一种砗磲亲本原位催产方法与流程

1.本发明属于海洋农业中贝类繁育养殖技术领域，具体涉及一种砗磲亲本原位催产方法。


背景技术：

2.砗磲是软体动物门瓣鳃纲砗磲科生物的统称，有2属12种，广泛分布于从西太平洋到印度洋非洲东海岸的热带珊瑚礁海域。在我国有分布着8种砗磲，它们分别是砗磲属的大砗磲(tridacan gigas)、无鳞砗磲(tridacna derasa)、鳞砗磲(tridacna squamosa)、长砗磲(tridacna maxima)、诺瓦砗磲(tridacna nova)、番红砗磲(tridacna crocea)以及砗蚝属的砗蚝(hippopus hippopus)和瓷口砗蠔(hippopus porcellanus)。
3.我国南海珊瑚礁的澙湖、堡礁、岛礁的礁盘都是砗磲的原有分布海域，由于砗磲固着生活在热带浅层透明海域的习性使其极易被捕捞，环境恶化、人为盗捕等原因，导致砗磲数量锐减，大砗磲活体几乎灭绝，无鳞砗磲基本上功能性灭绝，其他砗磲也很少见。对此，中国科学院南海海洋研究所于2016年突破了砗磲的人工繁育技术，培育出5种砗磲和2种砗蠔的健康苗种，开展了砗磲在我国南海的增殖放流，实现了砗磲资源量增加。然而，人工底播增殖数量很难满足我国南海砗磲资源恢复需求量，对此，迫切需要开发一种高效率的催产技术，借助海浪、洋流等力量实现砗磲苗种大面积原位增殖，从而达到实现砗磲资源恢复的目的。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种简便易行、效果显著的砗磲亲本原位催产方法。
5.本发明的砗磲亲本原位催产方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.a、性腺监测：在我国南海野外岛礁海域、潟湖、环礁等地的5-30米水深无浪区环境中，通过潜水找到野生或人工移植砗磲分布群，进行定位，记录好亲本群站点位置，定期观察性腺发育情况；
7.b、原位催产：当性腺发育成熟时，潜水至砗磲群分布区，采用催产剂注射至外套膜中进行原位催产；
8.c、幼虫检查：亲本原位催产后，在潟湖、环礁等海域多点收集水中浮游生物，过滤大个体杂质；利用酒精固定后，观测幼虫数量；然后检测足面盘幼虫的丰度和数量；识别是不是砗磲幼虫、是哪一种砗磲子代、是不是原位催产子代；
9.d、催产效率评估：催产6-9个月后，检查原位催产站点所在的潟湖、环礁周边是否有 10-30mm左右的新生砗磲苗种，取回来若干个个体，进行亲子鉴定，检测其原位催产的效率，计算催产获得子代的数量。
10.优选，所述的步骤a中，砗磲分布群可以野生状态下的分布群，也可以是人工移植后的砗磲分布群，但是一定要达到性成熟年龄，确保可以产出精卵。
11.优选，所述的步骤b中，催产剂是五羟色胺溶液，其使用剂量为五羟色胺/砗磲总重
＝0.3-0.5mg/kg范围内。
12.优选，所述的步骤c中，特异性的分子标记是指可以同时区分3-5种以上砗磲的复合 pcr引物组合，可以有效的区分幼虫的组成及其亲本来源。例如参见ma,h.,feng,h.,zhang, y.,qin,y.,xiang,z.,li,j.,zhang,y*.,yu,z*.multiplex species-specific pcr identification ofnative giant clams in the south china sea:a useful tool for application in giant clam stockmanagement and forensic identification.aquaculture 2021,531:735991。
13.优选，所述的步骤d中，通过单位面积砗磲子代数量、种类，亲子识别技术，评估原位催产效率极其为其资源恢复的可行性。
14.优选，所述的步骤a中是用gps进行定位。
15.优选，所述的定期观察性腺发育情况是通过肉眼观察 显微取样相结合的办法定期观察性腺发育情况。
16.优选，所述的步骤b中，在进行原位催产时，为了获得纯种砗磲资源，每次注射只选择一种砗磲进行注射；为了保障配子的交配效率，催产时间控制在1h内；为了减小野外天敌对配子的食用概率，催产时间选择在夜间8-10点；为了提高卵子使用效率，先搜集排放中的卵子，之后散开与新排出精子结合，促使受精卵随着海浪漂流。
17.优选，所述的步骤c的幼虫检查为：亲本原位催产24h后，利用300目筛绢网在潟湖、环礁等海域多点收集水中浮游生物，采用大网目过滤大个体杂质；利用酒精固定后，观测幼虫数量；原位催产7d后，再一次检测足面盘幼虫的丰度和数量；为了确定是不是砗磲幼虫、是哪一种砗磲子代、是不是原位催产子代，需要用特异性的分子标记进行识别。
