sem；n＝9)。[0171]图2a-2b是显示在体外和正常血糖小鼠体内的rmlnc介导的glp-1分泌的图组合。图2a显示了在2小时共孵育期后glutag(左)和nci-h716(右)细胞(分别为鼠和人l细胞)中rmlnc介导的体外glp-1分泌(2mg/ml)(平均值±sem；n＝6-10)。图2b显示了在rmln口服施用后60和180分钟，正常血糖小鼠的体内总glp-1分泌(平均值±sem；n＝7-8)。图2a和图2b中的p值由学生t检验或曼-惠特尼检验(mann-whitneytest)确定。[0172]图3表示显示正常血糖小鼠中艾塞那肽血浆水平的图。艾塞那肽血液谱是在向血糖正常小鼠口服施用水溶液(exe)或rmlnc内的包封物(exermlnc)(500μg/kg艾塞那肽剂量，对应于约1.62mg/g脂质纳米囊剂量)通过elisa测量的(平均值±sem；n＝4)。根据双向anova和随后的tukey事后检验，具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。[0173]图4a-4d是显示l细胞和肠细胞样细胞的体外细胞毒性研究的直方图组合。图4a显示了在37℃下孵育2小时后exermlnc对caco-2细胞的细胞活力(viability)，以针对药物浓度的细胞活力表示。图4b显示了在37℃下孵育2小时后exermlnc对caco-2细胞的细胞活力，以针对纳米颗粒浓度的细胞活力表示。图4c显示了在与增加的脂质纳米囊浓度(1mg/ml至10mg/ml)共孵育2小时后，rmlnc对glutag细胞的细胞活力。图4d显示了在与增加的脂质纳米囊浓度(1mg/ml至10mg/ml)共孵育2小时后，rmlnc对人nci-h716细胞的细胞活力。数据显示为平均值±sem(n＝9)。虚线对应于80％的活力。数据对应于三个独立实验。[0174]图5表示显示在葡萄糖激发(glucosechallenge)之前30分钟和之后120分钟测量的血浆葡萄糖水平(mg/dl)的图(n＝8-9)。根据双向anova和随后的tukey事后检验，具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。[0175]图6表示显示在葡萄糖激发之前30分钟和之后120分钟测量的曲线下平均面积(auc，mg/dl/min)的直方图(n＝8-9)。[0176]图7表示显示通过将血液葡萄糖auc乘以胰岛素auc来确定的胰岛素抵抗指数的直方图(n＝8-9)。[0177]图8表示显示在皮下施用(exes.c.)(50μg/kg艾塞那肽剂量)和口服施用后溶液中的和rmlnc内的艾塞那肽(分别为exe和exermlnc)(500μg/kg艾塞那肽剂量对应于约1.62mg/g脂质纳米囊剂量)的浓度-时间图谱和auc。数据表示为平均值±sem(n＝8-10)。根据单向anova和随后的tukey事后检验，具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。[0178]图9a-9b是显示在8周龄和10周龄的hfd诱导的糖尿病小鼠中对exermlnc的ogtt评估的图组合。图9a显示了在2g/kg葡萄糖口服激发后在喂食对照饮食和hfd(8周)的小鼠(c57bl6/j小鼠)中测量的血浆葡萄糖水平和auc。图9b显示了在2g/kg葡萄糖口服激发后在喂食对照饮食和hfd(10周)的小鼠(c57bl6/j小鼠)中测量的血浆葡萄糖水平和auc，通过双向anova测定。数据表示为平均值±sem(n＝7-8)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。对于ogtt，通过双向anova来确定p值，对于比较各组之间的auc，通过单向anova和随后的tukey事后检验来确定p值。[0179]图10a-10b是显示exermlnc对肥胖/糖尿病小鼠的葡萄糖稳态的影响的图的组合。图10a显示了处理5周期间(hfd喂养13周)的血浆葡萄糖水平，表示为mg/dl。图10b显示处理5周后(hfd喂养13周)的血浆葡萄糖浓度，表示为mg/dl。数据表示为平均值±sem(n＝10)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过双向anova和随后的tukey事后检验来确定p值。[0180]图11表示显示exermlnc对肥胖/糖尿病小鼠高胰岛素血症的影响的直方图。从门静脉测量胰岛素血浆水平(n＝8-10)。数据表示为平均值±sem。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验(kruskalwallis)和随后的dunn事后检验来确定p值。[0181]图12表示显示exermlnc处理对肝脏重量(g)的影响的直方图。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过单向anova和tukey事后检验来确定p值。[0182]图13a-13c是显示exermlnc处理对脂质稳态的影响的直方图组合。图13a显示了肝脏总脂质含量(mg-1每100mg组织)。图13b显示了肝脏甘油三酯(nmol.mg-1)。图13c显示了肝脏胆固醇(nmol.mg-1)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验来确定p值。[0183]图14a-14e是直方图的组合。图14a显示了exermlnc处理对脾脏重量的影响。图14b显示了exermlnc处理对内脏脂肪组织(visceraladiposetissue，vat)重量的影响。图14c显示了exermlnc处理对皮下脂肪组织(subcutaneousadiposetissue，sat)重量的影响。图14d显示了exermlnc处理对心外膜脂肪组织(epicardialadiposetissue，eat)重量的影响。图14e显示了exermlnc处理对棕色脂肪组织(brownadiposetissue，bat)重量的影响。数据表示为平均值±sem(n＝9-10)。具有不同上标字母的数据有显著差异(p《0.05)。通过单向anova和tukey事后检验来确定p值。[0184]图15a-15b是直方图的组合，显示了聚乙二醇化纳米囊(有或没有作为配体植入的丙酸酯)在glutag细胞(小鼠l细胞)和正常血糖小鼠中对glp-1刺激的影响。在与0.5mg/ml至2mg/ml的增加的纳米囊浓度共孵育2小时后，聚乙二醇化rmlnc(有或没有作为配体植入的丙酸酯)在小鼠glutag细胞中对glp-1刺激的影响(平均值±sem；n＝4；n＝3)。描述了每个小图和每个测试浓度，从左至右：培养基、rmlnc、rmlncpeg和rmlncpeg-pro。图15a(a)表示总glp-1水平；图15b(b)表示细胞外总glp-1水平(表示为pg/ml)。[0185]图16是显示在口服强饲后(post-oralgavage)60和180分钟，健康对照小鼠的总glp-1水平的直方图，其中培养基作为对照(黑色条)，rmlnc(深灰色条)、rmlncpeg(浅灰色条)和rmlncpeg-pro(白色条)使用相同的纳米囊剂量(1.62mg/g)(平均值±sem；n＝8)。不同的上标字母代表基于单向anova和随后的tukey事后检验的各组之间的显著差异(*p《0.05)。[0186]图17a-17f是曲线图和直方图的组合，显示了单个口服施用剂量后肥胖/糖尿病小鼠的药理学和药代动力学研究。图17a：在施用葡萄糖之前30分钟和之后120分钟测试了血液葡糖糖值(bloodglucosevalue，mg/dl)和平均auc(mg/dl·min)(n＝7-8)。hfd(黑色菱形)，exe(方形)，exermlnc(倒三角形)，rmlncpeg(三角形)，exermlncpeg(灰色菱形)。图17b：在施用葡萄糖之前30分钟和之后15分钟测量了血浆总glp-1浓度(n＝6-8)。对于条件的顺序，参见图17a的插入图。图17c：ogtt后在肥胖/糖尿病小鼠门静脉中测量的活性glp-1水平(施用制剂后3小时)(n＝6-8)。图17d：在口服施用葡萄糖之前30分钟和之后15分钟从尾静脉血液收集的血浆中，测量胰岛素浓度(n＝6-8)。对于条件的顺序，参见图17a或图17c的插入图。图17e：胰岛素抵抗指数(n＝7-8)。图17f：在口服施用药物溶液或装载有药物的聚乙二醇化纳米囊(分别为exe和exermlncpeg)(剂量：500μg/kg)后，糖尿病小鼠(hfd喂养10周)的血浆艾塞那肽浓度-时间图谱和艾塞那肽auc(n＝9-10)。数据显示为平均值±sem。不同的上标字母表示各组之间的显著差异(*p《0.05)，利用双向方差分析(anova)和tukey事后检验(图17a、f)、克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验(图17b)或单向anova和随后的tukey事后检验(图17c-e)[0187]图18a-18c是显示不同口服施用频率的聚乙二醇化和非聚乙二醇化的装载有exe的脂质纳米囊通过长期治疗对hfd饮食诱导的糖尿病小鼠的高血糖症和高胰岛素血症的影响的图组合。图18a：施用4周后的血浆葡萄糖值(mg/dl)(hfd喂养总共14周)(平均值±sem；n＝7-10)。图18b：在来自尾静脉取回的血液的血浆中测试胰岛素浓度(平均值±sem；n＝6-9)。图18c：使用公式[空腹血糖(mg/dl)x空腹胰岛素(ng/ml)]/405来计算homa-ir(平均值±sem；n＝8-9)，如之前amrutkaretal.(diabetes.2015；64:2791-2804)所定义。