一种基于Avicel的病毒蚀斑测定方法及其应用与流程

一种基于avicel的病毒蚀斑测定方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于avicel的病毒蚀斑测定方法及其应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻（porcine epidemic darrhea, ped）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, pedv）引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的猪肠道传染病，具有仔猪发病率和死亡率高的特征，给我国的养殖业造成了重大经济损失，危害极大（参见例如song d, park b. porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines[j]. virus genes, 2012, 44(2):167-175；li zl, zhu l, ma jy, et al. molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (pedv) field strains in south china[j]. virus genes, 2012, 45(1):181-185和pathogenesis of porcine epidemic diarrhea virus isolate (us/iowa/18984/2013) in 3-week-old weaned pigs[j]. veterinary microbiology, 2014, 174(1-2):60-68）。
[0003]
要预防或者治疗猪流行性腹泻，首先需要对pedv进行研究和表征。目前已有多种病毒定量方法，包括但不限于病毒蚀斑技术、半数组织培养感染量测定（tcid
50
）、免疫荧光法、透射电子显微镜技术、病毒流式细胞术、可调电阻脉冲检测（trps）、重组报告系统技术和实时荧光定量pcr (rt-qpcr)法等。
[0004]
其中病毒蚀斑技术可以直观展示和精确测定病毒的感染性和数量，是其它方法所不能替代的，被认为是病毒感染性和滴度检测的金标准（参见例如hartley jw, rowe wp. tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.[j]. proceedings of the society for experimental biology & medicine, 1963, 113(2):403-406和d juarez, long kc, aguilar p, et al. assessment of plaque assay methods for alphaviruses[j]. journal of virological methods, 2013, 187(1):185-189）。该技术是1952年由dulbecco等参照噬菌体蚀斑技术进行修改和改编而首次建立的并被广泛应用至今（参见例如cooper pd. the plaque assay of animal viruses.[j]. advances in virus research, 1962, 8(18):319-378；黄祯祥编. 医学病毒学基础及实验技术[m]. 科学出版社, 1990；huang zx. fundamentals and experimental techniques of medical virology[m]. science press, 1990；dulbecco r, vogt m. some problems of animal virology as studied by the plaque technique.[j]. cold spring harbor symposia on quantitative biology, 1953, 18:273-279和butterworth p. the biochemistry of viruses: by s. j. martin cambridge university press, london, 1978x 145 pages. hardback 10.50; softback 3.95[j]. febs letters, 1978, 91(2):378-379）。因此病毒蚀斑技术将是pedv最理想的研究和表征手段，且通过该技术获得的病毒滴度又是抗病毒药物和疫苗评价的主要指标之一。