18.优选，所述的步骤d的取回来若干个个体，进行亲子鉴定，检测其原位催产的效率，计算催产获得子代的数量是取回来若干个个体，进行亲子鉴定，以催产亲本和野外苗种的 dna为材料，利用微卫星等标记来检测其原位催产的效率，计算催产获得子代的数量。
19.本发明不同于砗磲全人工繁育方法，筛选野外半封闭潟湖等环境作为催产场，夜间进行原位催产，尽最大努力模拟人工苗种生产过程，规避风险和敌害，批量化获得与野生苗种一致的人工催产型苗种；结合现代分子标记技术进行亲子识别，评估其原位催产效应。本发明充分利用了砗磲幼虫期浮游特性，借助于海浪、洋流等实现大面积扩散，形成部分砗磲苗种聚集区，为今后砗磲繁育提供充足的亲本，为我国南海砗磲资源快速修复提供技术保障。本发明具有简便易行、效果显著等优点。
具体实施方式：
20.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
21.实施例1：
22.a、亲本促熟：2020年3月中旬，在我国西沙群岛永兴岛潟湖的10m水深无浪区环境中，2 个潜水员对其砗磲资源进行了调查，发现了13个成体诺瓦砗磲(壳长在20-30cm)，分布在 3m2的面积内，利用gps定位了该站点；通过肉眼观察，发现其性腺部位呈现橘红色，说明性腺尚未成熟，利用注射器抽取了一点点性腺部分组织，发现小部分精子可以跳动，卵子直径在80-90μm，尚未达到成熟；直至5月1日，通过gps定位，找到该站点，潜水后发现这些诺瓦砗磲性腺呈现棕黄色，说明已经成熟，进一步采用显微镜检测，发现精子活跃，卵子直径
100μm，卵黄颜色深，说明卵子已经成熟；
23.b、原位催产：当其性腺发育成熟后，潜水员在夜间8点，带着防水手电进行夜潜，找到砗磲群后，利用注射器按照0.3mg/kg剂量五羟色胺溶液注射至10个诺瓦砗磲的外套膜中，2-3min后，诺瓦砗磲开始排放精子，大约持续了15min，停止了10min左右，开始排放卵子；潜水员用事先准备好的400目网袋收集卵子；之后在给另外3个诺瓦砗磲催产，当期其喷放精子时，将收集的卵子散置于雾状精子中，实现了受精作用，之后受精卵随着海浪飘流；整个催产过程大约持续了60min，之后潜水员回到潟湖岸边；
24.c、幼虫检查：5月2日夜间8点，潜水员利用300目筛绢网在潟湖收集水中浮游生物，之后利用100目筛绢网过滤，收集生物用95％酒精固定；之后带回中国科学院西沙海洋观测站实验室，利用显微镜发现潟湖中有一定数量的d形幼虫，大概密度为25个/m3，按照潟湖水体估算1000亩
×
667平方米
×
3米水深＝200.1万水体，整个过程中大约有5002.5万d形幼虫；为了确定这些幼虫是否砗磲幼虫，是否是催产幼虫，开展了分子鉴定(具体参见ma,h.,feng,h.,zhang,y.,qin,y.,xiang,z.,li,j.,zhang,y*.,yu,z*.multiplexspecies-specificpcridentificationofnativegiantclamsinthesouthchinasea:ausefultoolforapplicationingiantclamstockmanagementandforensicidentification.aquaculture2021,531:735991.)，证明了此批次幼虫50％左右为该批次幼虫，而且是这些亲本的子代，也就是说，此次原位催产获得了2500万个幼虫；5月9日清晨，潜水员利用200目筛绢网在潟湖收集水中浮游生物，之后利用80目筛绢网过滤，收集生物用95％酒精固定；之后带回中国科学院西沙海洋观测站实验室，利用显微镜发现潟湖中有一定数量的足面盘幼虫，大概密度为3个/m3，按照潟湖水体估算，整个过程中大约有600万足面盘幼虫；为了确定这些幼虫是否砗磲幼虫，是否是催产幼虫，开展了分子鉴定，证明了该批次幼虫30％左右为该批次幼虫，而且是这些亲本的子代，也就是说，此次原位催产获得了180万个足面盘幼虫；
25.d、催产效率评估：2020年12月10日，通过潜水方式检查潟湖周边是否有新生砗磲苗种，经过断面法调查，发现有野生砗磲苗种(壳长在10-15mm)，大约50个/百平方米，按照1000亩
×
667平方米＝66.7万平方米，估算大约有新生砗磲苗种3.335万个砗磲苗种；为了确定这些苗种是否原位催产获得的，开展了分子鉴定，证明了此批次幼虫50％左右为原位催产亲本的子代，也就是说，此次原位催产获得了16675个砗磲苗种。