不同的上标字母表示各组之间的统计学显著差异(*p《0.05)，基于双向方差分析和随后的tukey事后检验(图18a)，或克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验(图18b-c)。[0188]图19a-19g是显示通过纳米结构的脂质载体(nlc)，在葡萄糖激发之前30分钟和之elisa试剂盒购自mercodiaab(uppsala，瑞典)。获自bdbioscience(比利时)。二肽基肽酶iv(dpp-iv)抑制剂购自millipore(st.charles，美国)。还使用了达尔伯克改良伊格尔氏培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium，dmem)-glutamax(5.5mm葡萄糖)、洛斯维帕克纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute，rpmi)-1640培养基、青霉素-链霉素(p/s)、胎牛血清(fbs)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、含有乙二胺四乙酸(edta，0.02％)的胰蛋白酶(0.25％)，它们购自thermofisherscientific(invitrogen，比利时)。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级。[0197]1.3–装载有反胶束的脂质纳米囊的制备和表征[0198]装载有反胶束的脂质纳米囊(rmlnc)在两个步骤中配制，在所述步骤中，首先将药物包封在反胶束中，然后进一步包封在lnc中。首先，通过高速搅拌表面活性剂(80)和油(wl1349)混合物(1:5重量比)来制备装载有艾塞那肽的反胶束(exerm)。然后，将50μlexe(30mg/ml，于milliq水中)滴入混合物中并保持搅拌。装载有艾塞那肽的反胶束脂质纳米囊(exermlnc)是按照heurtaultetal.(pharmres.2002；19:875-880)描述的改进的相转化方法来制备的。简言之，将所有组分(如表1所示)，包括亲脂性wl1349、s100、hs15、氯化钠(nacl)和milliq水，在40℃下以200rpm磁力搅拌5分钟来进行混合。[0199]表1：exermlnc的组成[0200][0201]渐进式加热/冷却的温度循环在50℃和67℃之间进行。在最后一个循环期间，在比相转化区(piz；59℃至61.5℃)高约3℃的温度下将500μl预热的装载有药物的rm添加到混合物中。将溶液冷却至相转化区(piz)温度，添加2.5ml冷milliq水(4℃)并高速搅拌2分钟。在不存在艾塞那肽的情况下按照相同的方案制备空白rmlnc。[0202]1.4–艾塞那肽的定量[0203]使用shresthaetal.(nanoscale.2018；10:603-613)先前描述的梯度方法，通过高效液相色谱法(hplc，shimadzu，日本)对包封在rmlnc内的艾塞那肽进行定量。简言之，在室温下使用evoc18柱(2.6μm，150x4.6mm)(phenomenex，美国)和安全保护柱(phenomenex，美国)。水性流动相包含0.05％(v/v)三氟乙酸(tfa)的水溶液，有机流动相由0.05％(v/v)的乙腈溶液组成。建立初始比例为10:90(v/v，水相:有机相)、流速为1ml/min的梯度系统，将其在10分钟内线性改变为90:10(v/v)，并且在下一分钟保持不变。然后，将所述比率在接下来的1.5分钟内线性改变为初始组成，并保持稳定最后一分钟。所使用的注入体积为20μl，所使用的检测波长为220nm。保留时间为5.9min，检测限和定量限分别为1.1±0.4μg/ml和3.3±1.1μg/ml。[0204]1.5–exermlnc的表征[0205]使用zetasizernanozs(malverninstrumentsltd.,worcestershire,uk)通过动态光散射(dls)来测量exermlnc的颗粒大小和多分散性指数(polydispersityindex，pdi)，对其进行表征。使用zetasizernanozs通过激光多普勒测速仪(laserdopplervelocimetry，ldv)来测定zeta电位。针对测量，将5μl脂质纳米囊悬浮液分散在995μl超纯水中。所有测量均一式三份进行。[0206]还基于exermlnc的药物包封效率(ee，％)对其进行表征。为了计算总药物含量，将50μlexermlnc溶解在950μl甲醇中，然后进行强力涡旋。使用离心过滤器(mwco30kda，4000g，4℃，20分钟)(millipore)通过超滤将游离和包封的艾塞那肽分开。使用1:2稀释因子进一步稀释滤液。使用上述hplc方法对滤液中的艾塞那肽和溶于甲醇中的艾塞那肽进行定量。使用以下公式计算ee：[0207]ee(％)＝(艾塞那肽总量-游离艾塞那肽)/(艾塞那肽总量)×100。[0208]1.6–在受刺激的胃肠液中的脂质纳米囊稳定性和药物释放[0209]在五种不同的仿生介质中对exelnc的体外稳定性进行了测试：含和不含胃蛋白酶的禁食状态模拟胃液(fastedstate-simulatedgastricfluid，fassgf)、禁食状态模拟肠液(fastedstate-simulatedintestinalfluid，fassif)、进食状态模拟肠液(fedstate-simulatedintestinalfluid，fessif)和fessif版本2(fessif-v2)(biorelevant.com，uk)。表2中给出了对所用模拟液的组成的详细描述。[0210]表2：仿生肠液的组成[0211]组成fassgffassiffessiffessif-v2牛磺胆酸钠0.08mm3mm15mm10mm卵磷脂0.02mm0.75mm3.75mm2mm甘油单油酸酯‑‑‑5mm油酸钠‑‑‑0.8mm氯化钠34.2mm34.2mm203.18mm126mm无水磷酸二氢钠-28.65mm‑‑氢氧化钠-8.71mm101.02mm82mm乙酸‑‑144.04mm-马来酸‑‑‑55mm胃蛋白酶0.1mg/ml‑‑‑ph1.66.555.8[0212]基于脂质纳米囊的大小和pdi来评估胃和肠道条件对脂质纳米囊稳定性的影响。在37℃下将exermlnc在含和不含胃蛋白酶的fassgf、fassif、fessif和fessif-v2中(含100μl脂质纳米囊的10ml培养基)在温和搅拌下孵育。在预定的时间间隔(对于受刺激的胃液培养基是0、0.5、1和2小时，对于受刺激的肠液培养基和fessif是0、0.5、1、3和6小时)下取样，然后通过dls进行分析。[0213]1.7–体外药物释放研究[0214]分别在不存在胃蛋白酶的fassgf中(2小时)和在fassif培养基中(6小时)来评估exermlnc的药物释放。使用渗析法进行研究。简言之，将1mlexermlnc置于一次性渗析膜(mwco100kda)(g2,microfloat,spectrumlabs,美国)中，并于37℃下在磁力搅拌下引入含有35ml培养基的50mlfalcon管中。在预定时间取样50μl并溶解在950μl甲醇中。如上所述，通过hplc测定艾塞那肽的浓度。[0215]1.8–体外细胞研究[0216]1.8.1–细胞培养[0217]人nci-h716l细胞系获自美国模式培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)(manassas，va)，并使用第15至20代。完全培养基包含洛斯维帕克纪念研究所(rpmi)1640培养基和1％(v/v)青霉素-链霉素(p/s)和10％(v/v)胎牛血清(fbs)。将细胞悬浮在75cm2烧瓶(corning,lowell,ma,usa)中，于37℃下在5％co2/95％空气(v/v)的环境中生长。每隔一天添加一些新鲜培养基。更换培养基后，离心培养物并随后以合适密度重悬。[0218]使用第16代至29代的肠道鼠l细胞系glutag细胞。将细胞于37℃下在5％co2供应下，在补充有10％(v/v)灭活fbs和1％(v/v)p/s的dmemglutamax(5.5mm葡萄糖，完全dmem培养基)中生长。每4-5天使用含有edta(0.02％)的胰蛋白酶(0.25％)将细胞传代。[0219]使用第25至30代的caco-2细胞(克隆-1)。将caco-2细胞系保持在由补充有10％(v/v)hyclonetmfbs、1％(v/v)l-谷氨酰胺、1％(v/v)非必需氨基酸和1％(v/v)p/s的dmem组成的培养基中，37℃，10％co2/95％空气(v/v)。每隔一天更换一次培养基。[0220]1.8.2–细胞毒性研究[0221]基于如前所述使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-(2,5-二苯基溴化四唑)(mtt)比色测定法(beloquietal.,journalofcontrolledrelease.2013；166,115-123)计算的药物和脂质纳米囊浓度，在caco-2细胞中进行exermlnc的体外细胞毒性研究。还在glutag和nci-h716细胞中测试了未装载的rmlnc对细胞活力的影响。将caco-2细胞(每孔5×104个细胞)接种在96孔组织培养板(costarcorningcellbindsurface，美国)中，并允许其粘附过夜。对于glutag和nci-h716的细胞毒性研究，将每孔5×104个细胞接种在包被(10μl/ml培养基)的96孔板上。用预温的pbs缓冲液(x3)洗涤平板后，将药物浓度增加(0.5-10mg/ml)的100μlexermlnc(对应于增加的脂质纳米囊浓度(2-18mg/ml))分散在dmem(不含fbs)中，并与caco-2细胞在37℃下共孵育2小时。