[0005]
目前常用的病毒蚀斑技术是将病毒连续稀释至5-100个/孔病毒颗粒接种至融合的单层宿主细胞上，病毒吸附上细胞后，再加入固定病毒颗粒不扩散的营养覆盖层，待病毒大量复制导致细胞死亡后，去除覆盖层后，活细胞被染料染色，而死细胞处不能染色从而形成“蚀斑”。其中传统覆盖层主要包括固体琼脂糖（agarose）覆盖层、半固体甲基纤维素或羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，cmc）覆盖层等。但琼脂糖覆盖层由于其常温是固体状态，需加热后才能使用，操作困难，可能会出现温度掌握不好导致细胞死亡及铺板不均匀等问题；而甲基纤维素和羧甲基纤维素覆盖层虽然是半固体状态使用较为方便，但由于黏度较高，在染色前去除覆盖层时也容易造成去除不干净，特别是96孔板中去除困难，去除时容易伤害细胞，导致蚀斑计数结果不佳。
[0006]
近年来，尽管已将胶体微晶纤维素应用于病毒蚀斑实验，但由于价格偏贵、使用效果也不完全理想。胶体微晶纤维素本身是一种药用辅料，商品名为avicel，由美国fmc biopolymer公司生产，是以微晶纤维素、羧甲基纤维素钠为基础，进行特殊混合后制成的共处理辅料，羧甲基纤维素钠起到分散剂和保护胶体的作用。此产品加入水性介质中，均匀分散于液体中时可形成很高触变性的凝胶结构载体，其特有的网状结构能够稳定悬浮并乳化固体物质或油状液体。一般作为干混悬剂造粒时的粘合剂，改善药物的可造粒性，同时作为溶解后的助悬剂；触变性使液体药物振荡后黏度降低，服用无粘糊性，可减少刺激或苦味药物在喉咙停留的感觉。例如美国fmc biopolymer公司生产的avicel
®
rc/cl rc-591，其中含有82-89%的微晶纤维素（mcc）和11-18%的羧甲基纤维素（cmc）。
[0007]
由于avicel本身是药用辅料，是医药制药用途中使用的，对于病毒研究而言，除价格昂贵外，avicel作为蚀斑实验的覆盖层时，不能通过稀释调整其底层avicel的浓度，导致其不能通过稀释调整限制病毒液流动的能力。而目前使用的fmc biopolymer公司生产的avicel
®
rc/cl rc-591，其中mcc和cmc含量固定，在实际应用中无法调整，因此需要开发出更经济且更易调整的病毒蚀斑覆盖层。


技术实现要素：

[0008]
针对上述技术问题，本发明开发了新的基于avicel的病毒蚀斑测定用覆盖层组合物，用于猪流行性腹泻病毒的蚀斑测定和病毒滴度确定。
[0009]
为实现上述技术目的，本发明采用了如下技术方案：一种用于病毒蚀斑测定的覆盖层组合物，其特征在于所述组合物包含微晶纤维素和羧甲基纤维素，其中微晶纤维素的质量百分比不高于4.8%，羧甲基纤维素的质量百分比不高于1.4%。
[0010]
所述组合物优选包含0.6%-2.4%质量百分比的微晶纤维素和0.1%-0.7%质量百分比的羧甲基纤维素，最优选包含0.6%质量百分比的微晶纤维素和0.7%质量百分比的羧甲基纤维素。这种组成的覆盖层组合物在猪流行性腹泻病毒蚀斑测定中产生的蚀斑最多且最清晰，效果最好。
[0011]
本发明还公开了所述覆盖层组合物用于病毒蚀斑测定的用途，特别是用于猪流行性腹泻病毒（pedv）的蚀斑测定。
[0012]
本发明还公开了使用所述覆盖层组合物进行病毒蚀斑测定的方法，包括以下步骤：
1）配制所述覆盖层组合物；2）分别培养宿主细胞和增殖病毒；3）稀释所增殖的病毒并和所述覆盖层组合物一起感染宿主细胞；4）对感染后的宿主细胞进行固定和染色；5）确定病毒滴度。
[0013]
最优选地，本发明的方法是在96孔板中进行的。因为一般的覆盖层在96孔板中去除特别困难，去除时特别容易伤害细胞，导致蚀斑计数结果不佳；但本发明足以克服这些困难。
[0014]
总体而言，与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：本发明成功建立了一种操作简便、实用性好、稳定性好的新型改良的avicel病毒蚀斑测定法，为病毒的病原学、抗病毒药物及疫苗等相关研究的展开提供了良好的实验基础。
[0015]