26.以上结果说明：诺瓦砗磲亲本原位催产技术是有效的、可行的，最关键的是获取的苗种已经定生在珊瑚石上，而且钻出来一个小窝，很好的保护了自己，这种原位催产型苗种跟野生苗种一样，具有更好的环境适应性。最关键的是，由于受到海浪和洋流影响，这种方式获得苗种形成部分野生苗种聚居区，为今后的繁衍生息提供了充足的亲本，有助于我国南海砗磲资源快速修复。
27.实施例2：
28.a、亲本促熟：2021年3月初，在我国西沙群岛永兴岛潟湖的10m水深无浪区环境中，2个潜水员放置了30个壳长在30-40cm的鳞砗磲亲本，将其放置于5m2以内，形成认为的砗磲亲本群，首先用网笼加以防护，定期观察存活状态，当期完全适应了环境后，打开网笼，利用gps定位了该站点；通过肉眼观察，发现其性腺部位呈现橘红色，说明性腺尚未成熟，利用注射器抽取了一点点性腺部分组织，发现小部分精子可以跳动，卵子直径在80-90μm，尚未达
到成熟；直至5月7日，通过gps定位，找到该站点，潜水后发现这些诺瓦砗磲性腺呈现棕黄色，说明已经成熟，进一步采用显微镜检测，发现精子活跃，卵子直径100μm，卵黄颜色深，说明卵子已经成熟；
29.b、原位催产：当其性腺发育成熟后，潜水员在夜间8点，带着防水手电进行夜潜，找到砗磲群后，利用注射器按照0.5mg/kg剂量五羟色胺溶液注射至25个鳞砗磲的外套膜中，3-5min后，鳞砗磲开始排放精子，大约持续了12min，停止了8min左右，开始排放卵子；潜水员用事先准备好的400目网袋收集卵子；之后在给另外5个鳞砗磲催产，当期其大量喷放精子时，将收集的卵子散置于雾状精子中，实现了受精作用，之后受精卵随着海浪飘流；整个催产过程大约持续了60min，之后潜水员回到潟湖岸边；
30.c、幼虫检查：5月8日夜间8点，潜水员利用300目筛绢网在潟湖收集水中浮游生物，之后利用100目筛绢网过滤，收集生物用95％酒精固定；之后带回中国科学院西沙海洋观测站实验室，利用显微镜发现潟湖中有一定数量的d形幼虫，大概密度为60个/m3，按照潟湖水体估算1000亩
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667平方米
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3米水深＝200.1万水体，整个过程中大约有1.2亿个d形幼虫；为了确定这些幼虫是否砗磲幼虫，是否是催产幼虫，开展了分子鉴定(具体参见ma,h.,feng,h.,zhang,y.,qin,y.,xiang,z.,li,j.,zhang,y*.,yu,z*.multiplexspecies-specificpcridentificationofnativegiantclamsinthesouthchinasea:ausefultoolforapplicationingiantclamstockmanagementandforensicidentification.aquaculture2021,531:735991.)，证明了此批次幼虫60％左右为该批次幼虫，而且是这些亲本的子代，也就是说，此次原位催产获得了7200万个幼虫；5月15日清晨，潜水员利用200目筛绢网在潟湖收集水中浮游生物，之后利用80目筛绢网过滤，收集生物用95％酒精固定；之后带回中国科学院西沙海洋观测站实验室，利用显微镜发现潟湖中有一定数量的足面盘幼虫，大概密度为8个/m3，按照潟湖水体估算，整个过程中大约有1600万足面盘幼虫；为了确定这些幼虫是否砗磲幼虫，是否是催产幼虫，开展了分子鉴定，证明了此批次幼虫50％左右为该批次幼虫，而且是这些亲本的子代，也就是说，此次原位催产获得了800万个足面盘幼虫；
31.d、催产效率评估：2021年10月20日，通过潜水方式检查潟湖周边是否有新生砗磲苗种，经过断面法调查，发现有野生砗磲苗种(壳长在10-30mm)，大约20个/百平方米，按照1000亩
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667平方米＝66.7万平方米，估算大约有新生砗磲苗种13.34万个砗磲苗种；为了确定这些苗种是否原位催产获得的，开展了分子鉴定，证明了此批次幼虫45％左右为原位催产亲本的子代，也就是说，此次原位催产获得了大约6万个鳞砗磲苗种。
32.以上结果说明：鳞砗磲亲本原位催产技术是有效的、可行的，最关键的是获取的苗种已经定生在珊瑚石上，而且钻出来一个小窝，很好的保护了自己，这种原位催产型苗种跟野生苗种一样，具有更好的环境适应性。最关键的是，由于受到海浪和洋流影响，这种方式获得苗种形成部分野生苗种聚居区，为今后的繁衍生息提供了充足的亲本，有助于我国南海砗磲资源快速修复。