将增加的未装载的rmlnc浓度(从1mg/ml至10mg/ml)分散在dmemglutamax或rpmi-1640培养基(不含fbs)中，并分别与glutag或nci-h716细胞在37℃下共孵育2小时。孵育后，用100μl0.5mg/mlmtt替换上清液3h。将紫色甲瓒晶体溶解在200μldmso中，使用multisksanex平板读取器(thermofisherscientific，美国)测定560nm处的吸光度。利用triton-x100的细胞(100％死亡)和利用培养基的细胞(100％存活)分别视为阳性和阴性对照。测试一式三份进行。[0222]1.9–体外glp-1分泌[0223]将glutag和nci-h716细胞(每孔1.8×105个细胞)接种到包被的24孔细胞培养板上并使其粘附24小时。第二天，使用预温的pbs轻柔洗涤平板。然后，将glutag细胞与不含fbs的dmemglutamax或未装载的rm-lnc共孵育。另一方面，将nci-h716细胞与不含fbs的rpmi-1640培养基和未装载的rm-lnc一同孵育。两种培养基均含有最终浓度为50μm的dpp-iv抑制剂(millipore,st.charles,mo,美国)。为了证实脂质纳米囊与之前测试的脂质纳米囊(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)相比的功效，我们使用了2mg/ml的脂质纳米囊浓度。在37℃下孵育2小时后，收集上清液，在4℃下以250g离心5分钟(离心机5804r,eppendorfag,hamburg,德国)，并在-80℃下保存直到进一步分析。细胞收集在具有dpp-iv抑制剂的pbs中。在三次冻融循环和随后在4℃下以250g离心5分钟后获得含有glp-1的细胞提取物。使用totalglp-1elisa试剂盒(mesoscaledelivery，gaithersburg，美国)测定总glp-1浓度。glp-1分泌表示为上清液加上细胞中检测到的glp-1的量。glp-1分泌通过以下公式计算：[0224]glp-1分泌＝c细胞外/(c细胞内 c细胞外)[0225]其中c细胞外是在上清液中测定的glp-1浓度，c细胞内是在细胞中测定的glp-1浓度。[0226]1.10–正常血糖小鼠中的总glp-1分泌[0227]将正常血糖小鼠(c57bl/6j雄性小鼠，20-25g，10周；janvierlaboratories，法国)随机分为两组，每组8只小鼠。实验前，使动物禁食整夜，并可以自由饮水。用空白rmlnc(对应于约1.62mg/g纳米颗粒剂量)处理小鼠。通过口服强饲用等体积的milliq水处理对照小鼠。在口服施用后60和180分钟，从尾静脉端抽取血液样品。在dpp-iv抑制剂的存在下(每ml血液20μl)收集样品，并保存在冰上。研究结束后，立即将血液样品离心(3,000rpm，4℃下10分钟)，并且将血浆在-80℃下保持冷冻直到分析。使用totalglp-1elisa试剂盒对总glp-1水平进行定量(mesoscaledelivery，美国)。总glp-1血浆值表示为与未处理的对照组相比的倍数变化。[0228]1.11–高脂肪饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠的口服葡萄糖耐受测试[0229]将8周龄雄性小鼠每笼5只饲养，并分为5组(每组10只)。适应2周后，在实验前给小鼠喂食高脂肪饮食(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)，d12492i，researchdiets，美国)(hfd和艾塞那肽处理组)或正常饮食(对照，ain93mi，researchdiets，美国)3周、8周或10周，禁食一整晚，然后用口服艾塞那肽溶液(exe，500μg艾塞那肽/kg体重)、装载有艾塞那肽-反胶束的脂质纳米囊(exermlnc，500μg艾塞那肽/kg体重)或装载有未装载的胶束的脂质纳米囊(rmlnc，以与每exermlnc相等的浓度)处理，1小时后用口服强饲葡萄糖激发(challenge)。对照组(对照饮食组和hfd组)用口服强饲相同体积的无菌milliq水处理。1h后，用口服强饲养葡萄糖(2g/kg葡萄糖剂量)激发小鼠。在口服葡萄糖前30分钟(-30分钟)和口服葡萄糖载荷后0、15、30、90和120分钟测量血液葡萄糖(bloodglucose)。用葡萄糖计(accu-check，roche，瑞士)从尾静脉端采集的血液样品中测定血液葡萄糖。在-30分钟和15分钟收集血液样品，使用elisa试剂盒(分别为mesoscaledelivery，美国和mercodia，uppsala，瑞典)检测总glp-1和胰岛素血浆浓度。胰岛素抵抗指数通过相乘口服葡萄糖耐受测试(oralglucosetolerancetest，ogtt)获得的血浆中的血液葡萄糖和胰岛素曲线下面积来确定。[0230]1.12–正常血糖和肥胖/糖尿病小鼠中的药代动力学研究[0231]将8周龄雄性小鼠随机分为三组(每个时间点10只小鼠)，并将其置于受控环境中(室温23±2℃，12小时日光周期)，可以自由获取食物和无菌水。适应两周后，小鼠经历3周的hfd(60％脂肪)。在实验之前，将小鼠禁食整夜，并可以自由饮用无菌milli-q水。艾塞那肽溶液和exermlnc以500μg/kg剂量口服施用。还以50μg/kg剂量皮下施用艾塞那肽。在不同时间点(0、0.5、1、1.5、2、4、6和8小时)，从尾静脉端收集血液样品。然后将血液样品离心(1500g，4℃下10分钟)，并使用elisa试剂盒(ek-070-94，phoenixeuropegmbh，karlsruhe，德国)对艾塞那肽血浆浓度进行定量。艾塞那肽的相对生物利用度(fr％)使用以下公式计算：[0232][0233]使用pksolver分析药代动力学参数(zhangetal.,computmethodsprogramsbiomed.2010；99,306-314)。对于血糖正常小鼠，在每个时间点使用4只小鼠。在相同条件下测量艾塞那肽。[0234]1.13–肥胖/糖尿病小鼠的慢性艾塞那肽长期治疗研究[0235]将8周龄雄性小鼠随机分为7组(每组10只)，并且每笼5只饲养于受控环境中(室温为23℃±2℃、12小时日光周期)，并可以自由获取无菌食物(ain93mi；researchdiet)和无菌水。两周适应期后，小鼠经历8周的hfd(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)，d12492i，researchdiets，美国)(艾塞那肽处理组)或正常周饮食(对照)。在这个阶段之后，在接下来的5周处理期间，每天记录小鼠体重，并每周一次监测血糖。每天下午4点用以下处理小鼠：(i)口服施用在溶液中或将包封在rmlnc内的艾塞那肽(500μg/kg剂量)(exermlnc)或相应浓度的未装载的rmlnc，或(ii)皮下施用艾塞那肽溶液(10μg/kg)或(10μg/kg)(市售艾塞那肽皮下注射)。对照组(健康和hfd)每天用口服等体积的无菌milliq水来处理。在葡萄糖测试之前，每周一次将小鼠禁食6小时。在治疗期结束时，用异氟醚(forene，abbott，england)麻醉动物，并从门静脉和腔静脉采集血液样品。放血后，通过颈椎脱位将小鼠安乐死。精确解剖皮下脂肪组织、肝脏和脾脏，称重，并立即浸入液氮中，然后在-80℃下储存用于进一步分析，或保存在4％多聚甲醛(pfa)中用于组织学分析(肝脏)。通过皮下(sat)、附睾(eat)、内脏脂肪组织(vat)和棕色脂肪组织(bat)的重量(mg)来评估对身体组成和脂肪组织的影响。在外周血和门静脉血中测量与食物摄入和体重有关的葡萄糖和胃肠激素水平，包括总glp-1(elisa试剂盒，mesoscaledelivery，gaithersburg，美国)和胰岛素(超敏胰岛素elisa，mercodia，uppsala，瑞典)。通过油红o染色将肝脏脂肪变性可视化。将肝组织包埋在tissue-tekoptimalcuttingtemperature化合物(sakuraeurope，leiden，荷兰)中，并在冷异戊烷中快速冷冻。将5微米厚的组织切片用油红o染色，用于脂质含量分析。每只小鼠分析五个高倍视野(20x)。使用imagej软件(版本2.0.0-rc-69/1.52i，nationalinstitutesofhealth，bethesda，maryland，美国)对平均液滴面积(meandropletarea)进行定量。通过苏木精和伊红(h&e)染色切片来评估肝脏的整体形态。对于实时定量pcr(qrt-pcr)分析，使用tripure试剂(roche)从组织中分离总rna。通过使用reversetranscriptionsystem试剂盒(promega，madison，wisconsin，美国)反转录1μg总rna，来制备互补dna。使用cfx96实时pcr系统和cfxmanager3.1软件(bio-rad，hercules，california，美国)，根据制造商的说明使用qpcrmastermix(promega，madison，usa)进行实时pcr，用于检测。选择核糖体蛋白l19(rpl19)作为管家基因。所有样品在两个96孔反应平板中一式两份运行，并根据2-δct法分析数据。扩增结束时，通过熔融曲线分析来评估扩增产物的身份和纯度。所靶向的小鼠基因的引物序列如表3所示。