avicel作为新型液体蚀斑覆盖层，相较于传统覆盖层操作更简便，对病毒和细胞的伤害更小。avicel是一种药用辅料，由mcc和cmc混合制成，主要用于乳剂型和混悬剂型药物。静置时，avicel中cmc下沉，使底部形成高黏度液体，方便限制病毒移动，能够在局部形成蚀斑；摇动avicel，其中mcc和cmc混合形成混悬液，黏度很低，很容易从细胞孔中吸取出来，操作简单，不会伤及细胞层，不会形成划痕干扰空斑计数。同时，avicel可以在室温下应用，不需要加热，不耐热的病毒也更容易形成蚀斑。
[0016]
本发明提供了优选配比的avicel适应于不同的病毒、宿主细胞和培养体系，得到了适用于pedv 的96孔板蚀斑测定的多种优化avicel，其测定结果中蚀斑形成数量多、清晰度好、准确度高且稳定性好，可以更好地研究、预防和治疗猪流行性腹泻，有助于生猪养殖业的健康发展，保证民生和健康。
附图说明
[0017]
图1显示了pedv感染vero e6细胞所产生的病变效应（evos xl core, 20
×
）；其中图1a为pedv感染细胞，图1b为未感染空白对照（mock）。
[0018]
图2显示了本发明不同覆盖层的黏度结果；其中图2a为总体黏度，图2b为底层黏度。
[0019]
图3显示了本发明不同覆盖层产生的蚀斑染色结果；其中图3a为0.6% mcc与不同浓度cmc覆盖层的染色结果，图3b为1.2% mcc与不同浓度cmc覆盖层的染色结果，图3c为2.4% mcc与不同浓度cmc覆盖层的染色结果，图3d为传统覆盖层（0.3% agrose和1% cmc）的染色结果作为对照，图3e为未感染病毒的vero-e6细胞使用1% cmc后的染色结果作为空白对照。
[0020]
图4显示本发明不同覆盖层计算得到的病毒滴度结果；其中图4a为0.6% mcc与不同浓度cmc覆盖层的病毒滴度结果，图4b为1.2% mcc与不同浓度cmc覆盖层的病毒滴度结果，图4c为2.4% mcc与不同浓度cmc覆盖层的病毒滴度结果，均与传统覆盖层（0.3% agrose和1% cmc）的病毒滴度结果作为对照进行对比。
具体实施方式
[0021]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。但以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的原理及其核心思想，并非对本发明保护范围的限定。应当指出，对于本技术领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，针对本发明进行的改进也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0022]
病毒是一种必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。该活细胞就是病毒的宿主细胞，病毒的复制、转录和转译都是在宿主细胞中进行的。
[0023]
本发明涉及的病毒是引起猪流行性腹泻（porcine epidemic darrhea, ped）的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, pedv）。尽管本发明经过优化的方案最适用于该病毒，但其发明构思对于其他病毒也可适用，包括但不限于猪流行性腹泻等各种病毒，只需要本领域技术人员根据具体病毒和宿主细胞情况予以调整优化。本发明使用的宿主细胞是vero-e6细胞，它是非洲绿猴肾细胞系，常用于病毒培养的宿主细胞，作为商品化宿主细胞可从多家公司购买得到。但本发明也可使用其他适合病毒培养的宿主细胞，包括但不限于vero-e6等宿主细胞。
[0024]
avicel本为一种药用辅料胶体微晶纤维素的商品名，其组成以微晶纤维素、羧甲基纤维素钠为基础。本发明所称的avicel并不是美国fmc biopolymer公司生产的avicel商品本身，只是根据其基础组成进行优化调整而获得的覆盖层组合物，分散于水性介质例如水中形成包含0.6%-2.4%质量百分比的微晶纤维素和0.1%-0.7%质量百分比的羧甲基纤维素的覆盖层在本发明中具有良好的效果。其中微晶纤维素和羧甲基纤维素都是本领域市售产品，可选用合适的微晶纤维素和羧甲基纤维素或其衍生物产品。对于其他病毒和宿主细胞而言可能具有不同的优化组成，但这是本领域技术人员根据本发明的构思可以调整获得的，也在本发明的保护范围内。
[0025]
宿主细胞培养基及其培养方法、病毒感染方法、宿主细胞固定和染色方法、病毒蚀斑测定方法等都是本领域常规已知的，可参见本发明中提到的参考文献。本发明中提及的参考文献均通过引用并入本发明，构成本发明说明书的一部分。
实施例
[0026]
材料pedv sc-p毒株由四川农业大学赠予（参见赵洲, 刘红亮, 顾凡, 等. 猪流行性腹泻病毒sc-p株部分特性研究. 中国兽医学报, 2015, 35(9):1397-1403.）；vero-e6细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
[0027]
胎牛血清购自biological industries公司；胰酶（2.5 g/l）、rpmi-1640培养基和dmem培养基均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；微晶纤维素（microcrystalline cellulose，mcc）和羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose，cmc）均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醛溶液购自重庆川东化工有限公司；琼脂糖和结晶紫均购自sigma公司。
[0028]
细胞培养及病毒增殖将vero e6细胞复苏至含10%胎牛血清的1640培养基中，置于37℃、5%co2细胞培养箱中培养。待细胞汇合度达70-80%后，用2.5 g/l胰酶消化5 min，1：4-1：6传代培养，细胞生
长状态良好后，传至10 cm培养皿用于病毒感染。24h后，待细胞汇合度达80%-90%，用pbs洗2次，取pedv（200 pfu/ml）与3 ml含7.5 μg/ml胰酶的dmem维持培养基混合，加入细胞中。37℃孵育2 h后，弃掉上清，加入10 ml dmem维持培养基培养4-5 d，待细胞病变70-80%，将细胞收至-80℃冰箱，反复冻融3次后，4000 rpm离心30 min，取上清即病毒原液冻存至-80℃备用。
[0029]
将pedv感染vero e6细胞，并设置对照组。72h后显微镜下观察，可见pedv感染细胞出现明显圆缩、聚集及脱落（见图1a），对照组细胞贴壁良好，无明显病变（见图1b）。
[0030]2×
覆盖层的配制配制不同浓度的2
×
胶体微晶纤维素（avicel）覆盖层储存液：称取48 g微晶纤维素（mcc）至1 l ddh2o中，用匀浆器混合搅拌至液体均质无颗粒，即为4.8% mcc，接着将4.8% mcc稀释为2.4%和1.2% mcc，并分别称取1.4 g、1 g、0.6 g和0.2 g的羧甲基纤维素（cmc）至100 ml三种不同浓度的mcc中，搅拌均匀，配置成12种不同浓度mcc和cmc的avicel，高压灭菌后室温密封保存备用。
[0031]
配制2
×
cmc和2
×
琼脂糖覆盖层储存液：称取2g cmc或0.6 g琼脂糖溶于100 ml ddh2o中，配制成2% cmc和0.6% agrose，高压灭菌后室温密封保存备用。
[0032]2×
覆盖层黏度测定取配制好的12种不同浓度的2
×
avicel覆盖层储存液用ndj-8s数字黏度仪、1#转子、转速30 rpm测定混悬液总体黏度，取沉淀24 h后底层（约占总体积1/3）混悬液测定黏度，并设置2% cmc和ddh2o为对照分别测定总体黏度和底层黏度。
[0033]
如图2a所示，储存液总体黏度测定结果显示，随着cmc和mcc浓度升高，2
×
avicel覆盖层储存液总体黏度越高，其中4.8%mcc 1.4%cmc的总体黏度最接近2%cmc，而其它2
×
avicel覆盖层储存液黏度均远低于2%cmc（p《0.01）。
[0034]
如图2b所示，储存液底层黏度测定结果显示，随着cmc和mcc浓度升高，2
×
avicel覆盖层储存液底层黏度也越高，其中4.8%mcc 1.4%cmc和4.8%mcc 1%cmc的底层黏度与2%cmc基本一致，而其它2
×
avicel覆盖层储存液黏度均远低于2%cmc（p《0.01）。
[0035]
在实际使用中，黏度越高，吸取和操作越困难。结果证明除4.8%mcc 1.4%cmc和4.8%mcc 1%cmc外，其它avicel覆盖层在实际使用中均应比2%cmc操作更容易和简便。
[0036]
病毒的稀释及感染将生长状态良好的vero e6细胞，以1.0
×