[0236]表3：通过rt-qpcr进行基因表达分析的引物序列[0237]seqidno:序列1rpl19正向gaaggtcaaagggaatgtgttca2rpl19反向ccttgtctgccttcagcttgt3f4/80正向tgacaaccagacggcttgtg4f4/80反向gcaggcgaggaaaagatagtgt5cd11c正向acgtcagtacaaggagatgttgga6cd11c反向atcctattgcagaatgcttctttacc7mcp1正向gcagttaacgccccactca8mcp1反向tccagcctactcattgggatca9tnfa正向tcgagtgacaagcctgtagcc10tnfa反向ttgagatccatgccgttgg11fasn正向caggcccctctgttaattgg12fasn反向tccagggataacagcacctt13pparg正向ctgctcaagtatggtgtccatga14pparg反向tgagatgaggactccatctttattca15cpt1a正向agaccgtgaggaactcaaacctat16cpt1a反向tgaagagtcgctcccact[0238]如前所述(everardetal.,natcommun.2019；10,457)，根据改进的folch方法(biolchem.1957；226,497-509)，在用氯仿-甲醇提取后测量总脂质。甘油三酯和胆固醇浓度使用结合酶反应和最终产物的分光光度检测的试剂盒(diasysdiagnosticandsystem,holzheim,德国)进行测量。所有样品一式两份运行。[0239]1.14–统计学分析[0240]使用graphpadprism7程序(ca，美国)进行统计学分析。对于所有分析和每个组，通过使用grubbs检验进行异常检测(outlierdetection)，来支持任何排除。当各组之间的方差显著不同时，在进行分析之前通过对数转换将数值标准化。采用双向或单向anova和随后的tukey事后检验进行多组之间的比较。如果组间的方差即使在标准化后还存在显著差异，则进行非参数检验。结果表示为平均值±平均值的标准误差(sem)。将p《0.05的差异认为是统计学显著的。[0241]2.结果和讨论[0242]2.1–艾塞那肽被成功包封并保存在基于脂质的脂质纳米囊内[0243]最近发现，当大小为约200nm时，基于脂质的脂质纳米囊(lnc)在小鼠中触发体内内源性glp-1分泌(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)。但尚不清楚将lnc的生物学效应与所包封的glp-1类似物的药理学作用协同起来是否可行。因此，作为概念证明，选择glp-1类似物艾塞那肽(exe)作为肠降血糖素拟似物，将其包封在亲水性分子lnc内。为了评估这种可能性，将艾塞那肽包封在脂质纳米囊的液体脂质内核内，并同时保留纳米载体的物理化学特性，这很重要，所述物理化学特性是利用脂质纳米囊本身所观察到的体内生物效应(例如，触发内源性glp-1分泌)的原因(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)。根据相转化方法制备lnc(heurtaultetal.,pharmres.2002；19,875-880)。与之前描述的用于制备lnc的方法(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)相比，将油性内核替换为辛酸/癸酸甘油三酯(wl1349)和油酸的甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯的混合物。这种变化允许将渐进式加热/冷却的温度循环从60℃至90℃降至50℃至67℃，从而使exe能够并入lnc。在将exe包封到lnc中之前，使用包含脱水山梨糖醇油酸酯(80)和辛酸/癸酸甘油三酯混合物(wl1349)的表面活性剂-油组合，将exe捕获在反胶束(rm)中(antonetal.,intjpharm.2010；398,204-209)。然后，在lnc制备方法的最后一个循环期间，将这些exerm并入制剂中。上文表1中描述了制剂的最终组成，表4中详细说明了物理化学表征。[0244]表4：装载有exe和未装载exe的rmlnc的物理化学表征(n＝9)[0245]制剂平均大小(nm)pdizeta电位(mv)ee(％)exermlnc224.4±3.20.185±0.013-3.060±0.40084.95±3.76rmlnc215.7±3.30.165±0.012-2.993±0.290-[0246]exe-rm-lnc和包封有不含肽的rm的脂质纳米囊(rmlnc)的平均颗粒大小为约220nm。pdi指数小(pdi《0.2)表明所得脂质纳米囊在大小分布上的均一性。除了大小和pdi外，艾塞那肽包封后对脂质纳米囊的表面电荷也没有显著影响(p》0.05)。值得注意的是，exermlnc的捕获效率(entrapmentefficiency)为约85％。[0247]脂质纳米囊在体外仿生胃肠液中保持稳定并防止艾塞那肽降解(图1)。脂质纳米囊的稳定性在五种仿生介质中得到证实，包括禁食和喂食状态的模拟胃液或肠液(分别为含或不含胃蛋白酶的fassgf、fassif、fessif和fessif-v2)(图1a-e)。这些结果证实，新开发的脂质纳米囊保留了与先前描述的传统脂质纳米囊相同的胃耐受特性(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115；rogeretal.,intjpharm.2009；379,260-265)。在胃培养基(不含胃蛋白酶的fassgf，ph值1.6)和肠培养基(fassif，ph值6.5)中进一步评估艾塞那肽的体外释放图谱(图1a-f)。艾塞那肽逐渐从rmlnc释放6小时，在此时间后，在fassif中达到60％的累积艾塞那肽释放，这在fassgf中无法检测到(图1f)。[0248]2.2–rmlnc在体外和体内均诱导glp-1分泌，并增加正常血糖小鼠中的exe血液浓度[0249]首先，在鼠l细胞(glutag细胞)和人l细胞(ncl-h716)两者中体外研究了rmlnc引发glp-1分泌的能力(图2a)。在两种体外模型中，颗粒大小为约220nm的rmlnc均能够触发内源性glp-1分泌(图2a)。重要的是，尽管在rmlnc的内核中并入了额外的液体脂质，但对glp-1分泌的刺激与先前描述的含有辛酸/癸酸甘油三酯内核的脂质纳米囊相当(xuetal.,molpharm.2018；15,108-115)。因此，这些数据证实，通过保持纳米系统的外部物理-化学性质(例如，表面电荷)，可以维持纳米载体诱导glp-1分泌的能力。[0250]进一步研究了rmlnc在正常血糖小鼠中是否能体内触发glp-1分泌(图2b)。值得注意的是，由于口服施用rmlnc后，观察到glp-1水平增加高达约3倍，因此药理作用在体内得以保留(图2b)。因此，纳米载体的药理作用在体外的细胞系中(无论细胞的性质如何(小鼠或人))和在体内的正常血糖小鼠中均得到重现。[0251]为了验证rmlnc不仅引发glp-1的内源性分泌，而且用作口服递送肠降血糖素拟似肽的纳米载体的双重作用这一假设，评估了纳米载体增加这些肽的吸收的能力。为了这个目的，在口服施用水溶液或包封在rmlnc内的艾塞那肽(艾塞那肽剂量为500μg/kg)后，测量艾塞那肽的血浆浓度。包封在rmlnc内的艾塞那肽的血浆水平高于在溶液中作为游离艾塞那肽递送时的血浆水平(图3)。总之，这些数据证实了rmlnc在增强内源性glp-1水平和增加exe血浆水平从而使肽能够被吸收两方面的功效这一假设。[0252]此外，在增加药物浓度0.5-10mg/ml(图4a)或纳米颗粒浓度2-18mg/ml(图4b)后，在人肠上皮caco-2细胞中均未观察到exermlnc细胞毒性的证据。图4c和图4d分别描述了rm-lnc在glutag和nci-h716细胞中的细胞毒性。[0253]2.3–内源性glp-1释放与增加的艾塞那肽血浆水平的组合改善了糖尿病小鼠的血糖[0254]在饮食诱导的肥胖/糖尿病小鼠模型中，评估了关于纳米载体介导的内源性glp-1水平与增加的exe血浆浓度的组合的治疗重要性。急性处理(一个单施用)后，在鼠高脂饮食(hfd)诱导的t2dm模型(c57bl/6j小鼠)中进行exermlnc的施用。首先，证实了hfd小鼠在禁食状态下具有显著的高血糖症和高胰岛素血症，并表现出程度强的胰岛素抵抗(例如，胰岛素抵抗指数)。[0255]在口服施用葡萄糖(2g/kg)前60分钟，口服施用一次500μg/kg剂量的艾塞那肽(游离和包封在rm-lnc内)和同等浓度的rm-lnc或水。引人注意的是，我们发现exermlnc处理使血糖完全正常化，因为这些小鼠的血糖在整个口服葡萄糖激发过程中与血糖正常的对照瘦小鼠的血糖图谱相同(图5)。与之相反，exe处理的小鼠在30分钟时测得的葡萄糖水平与hfd喂养的小鼠的葡萄糖水平相似，然后保持高于exermlnc处理的小鼠的葡萄糖水平至90分钟(图5)。exermlnc能够显著降低血浆葡萄糖水平和葡萄糖曲线下面积(auc)(图6)。重要的是，观察到与对照组(对照和hfd)相比，rmlnc和exermlnc处理组的总glp-1水平均显著增加，这证实了纳米系统本身在病理条件下刺激glp-1释放的能力。仅exermlnc组与hfd组相比显著降低了胰岛素抵抗指数(图7)。[0256]有趣的是，与未经处理的hfd小鼠相比，单独rmlnc具有降低血液葡萄糖水平的作用。然而，从降低高血糖症的角度来看，这种作用是不够的。一项测量hfd小鼠中艾塞那肽水平的药代动力学研究证实，与溶液中的艾塞那肽相比，当在rmlnc内口服施用艾塞那肽(exe-rm-lnc)时，艾塞那肽血液浓度显著增加(与lnc的相对生物利用度为4.32％，p《0.001)。由于已知肽已进入开发后期，预估其生物利用度为0.5-1％，因而可以认为该相对生物利用度是一个高数值且改善巨大。表5中总结了所计算的药代动力学参数。[0257]表5：肥胖/糖尿病小鼠体内研究中s.c.