106个/ml的浓度铺至96孔细胞培养板，100 μl/孔，37℃、5%co2细胞培养箱中培养12 h后使用。准备含15 μg/ml胰酶、200 u/ml的青霉素、200 μg/ml的链霉素和4%血清的2
×
dmem维持培养基。将pedv病毒用dmem维持培养基进行十倍梯度稀释，稀释浓度依次为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
。弃去96孔板培养基，加入不同稀释浓度pedv病毒100 μl/孔，37℃孵育2 h后，弃去病毒感染液，加入1：1混合的2
×
dmem维持培养基和所选的不同覆盖物（avicel，cmc和琼脂糖）100 μl/孔，置于37℃、5%co2细胞培养箱中培养5 d。其中avicel和cmc覆盖层与2
×
dmem维持液混合后需37℃平衡30 min，而琼脂糖覆盖需要提前用微波炉加热至液体状，冷却至50-60℃左右，1:1加入2
×
dmem维持培养基后置于56℃水浴中平衡30 min方可使用。
[0037]
分别将12种不同浓度的2
×
avicel覆盖层与2
×
dmem维持培养基1:1混匀后，终浓度如图3所示，加入不同稀释度的pedv病毒感染96孔板vero-e6细胞，并设置常规使用覆盖
层1%cmc和0.3% agarose为对照，1% cmc覆盖层加入未感染病毒的vero-e6细胞被设置为阴性对照。感染5 d后，固定染色后保存至4 ℃，并于6个月后拍照。
[0038]
固定和染色细胞固定细胞前，不吸出avicel覆盖层，加入10%甲醛溶液100 μl/孔，将细胞固定30 min至过夜（具体操作参见例如黄楠,郎巧利,葛良鹏,杨希.不同固定液对vero e6细胞形态和染色的影响及在病毒蚀斑分析中的应用[j].病毒学报, 2021, 37(06): 1394-1399或者huang n, lang ql, ge lp ,et al. effects of different fixing agents on vero e6 cell staining and application in virus plaque assay[j].chinese journal of virology,2021,37(06):1394-1399）。对于agarose或cmc覆盖层，直接将甲醛溶液添加到覆盖层中100 μl/孔，固定1 h至过夜。在染色之前和固定之后，弃去甲醛，用水冲洗avicel斑块，并用水或用刮铲手动除去agarose和cmc的半固体，去除残留的覆盖物或固定剂。加入1%结晶紫溶液50 μl/孔，覆盖细胞约15 min，用水轻轻洗去结晶紫渍。干燥后，保存于4℃，以备分析。
[0039]
结果如图3显示，不同浓度的cmc对细胞的结晶紫染色很均匀，没有显著影响。在cmc和mcc混合试验中，随着cmc浓度的升高，蚀斑越来越清晰；在mcc 0.7% cmc实验组中，蚀斑可识别效果优于1% cmc阳性对照组，显著优于0.3% agarose阳性对照组。
[0040]
而不同浓度的mcc则对细胞的结晶紫染色有很大的影响，mcc浓度越高，细胞的结晶紫染色越浅，越不容易识别蚀斑；0.6% mcc 0.7% cmc实验组中，细胞背景染色好、蚀斑小且清晰，其效果显著优于传统方法的阳性对照组（1% cmc组和0.3% agarose组）。
[0041]
同时，还证实了本发明方法的稳定性，将96孔板染色后4 ℃保存6个月仍能清楚地观察到蚀斑，证明其稳定性都很好。
[0042]
确定病毒滴度选取适量病毒稀释后，用不同覆盖层进行病毒滴度测定。计数每个孔中的蚀斑数，取相同稀释度重复样品的平均值计算病毒滴度，具体计算方法如下：蚀斑形成单位(pfu/ml) = 平均蚀斑数/（稀释倍数
×
病毒接种体积（ml））病毒滴度测定结果如图4所示：当mcc浓度为0.6%时，随着cmc浓度逐渐升高，可识别的蚀斑数越多，其中0.7%cmc可识别病毒滴度与传统方法的阳性对照组（1%cmc）接近，而显著优于0.3% agarose阳性对照组（p《0.01,见图4a）；当mcc浓度为1.2%时，随着cmc浓度逐渐升高，可识别的蚀斑数越多，但均低于1%cmc阳性对照，除0.1%cmc，均显著高于0.3% agarose阳性对照组（p《0.01,见图4b）；当mcc浓度为2.4%时，随着cmc浓度逐渐升高，可识别的蚀斑数越多，其中0.7%cmc可识别病毒滴度高于传统方法的阳性对照组（1%cmc），而显著优于0.3% agarose阳性对照组（p《0.01,见图4c）。