艾塞那肽(50μg/kg)、口服艾塞那肽(500μg/kg)和口服exermlnc(500μg/kg)的药代动力学参数。根据单向anova和随后的tukey事后检验，p值具有显著差异(ap《0.01和bp《0.001)。显著性表示为与艾塞那肽口服组相比。[0258][0259]我们在正常血糖(图3)中相比hfd小鼠(图8)观察到了不同的艾塞那肽药代动力学图谱(例如，不同的cmax、auc、tmax)。结合增加的艾塞那肽血液水平和增加的内源性glp-1水平，这些数据作为有力的概念证明，显示了所开发的纳米系统在改善t2dm症状方面的有效性。[0260]进一步研究了exe与exermlnc在用hkd处理8周和10周的小鼠中的影响，因为这个模型是在小鼠中饮食诱导糖尿病和代谢紊乱的更有力的模型。对于ogtt期间exermlnc对降低血液葡萄糖水平的效果，获得了相同的结果，而无论疾病的长期性(chronicity)如何(图9a-b)。[0261]2.4–慢性exermlnc长期治疗改善了肥胖和糖尿病小鼠的葡萄糖代谢[0262]为了评估exermlnc的慢性长期治疗对葡萄糖代谢的影响，将易患肥胖/糖尿病的小鼠进行8周的hfd，然后进行5周的hfd并每天施用500μg/kg艾塞那肽(口服)(exe-rm-lnc)或等量的未装载的脂质纳米囊(rm-lnc)或溶液或水中的游离艾塞那肽(exe)。为了比较这个实验性治疗与现有治疗策略的作用，还包括了用市售的皮下形式的艾塞那肽处理的组。将口服施用艾塞那肽与皮下注射(s.c.)10μg/kg艾塞那肽溶液或进行比较。[0263]每天处理持续5周后，处死小鼠，并从门静脉和腔静脉(cavavein)采血。有趣的是，处理5周后，仅exermlnc能够降低血浆葡萄糖水平，达到与对照组相当的水平(图10a-b)。值得一提的是，exermlnc处理的小鼠与rmlnc处理的小鼠相比具有显著降低的血糖水平。rmlnc组的血浆葡萄糖水平也显著低于exe处理组。因此，这些数据证明了exermlnc对葡萄糖稳态的协同作用。这种作用可能归因于rmlnc引发的内源性glp-1分泌和升高的艾塞那肽血浆水平的结合。此外，exermlnc处理的小鼠和皮下处理的小鼠表现出与对照组相当的胰岛素水平(图11)。尽管当通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验分析数据时，这种与hfd组相比的降低没有达到统计学显著性，但当通过曼-惠特尼检验分析时具有显著差异(exermlnc相比于hfd的p＝0.04)。[0264]2.5–exermlnc慢性(chronic)治疗减少了肥胖/糖尿病小鼠中饮食诱导的脂肪变性[0265]我们发现，在处理5周(hfd喂养13周)后exermlnc处理组中的肝脏重量与hfd喂养组相比显著较低(图12)。油红o染色后的组织学分析显示，与hfd小鼠相比，exermlnc处理的小鼠中的肝脏脂质累积较低，且脂滴更少和更小(数据未显示)，证明了肝脏脂肪变性显著减少。[0266]尽管对甘油三酯水平的影响很小，但exermlnc处理的小鼠和皮下处理的小鼠中的肝脏总脂质含量和胆固醇水平是相当的，并且显著低于hfd组(图13a-c)。[0267]最重要的是要注意，与所有其他治疗方法相比，使用exermlnc的本发明方法在降低肝脏重量方面更有效，并且与典型施用途径(s.c.)的市售药物一样有效，由此清楚地证明了，与目前的皮下方法相比，对葡萄糖参数的作用更好且对肝脏标志物具有非劣效性。[0268]除了生化和组织学分析外，还通过定量pcr分析了肝脏和内脏脂肪组织(vat)中与免疫细胞群体的浸润/募集(f4/80、cd11c、mcp1)、炎症(tnfa)和脂质代谢(fasn、pparg、cpt1a)相关的关键标志物。在肝脏中，exermlnc处理的小鼠的cd11c和mcp1mrna表达显著低于hfd组(分别为p＝0.05和p＝0.0355)，并且在处理组中观察到同样的作用(分别为p＝0.0015和p＝0.0007)。[0269]内脏脂肪量被认为是发生肝病和胰岛素抵抗的危险因素(perseghin,diabetescare.2011；34suppl2,s367-370；lebovitz&banerji,diabetescare.2005；28,2322-2325)。发现exermlnc处理组和处理组均显示与hfd喂养小鼠相比较少的脂肪，这些组的脂肪含量与未经处理的对照组的脂肪含量无显著差异(图14a-e)。当通过曼-惠特尼检验进行分析时，它们的重量有非常显著的差异(exermlnc相比于hfd的p＝0.0057，相比于hfd的p＝0.0004)。有趣的是，根据anova，在hfd组中观察到的f4/80的较高表达仅在exermlnc处理的小鼠中显著下调。与hfd组相比，对其他标志物(cd11c、mcp1、fasn、pparg、tnfa)没有显著影响。[0270]2.6–讨论[0271]尽管不间断地进行着大量努力，但将t2dm的可注射疗法转变为口服药物递送策略仍然是一个挑战。因此，目前市面上glp-1类似物的治疗仍仅限于皮下施用。旨在提供肽的替代药物递送系统的研究极为重要，从而充分利用口服施用途径的潜力。然而，目前口服肽递送的现有策略仅将递送系统用作媒介物，而都没有探究载体可能对最终制剂具有额外治疗作用的可能性。在基于肠降血糖素的糖尿病治疗的情况下，内源性glp-1分泌的增强代表了一种新的替代性治疗，其更近似于肽的生理学。本发明提供了一种基于脂质的药物递送系统，即脂质纳米囊，其对(i)所包封的合成glp-1类似物的递送和(ii)内源性glp-1分泌的刺激具有双重治疗作用。[0272]该递送系统开发中的一个主要挑战是将亲水性肽包封在脂质核心内，同时保留脂质纳米囊的物理-化学性质。为了这个目的，首先将艾塞那肽捕获在反胶束内，而反胶束本身转而又被包括在脂质纳米囊的内部脂质核心中。这种策略能够使glp-1拟似物包封在基于脂质的纳米载体中，而不会改变它们的结构并保持它们对l细胞激活的效力，从而引发内源性glp-1分泌。[0273]装载有艾塞那肽的脂质纳米囊诱导glp-1分泌的能力已在体外在鼠和人l细胞中以及在体内在正常血糖小鼠中得以证实(图2a-b)。此外，我们进行了药代动力学研究，证实了艾塞那肽被吸收到体循环中(图3)。本文提供了关于以下的证据：制剂稳定性、纳米系统保持肽完整性的能力、其在体内增加glp-1水平同时能够使肽被吸收到体循环中的能力，以及最终所述制剂在hfd诱导的肥胖/糖尿病小鼠模型的病理学背景下的功效。[0274]首先评估了我们的双重作用纳米系统在急性治疗(actuetreatment)后改善肥胖/糖尿病小鼠体内血糖的效用。在单急性施用和随后的ogtt测试之后，exermlnc处理的小鼠的血糖水平恢复正常，与对照组相当。尽管空白的和装载有exe的脂质纳米囊与未处理的组或exe溶液处理的组相比均显示出glp-1水平升高，但观察到仅exermlnc处理的小鼠显示出胰岛素抵抗指数显著降低。肥胖/糖尿病小鼠的药代动力学分析证实，exermlnc将艾塞那肽的生物利用度提高至超过4％。这些数据提供了证据，证明了双重作用药物递送纳米系统通过结合增加的内源性glp-1水平和增加的肽生物利用度来改善血糖的有效性。[0275]为了证明该纳米系统代表了t2dm治疗中用于递送肠降血糖素肽的当前皮下方案的替代方案，进行了由五周每日施用方案组成的慢性/长期治疗。评估了纳米系统对葡萄糖稳态和脂质代谢的影响。5周的治疗之后，exermlnc处理的小鼠显示出正常化的血糖水平，与未处理的对照小鼠相当，同时胰岛素水平降低。因此，观察到的有益作用不仅限于纳米载体的急性作用，还转化为对口服葡萄糖耐受的治疗作用。[0276]总之，装载有艾塞那肽的脂质纳米囊可有效降低高血糖症和高胰岛素血症。[0277]值得注意的是，这种方法在葡萄糖稳态方面与目前市售的皮下施用药物具有相当的结果。因此，这些结果证明了这种方法的非劣效性以及口服施用途径对慢性治疗的益处。[0278]这些数据还表明了降低肝脏和内脏脂肪组织中与免疫细胞群体(巨噬细胞、树突细胞)的浸润和募集相关的关键标记物和炎症标记物的强烈趋势，再次凸显了这种方法对此类标记物的有益作用。f4/80是炎性细胞浸润(成熟的巨噬细胞)的标志物，而已知cd11c、mcp1和tnfa反映了肥胖相关炎症期间的m1巨噬细胞表型。需要注意的是，exermlnc是唯一显著降低内脏脂肪组织中f4/80基因表达的处理。在肥胖中，脂肪组织中的巨噬细胞浸润导致慢性炎症，它被认为是胰岛素抵抗和糖尿病的触发因素(weisbergetal.,clininvest.2003；112,1796-1808)。然而，小鼠中巨噬细胞的消融(ablation)与葡萄糖稳态的正常化相关(hernandezetal.,cellmetab.2014；20,499-511)。从机理的角度来看，我们先前表明了rmlnc增加glp-1以及可能的辅肽(co-peptide)glp-2的分泌(这已证明可以增强肠道屏障功能)，从而减少肥胖啮齿动物中的细菌化合物易位、炎症和脂肪变性(canietal.,gut.2009；58,1091-1103)。[0279]在不希望受到理论约束的情况下，使用exermlnc或rmlnc，每日口服强饲(oralgavage)可以全天刺激肠道肽的产生，并因此可有助于维持hfd喂养的小鼠的更好的代谢状况。无论如何，每日慢性施用足以改善新陈代谢，并且甚至使其他标志物正常化。最后，脂质纳米囊可以调节dpp-iv的活性，从而保持增加的体内循环总glp-1水平。[0280]实施例2：工作例2[0281]1.材料和方法[0282]1.1–材料[0283]艾塞那肽(醋酸艾塞那肽)(exe)购自(bubendorf，瑞士)。wl1349(辛酸/癸酸甘油三酯)和(油酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)由gattefossé(saint-priest，法国)友情提供。s100(磷脂酰胆碱含量为94％的大豆卵磷脂)受赠于lipoidgmbh(ludwigshafen，德国)。hs15(游离peg660和peg66012-羟基硬脂酸酯的混合物，mw870da)和80(脱水山梨糖醇油酸酯)购自sigma-aldrich(st.louis，美国)。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-甲氧基聚(乙二醇)2000(dspe-peg2000-ch3)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[聚(乙二醇)-2000]-丙酸酯(dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh)获自nanosoftpolymers(winston-salem，美国)。卵磷脂、氯化钠(nacl)、皂苷(saponin)、胃蛋白酶、triton-x100、牛磺胆酸钠和二甲基亚砜(dmso)、3-(4,5-二甲基-噻唑基-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)购自sigma-aldrich(st.louis，美国)。totalglp-1(版本2)和活性glp-1测定试剂盒购自mesoscalediscovery(maryland，美国)。exendin-4酶免疫测定试剂盒购自phoenixeuropegmbh(karlsruhe，德国)。ultrasensitivemouseinsulinelisa试剂盒购自mercodiaab(uppsala，瑞典)。matrigeltm获自bdbioscience(比利时)。二肽基肽酶iv(dpp-iv)抑制剂购自millipore(st.charles，美国)。还使用了达尔伯克改良伊格尔氏培养基(dmem)-glutamax(5.5mm葡萄糖)、胎牛血清(fbs)、青霉素-链霉素(p/s)、胰蛋白酶(0.25％)-edta(0.02％)和磷酸盐缓冲盐水(pbs)，且它们购自thermofisherscientific(invitrogen，比利时)。did(diic18(5)固体(1,1'-十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰菁,4-氯苯磺酸盐))从thermofisherscientific(invitrogen，uk)获得。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级。[0284]1.2–非靶向纳米颗粒和靶向纳米颗粒的制备和表征[0285]1.2.1–非靶向和靶向的基于脂质的纳米系统的制备[0286]如实施例1所述地制备含有包封有艾塞那肽的反胶束(exerm)和修饰的脂质纳米囊(lnc)的非靶向脂质纳米系统(exermlnc)。首先，通过高速搅拌由比例1:5w/w的80(表面活性剂)和wl1349(油)组成的混合物，来制备包封有艾塞那肽的反胶束(exerm)。在搅拌过程中，将50μl药物溶液(含艾塞那肽30mg/ml的milliq水)滴入混合物中。然后，通过稍作修饰的相转化方法产生lnc。将769.5mgwl1349、85.5mg13.4mgs100、120mghs15、50mg氯化钠(nacl)和1.025mlmilliq水的混合物以200rpm搅拌5分钟。进行三次渐进式加热/冷却循环(在50℃和67℃之间)。在最后一个循环中，当温度比相转化区(piz；59至61.5℃)高约3℃时，向混合物中添加500μl预热的exerm。最后，在高速搅拌2分钟下添加2.5ml冷水以达到piz温度。使用相同方案但不添加药物溶液来产生空白的非靶向纳米系统(rmlnc)。[0287]1.2.2–did标记的非靶向和靶向的基于脂质的纳米系统的制备[0288]通过向混合物中添加225μgdid来制备did标记的rmlnc。即，向小瓶中添加45μldid(5mg/ml的乙醇溶液)，然后在水浴中加热直至有机溶剂完全蒸发。随后，将wl1349添加到同一小瓶中，并在水浴中与did混合，直至did完全溶解在油相中。然后将混合物冷却至室温(约20℃)，添加其他组分，并如上所述地继续制备过程。[0289]1.2.3–含或不含丙酸酯的聚乙二醇化的装载有反胶束的脂质纳米囊的制备[0290]通过分别将dspe-peg2000-ch3或dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh与浓度为5mg/ml的rm-lnc在37℃下温和搅拌4小时，来制备含或不含丙酸酯的聚乙二醇化的装载有反胶束的脂质纳米囊(分别为rmlncpeg或rmlncpeg-pro)。在孵育过程中，每15分钟将悬浮液涡旋一次，然后在冰浴中冷却1min。[0291]1.3–艾塞那肽的定量[0292]通过高效液相色谱法(hplc，shimadzu，日本)，使用如实施例1所述的梯度法(参见1.4)来定量包封在聚乙二醇化rmlnc内的艾塞那肽。[0293]1.4–np的表征[0294]如实施例1所公开地(参见1.5)，测定聚乙二醇化rmlncnp的平均直径、多分散性指数(pdi)、zeta电位和药物包封效率(ee，％)。[0295]1.5–受刺激的胃肠液中的纳米囊稳定性和药物释放[0296]1.5.1–聚乙二醇化纳米囊在受刺激的胃肠液中的稳定性[0297]如实施例1所公开地(参见1.6)，评估含或不含作为配体的丙酸酯的聚乙二醇化exermlnc的体外稳定性。[0298]1.5.2–体外药物释放研究[0299]如实施例1中所公开地(参见1.7)，分别在不存在胃蛋白酶的fassgf中2小时和在fassif培养基中6小时，来评估聚乙二醇化exermlnc的药物释放。[0300]1.6–体外细胞研究[0301]1.6.1–细胞培养[0302]鼠肠道l细胞系glutag由danieldrucker博士(加拿大多伦多大学)友情提供。使用第17代至25代的glutag细胞。将细胞于37℃下在5％co2供应下，在补充有10％(v/v)灭活fbs和1％(v/v)p/s的dmemglutamax(5.5mm葡萄糖，完全dmem培养基)中生长。每4-5天将细胞传代一次。[0303]1.6.2–细胞毒性研究[0304]使用先前使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-(2,5-二苯基溴化四唑)(mtt)比色测定法(xuetal.molpharm.2018；15:108-115)计算的纳米颗粒浓度，在glutag细胞中对未装载的聚乙二醇化rmlnc纳米囊进行体外细胞毒性研究。将glutag细胞(每孔5x104个细胞)接种在matrigeltm包被(10μl/ml培养基)的96孔板上。[0305]用预温的pbs缓冲液(x3)洗涤平板后，将100μl的纳米颗粒悬浮液以增加的纳米囊浓度(0.5-10mg/ml)分散在dmem-glutamax培养基(不含fbs)中，并在37℃下与glutag细胞共孵育2小时。孵育后，用100μl0.5mg/mlmtt替换上清液3小时。将紫色甲瓒晶体溶解在200μldmso中，使用multisksanex平板读取器(thermofisherscientific，美国)在560nm处测定吸光度。利用triton-x100的细胞(100％死亡)和利用培养基的细胞(100％存活)分别视为阳性和阴性对照。测试一式三份进行。[0306]1.6.3–体外glp-1分泌[0307]将glutag(每孔1.8x105个细胞)接种到matrigeltm包被的24孔细胞培养板上，并使其粘附24小时。第二天，使用预温的pbs轻柔洗涤平板。然后将glutag细胞与不含fbs的dmem-glutamax或未装载的聚乙二醇化np(含或不含配体的rmlnc纳米囊)共孵育。培养基中含有最终浓度为50μm的dpp-iv抑制剂(st.charles，mo，美国)。为了测试不同纳米颗粒浓度对glp-1分泌的影响，我们分别使用了0.5-2mg/ml纳米囊和0.1-3mg/ml纳米颗粒浓度。方案描述在实施例1中(参见1.9)。[0308]1.7–体内研究[0309]1.7.1–动物[0310]所有涉及动物研究的方案均经鲁汶天主教大学(universitécatholiquedelouvain)动物实验伦理委员会批准(2018/ucl/md/45；实验室协议la1230418)，并根据比利时关于保护实验动物的立法(2013年5月29日皇家法令)进行。[0311]1.7.2–正常血糖小鼠中结合有配体和未结合有配体的聚乙二醇化np的总glp-1分泌[0312]为了测试聚乙二醇化rmlnc(含或不含丙酸酯)，将c57bl/6j雄性小鼠(20-25g，10周；janvierlaboratories，法国)随机分为四组(每组8只小鼠)，并用约1.62mg/g纳米囊剂量处理，如实施例1中所公开(参见1.10)。[0313]1.7.3–纳米囊在肥胖/糖尿病小鼠小肠和结肠中的分布[0314]将雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)随机分为4组(每组n＝4)。适应(2周)后，小鼠接受10周hfd喂养(含60％脂肪和20％碳水化合物(kcal％)的啮齿动物饮食)(d12492i，researchdiets，美国)。在实验前，将小鼠禁食整夜，并可以自由饮水。为了评估纳米囊在小肠和结肠中的分布，通过口服强饲施用did标记的纳米囊，包括rmlnc、聚乙二醇化rmlnc和聚乙二醇化rmlnc-pro(约1.62mg/g纳米颗粒剂量)。对照小鼠口服施用等量的milliq水。在施用后1小时切下十二指肠、空肠、回肠和结肠切片，随后在最佳切割温度化合物(optimalcuttingtemperature，oct)中迅速冷冻。对于所有组织，使用leicacm-3050-s低温控制器切割6μm厚的切片。将组织切片在4％多聚甲醛中短暂固定5分钟。用含有0.02％聚山梨酯20的pbs洗涤后，用含有dapi的vectashieldhardset封固培养基来封固载玻片。使用zeiss共聚焦显微镜(lsm150)通过clsm检查样品，以捕获系列图像。使用axiovision软件(版本4.8)分析数据。[0315]1.7.4–从肥胖/糖尿病小鼠肠道中提取粘液[0316]将未经处理的10周hfd诱导的糖尿病小鼠禁食整夜，并且可以自由饮水。在提取粘液之前，通过颈椎脱位处死小鼠。以下方案改编自wangetal.(bio-protocol.2017；7:e2394)。简言之，将十二指肠和空肠顶端解剖并置于petri皿中，然后用pbs轻柔冲洗以去除肠内的贴附物质。使用带有19.5号针头的注射器通过肠段的一个开口端轻柔递送pbs。使用外科剪刀纵向切割肠段。然后，使用细胞刮刀(1.8cm刀片，)刮去肠段的粘液并转移到干净的管中。将分离的粘液储存在-20℃下，用于进一步的粘液扩散和粘液稳定性研究。[0317]1.7.5–单颗粒跟踪和共聚焦显微镜[0318]将didrmlnc、didrmlncpeg和didrmlncpeg-pro稀释于水或小鼠的小肠粘液中，并通过轻柔搅拌进行混合。将5μl体积置于显微镜玻片上，玻片用粘合垫片(s24737，secure-sealtmspacer，thermofisher)和盖玻片(#1.5)密封。[0319]对于单颗粒跟踪，使用配备有mlc400b激光箱(agilenttechnologies,santaclara,ca,美国)、yokogawacsu-x1共聚焦旋转盘装置(andor,belfast,uk)、ixonultra-emccd摄像机(andorbelfast,uk)和niselements软件(nikon，日本)的旋转盘共聚焦显微镜(nikoneclipseti,tokyo,日本)记录荧光信号。使用100x油浸物镜(planapovc100xoil，1.4na，nikon，日本)。在成像过程中，使用台顶孵育箱(stage-topincubator)(37℃，tokaihit)和物镜加热器(biotechs)。在盖玻片上方5-10μm处记录100帧时间分辨率为43.9ms的影片。由于纳米囊累积在粘液的不同部分或荧光标记泄漏，无法进行进一步分析，因此无法再看到或分析单个纳米囊。[0320]用激光扫描共聚焦显微镜对为单颗粒跟踪制备的样品进行研究。使用流电扫描仪(galvanoscanner)在配有60x/1.27planapoir浸水物镜(srplanapoirac，nikon)的nikona1rhd共聚焦激光扫描显微镜上记录图像。使用637nm波长(lu-n4laserunit)激发did。用multi-alkalipmt(a1-dag-2gaaspmultidetectorunit)检测荧光信号。记录奈奎斯特分辨率(nyquistresolution)下，玻璃表面上方19.5μm的步长为0.5μm的堆栈(stack)，并创建最大强度投影用于可视化。所有成像均在rt下进行。[0321]1.7.6–hfd诱导的肥胖/糖尿病小鼠的药理学研究[0322]随机饲养雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)(每笼5只)。在利用正常饮食(ain93mi，research美国)的适应期(2周)后，给小鼠喂食hfd10周。在实验前将笼子随机分为5组(每组10只小鼠)。将小鼠禁食整夜，然后口服强饲游离药物溶液(exe)(剂量：500μg/kg)、非聚乙二醇化或聚乙二醇化的装载有药物的纳米系统(exermlnc或exermlncpeg)(剂量：500μg/kg)或空的聚乙二醇化纳米系统(rmlncpeg)(剂量：与其他组相等的纳米囊浓度)。对照hfd组口服施用等体积的无菌水。如实施例1中所示，在口服施用上述制剂后1小时，进行口服葡萄糖耐受测试(ogtt)。简言之，口服施用葡萄糖(2g/kg)，然后用葡萄糖计(accucheck，roche，瑞士)测定血液葡萄糖，在葡萄糖载荷前30分钟(-30分钟)和葡萄糖施用后0、15、30、90和120分钟测量尾静脉端的血液。还使用elisa试剂盒(分别为mercodia,uppsala,swedenandmesoscaledelivery,美国)在-30分钟和15分钟从尾静脉采集的血液样品的血浆中测量血浆胰岛素和总glp-1水平。通过将ogtt期间血液葡萄糖和胰岛素两者的auc相乘来计算胰岛素抵抗指数。在ogtt测试结束时，用异氟醚(forene，abbott，england)麻醉小鼠，并从门静脉采集血液样品。通过elisa检测活性glp-1水平(mesoscaledelivery,gaithersburg,美国)。[0323]1.7.7–肥胖/糖尿病小鼠的药代动力学研究[0324]将雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)饲养2周以适应，并随机分为两组(每个时间点10只小鼠)。接下来，小鼠接受hfd喂养10周，如前节所述。所有小鼠在口服强饲前禁食过夜，并可以自由饮用无菌milliq水。以500μg/kg的剂量口服施用艾塞那肽溶液和exermlncpeg。在预定时间点(0、0.5、1、1.5、2、4、6和8小时)，从尾静脉端采集血液样品，离心(1,500g，4℃下10min)，并进行血浆提取，然后在-80℃下储存直至进一步分析。使用elisa试剂盒(ek-070-94，phoenixeuropegmbh，karlsruhe，德国)测定艾塞那肽的血浆浓度。[0325]1.7.8–肥胖/糖尿病小鼠中以不同口服施用频率的长期治疗[0326]将雄性c57bl/6j小鼠(8周龄)随机分为7组(每组10只)，并以每笼5只饲养，可自由获得无菌食物(ain93mi；researchdiet)(对照饮食)和无菌水。适应2周后，小鼠接受10周hfd或正常对照饮食。在这段时间后，用我们的制剂对小鼠进行额外一个月的处理，继续hfd喂养(总共14周hfd)。在这个月内，每天一次(d)或每两天一次(t)地在下午4点向小鼠口服施用(i)用空白的或装载有药物的聚乙二醇化制剂(500μg/kg剂量)，以相等的纳米囊浓度每日进行处理(rmlncpeg-d或exermlncpeg-d)和(ii)非聚乙二醇化或聚乙二醇化的装载有药物的制剂(500μg/kg剂量)，每隔一天进行处理(exermlnc-t或exermlncpeg-t)。每天向对照组(健康组和hfd)口服施用等体积的无菌milli-q水。在这个4周的治疗期内，每天记录小鼠体重，并每周监测一次血糖。每周一次在葡萄糖测试之前将小鼠禁食6小时。[0327]1.8–统计学分析[0328]使用graphpadprism8程序(ca，美国)进行数据分析。在进行所有分析之前，在各组中针对异常检测进行grubbs检验。在进行分析之前，当各组之间的方差存在显著差异时，使用对数转换将数值标准化。对含多于两个组的研究，使用双向或单向anova和随后的tukey事后检验进行统计学分析，对于两个组，使用t检验或曼-惠特尼检验进行统计学分析。当组之间的方差即使在标准化后仍存在显著差异时，进行非参数检验。当p《0.05时，认为具有统计学显著性。所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(sem)。[0329]2.结果和讨论[0330]2.1–具有丙酸酯作为靶向部分的聚乙二醇化纳米颗粒的制备和表征[0331]为了开发靶向l细胞的基于脂质的纳米囊，选择dspe-peg2000作为聚乙二醇化连接剂，以向纳米囊提供增强的粘液扩散能力。选择插入后方法(post-insertionmethod)，以确保peg链仅位于表面上，而不保留在颗粒核心内。dspe-peg2000-och3和dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh均用于提供对存在于其表面的l细胞gpcr的特异性靶向。在dspe-peg2000-och3和dspe-peg2000-ch2-ch2-cooh两者的插入后(post-insertion)方法之前(rmlnc)和之后(分别为rmlncpeg和rmlncpeg-pro)，评估空脂质纳米囊的物理化学性质(表6)。[0332]表6：具有不同修饰的装载有exe的或未装载的或did标记的rmlnc的物理化学表征[0333][0334]空白lnc显示出约200nm的颗粒大小和窄的大小分布(pdi＝0.18)。在将lnc与生物功能性聚合物孵育后，观察到rmlncpeg和rmlncpeg-pro的大小分别增加～18nm和～27nm。zeta电位值从-0.94mv(rm-lnc)显著降低至-9.93mv(rmlncpeg)。rmlncpeg-pro的表面电荷降低得甚至更多，在脂肪酸存在下达到-18.20mv。与各自的空白纳米囊相比，在用did标记纳米载体后获得了相似的颗粒大小和zeta电位(表6)。此外，当将艾塞那肽包封在聚乙二醇化纳米囊内(exermlncpeg)时，对纳米囊的大小和表面电荷也没有显著影响(表6)。[0335]2.2–聚乙二醇化np在体外和体内均诱导glp-1分泌[0336]首先在glutag细胞(鼠l细胞)中研究了未装载的、聚乙二醇化的且接支有丙酸酯的rmlnc在体外诱导glp-1刺激的能力。在低于4mg/ml的浓度未观察到细胞毒性的证据后，纳米颗粒浓度范围为0.5mg/ml至2mg/ml。如图15a-b所示，所有基于脂质的制剂均能够在l细胞中显著增加体外内源性glp-1分泌，而无论纳米颗粒浓度如何(**p《0.05)。[0337]进一步测试了这些纳米囊是否能够在正常血糖小鼠中在体内进一步增强和/或诱导glp-1刺激。当口服施用给正常血糖小鼠时，两种聚乙二醇化脂质纳米囊(分别为rmlncpeg和rmlncpeg-pro)和非聚乙二醇化脂质纳米囊(rmlnc)在施用后60分钟显著增加glp-1水平(*p《0.05)(图16)。值得注意的是，在60分钟时，rmlncpeg使glp-1水平增加高达～8倍，而rmlncpeg-pro与原始的未修饰的rmlnc具有相同的作用，与未经处理的对照组相比使glp-1分泌增加高达～4倍。此外，与对照组相比，仅rmlncpeg在180分钟时延长了这种作用(*p《0.05)。尽管聚乙二醇化np在体外与非聚乙二醇化np相比并没有发挥显著作用(图15a-b)，但聚乙二醇化能够显著改善和延长纳米载体在体内诱导glp-1分泌的能力。[0338]2.3–肥胖/糖尿病小鼠小肠和结肠中的纳米颗粒分布[0339]在对10周hfd喂养的小鼠进行体内口服强饲后，追踪纳米胶囊在肠道不同段中的分布。通过荧光纳米颗粒的方法，测试向hfd小鼠口服施用后，did标记的纳米胶囊在小肠和结肠内的累积。所有荧光颗粒(didrmlnc、didrmlncpeg和didrmlncpeg-pro)均可以在十二指肠中找到，其中didrmlncpeg组与其他组相比显示出最强的红色荧光(did)。[0340]为了研究粘液扩散的潜在差异，进行了单颗粒追踪。为了这个目的，将颗粒与小肠粘液混合，置于定制的玻璃区室中，并在旋转盘显微镜上观察。然而，由于观察到的颗粒数量与水中的颗粒相比明显减少，因此无法在体外测定小鼠小肠粘液中的颗粒扩散。使用共聚焦显微镜，观察到与仅粘液相比，针对所有制剂的荧光强度增加的大结构，这表明了与粘液组分的聚集和/或结合。由于无法对单个纳米囊的活动性进行研究，因此无法得出不同制剂之间的净活动性(netmobility)是否存在任何差异的结论。[0341]施用后1小时，观察到did标记的rmlnc主要在十二指肠中，在空肠中几乎没有。有趣的是，处理后一小时，仅rmlncpeg能够穿过空肠的肠上皮，与其他组相比，在上皮基底层观察到高水平的红色荧光。此外，仅rmlncpeg能够穿过整个小肠(十二指肠、空肠和回肠)并到达结肠。[0342]2.4–肥胖/糖尿病小鼠的药理学和药代动力学研究[0343]在评估制剂的体内功效之前，在模拟胃液和肠液中在体外证明了制剂的稳定性，并评估了艾塞那肽的释放图谱。[0344]为了确定装载有艾塞那肽的rmlncpeg(exermlncpeg)对2型糖尿病小鼠中的餐后高血糖症的治疗效果，在10周hfd喂养的小鼠中进行了药效动力学研究。在口服葡萄糖耐受测试(ogtt)之前，施用单剂量的纳米囊。在口服葡萄糖激发(葡萄糖浓度：2g/kg)前60分钟，口服施用500μg/kg艾塞那肽剂量(游离药物溶液和装载有药物的制剂(分别包括exe溶液、exermlnc和exermlncpeg))，空rmlncpeg(与每个装载有药物的纳米囊体积相等)，或相等的水体积。葡萄糖施用的时间点对应于0小时(图17a)。药物溶液处理的小鼠的血浆葡萄糖图谱显示出与接受水的hfd喂养小鼠相似的趋势。与之相反，所有纳米囊处理组，包括exermlnc、exermlncpeg和空rmlncpeg，均可显著降低血液葡萄糖水平和葡萄糖曲线下面积(auc)(图17a)。值得注意的是，空rmlncpeg与装载有艾塞那肽的rmlnc相比具有相似的降低血浆葡萄糖水平的功效和相似的auc，这表明聚乙二醇化后纳米载体独自实现的降血糖作用与包封有药物的非聚乙二醇化纳米载体相当。因此，发现了聚乙二醇化纳米囊分泌的glp-1水平(图16)对于降葡萄糖作用具有治疗重要性。值得注意的是，在所有测试的制剂中，在整个ogtt测试中，仅经exermlncpeg口服处理的小鼠显示出与未经处理的hfd小鼠相比显著降低的血糖水平。[0345]此外，与对照组相比，所有纳米囊处理组的总glp-1水平(图17b)也显著提高(*p《0.05)。尽管根据克鲁斯卡尔-沃利斯检验和dunn事后检验的分析，与hfd组相比，exermlnc组中总glp-1水平的增加并未达到显著差异，但当使用曼-惠特尼检验时观察到显著差异(p＝0.008)(图17b)。在ogtt测试后，与未经处理的hfd小鼠相比，在经exermlncpeg处理的小鼠门静脉中测量(施用制剂后3小时)的活性glp-1浓度也显著增加(*p《0.05)(图17c)。尽管当通过单向anova分析数据时，rmlncpeg和hfd之间没有显著差异，但通过学生t检验发现这些组之间存在显著差异(p＝0.028)。这些数据证实了聚乙二醇化能够在病理条件下提高纳米系统刺激glp-1释放并延长这种作用的能力。未观察到各组间胰岛素水平的差异(图17d)。然而，与未经处理的糖尿病小鼠相比，exermlncpeg可显著降低胰岛素抵抗指数(图17e)。尽管通过单向anova，exermlnc和rmlncpeg之间没有显著差异，但通过学生t检验发现这些组之间存在显著差异(分别为p＝0.035和p＝0.023)。引人注意的是，未装载的聚乙二醇化rmlnc与装载有exe的纳米囊相比获得了相当的结果，这进一步证实了通过聚乙二醇化获得的glp-1水平增加的治疗重要性。[0346]为了研究通过聚乙二醇化rmlnc口服递送艾塞那肽，进行药代动力学研究以评估在通过药物溶液或在rmlncpeg内(exermlncpeg)口服施用500μg/kg单剂量艾塞那肽后，艾塞那肽在慢性糖尿病小鼠(10周hfd；每点n＝10)中的口服吸收(图17f)。在口服强饲仅药物溶液或exermlncpeg后，在肥胖/糖尿病小鼠中观察到不同的艾塞那肽吸收模式。当以溶液口服施用时，艾塞那肽的血浆浓度在整个测试期间保持不变。与之相比，exermlncpeg在口服施引起所述肽的更大的全身吸收持续8小时，其tmax和cmax分别为1小时和27.91±1.22ng/ml。应当注意，在口服施用exermlncpeg与exermlnc后，观察到不同的艾塞那肽药代动力学图谱(例如，不同的cmax、auc、tmax)，这表明聚乙二醇化延长了制剂的循环时间(装载有药物的制剂的t1/2从1.68±0.35延长至5.69±1.02小时)，然后增加了包封的肽的全身吸收(auc从11.79±2.73增加至27.91±1.22ng·h/ml)。[0347]2.5–聚乙二醇化脂质纳米囊在肥胖/糖尿病小鼠中的长期治疗[0348]为了研究在聚乙二醇化后观察到的glp-1分泌增加对葡萄糖代谢的影响，对糖尿病小鼠(10周hfd)进行长期处理(一个月)，以不同的施用频率(每天一次或每隔一天一次)施用装载有艾塞那肽或未装载的rmlncpeg(500μg/kg)(共14周hfd，从第10周起每天或每隔一天施用，共4周)。较不频繁地通过口服施用(每隔一天一次)(exermlncpeg；500μg/kg)或使用等量未装载的聚乙二醇化纳米囊(rmlncpeg)处理的小鼠也与根据施用方案接受非聚乙二醇化的装载有exe的纳米囊(exermlnc；500μg/kg)的小鼠进行比较。[0349]处理4周后的血糖和胰岛素水平以及计算的homa-ir如图18a-c所示。每天施用的聚乙二醇化组(装载的或未装载的)和每隔一天施用的装载有exe的聚乙二醇化组表现出相当的血浆葡萄糖水平。这些水平转而与未经处理的非肥胖/糖尿病对照小鼠相当(p》0.05，图18a)。值得注意的是，只有当聚乙二醇化纳米囊包封exe时，在长期处理后才能有效降低血糖水平。更重要的是，即使较不频繁地施用，它们仍然有效，这是本研究的主要目标(图18a)。此外，通过胰岛素抵抗的稳态模型评估(homa-ir)分析，这些组表现出相等的胰岛素抵抗，其与健康对照组获得的对照值相当(p》0.05)(图18c)。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和随后的dunn事后检验，与hfd组相比，这些组之间的减少没有统计学显著性(图18c)。然而，当使用曼-惠特尼检验时，观察到显著差异(分别地，exermlncpeg-d相比于hfd的p＝0.0012；rmlncpeg-d处理相比于hfd的p＝0.0003；且exermlncpeg-t处理相比于hfd的p＝0.05)。[0350]2.6–结论[0351]综上，制剂的增加glp-1分泌和延长抗糖尿病作用可以通过纳米囊的聚乙二醇化实现。[0352]实施例3：比较实施例[0353]shresthaetal.(nanoscale2018，见上文)提供了与本文公开的本发明的纳米颗粒相比不同的基于脂质的纳米颗粒：纳米结构化的脂质载体(nanostructuredlipidcarrier，nlc)的体外数据。在与脂质纳米囊的区别中，nlc呈现固体核心而非本发明的脂质纳米囊的液体核心。在shresthaetal.中，艾塞那肽和利拉鲁肽被包封，并且证明了当呈现150nm的纳米颗粒大小时，这些nlc在体外诱导glp-1分泌。此外，在beloquietal.(molpharm，见上文)的研究中，开发了nlc(150nm)的glp-1分泌效应。在测试的不同纳米颗粒中，仅呈现150nm的纳米颗粒大小的nlc能够在体外诱导glp-1分泌。然而，在进一步的体内研究中，这些纳米颗粒不能诱导glp-1分泌，也不能降低高血糖症和高胰岛素血症。[0354]在4周hfd喂养的小鼠中进行体内研究(如实施例1中所示)。在口服葡萄糖耐受测试(ogtt)前，口服施用一次nlc包封的艾塞那肽(500μg/kg艾塞那肽剂量)。如图19所示，可以观察到对葡萄糖曲线下面积没有影响(图19a-b)，glp-1水平没有增加(图19c-d)，高胰岛素血症没有变化(图19e-f)，且对胰岛素耐受指数没有影响(图19g)。[0355]这些结果表明，两种基于脂质的纳米颗粒，推测呈现相似的组成，但不一定诱导相同的作用。当前第1页12当前第1页12
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