生物假体组织制备的制作方法

生物假体组织制备
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年12月9日提交的美国专利申请号62/945721的权益，其全部公开内容通过引用并入用于所有目的。
技术领域
3.本技术一般涉及制备生物假体组织的方法，更具体地涉及包括从生物假体组织(包括可生物降解或不可生物降解的组织)中去除抗原性生物分子和/或细胞的方法。


背景技术：

4.生物假体组织在许多医疗装置中被用作机械医疗装置的替代品。例如，基于组织的假体心脏瓣膜可以用作机械心脏瓣膜的替代品，每种都有其优点和缺点。机械心脏瓣膜具有非常长的寿命预期，但需要患者在其余生中使用血液稀释剂来降低血栓的风险。每当发生出血时，利用血液稀释剂的患者可能会出现严重的医疗问题。基于组织的心脏瓣膜通常不需要患者利用血液稀释剂，但基于组织的假体具有较短的寿命预期(15-30年)。因此，接受基于组织的心脏瓣膜的患者可能需要额外的手术来更换已经降解的基于组织的心脏瓣膜。对于许多年轻患者来说，在机械心脏瓣膜还是基于组织的心脏瓣膜之间做出决定可能非常困难。


技术实现要素：

5.本公开内容的许多方面涉及制备用于临床前或临床用途的组织的方法，其包括从生物假体组织中去除抗原性生物分子和/或细胞。
6.在一个方面，从生物假体组织中去除抗原和细胞。利用还原剂在生物假体组织内将亲水性生物分子溶解。利用至少一种去污剂在生物假体组织内将亲脂性生物分子溶解。利用核酸酶、脂肪酶、糖酶或解聚酶中的至少一种在生物假体组织内酶促降解生物分子。
7.在另一方面，还原剂为以下中的一种：β-巯基乙醇(bme或2-me)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、二硫苏糖醇(dtt)、三丁基膦(tbp或tnbp)或其组合。
8.在又另一方面，至少一种去污剂是非离子去污剂、两性离子去污剂、离子去污剂或包括至少一种非离子去污剂和至少一种离子去污剂的多种去污剂。
9.在进一步的方面，两性离子去污剂为以下中的一种：氨基磺基甜菜碱-14(asb-14)、氨基磺基甜菜碱-16(asb-16)、4-辛基苯甲酰氨基-丙基-二甲基氨基磺基甜菜碱(asb-c80)、磺基甜菜碱3-10(sb 3-10)、磺基甜菜碱3-12(sb 3-12)、磺基甜菜碱3-14(sb 3-14)、磺基甜菜碱3-16(sb 3-16)、磺基甜菜碱3-18(sb 3-18)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸水合物(chaps)、3-([3-胆酰胺丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)、非去污剂磺基甜菜碱195(ndsb-195)、非去污剂磺基甜菜碱201(ndsb-201)、非去污剂磺基甜菜碱211(ndsb-211)、非去污剂磺基甜菜碱221(ndsb-221)、非去污剂磺基甜菜碱256(ndsb-256)或其组合。
[0010]
在仍又另一方面，非离子去污剂是以下中的一种：tween去污剂、triton-x去污剂、正十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)、洋地黄皂苷、igepal ca-630、n,n-双[3-(d-葡糖酰胺基)丙基]胆酰胺(bigchap)、n,n-双[3-(d-葡糖酰胺基)丙基]脱氧胆酰胺(deoxy big chap)或其组合。
[0011]
在仍又甚至其他方面，离子去污剂是以下中的一种：十二烷基硫酸钠(sds)、脱氧胆酸钠、胆酸钠、肌氨酰或十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，或其组合。
[0012]
在又进一步的方面，核酸酶是以下中的一种：rna酶a、dna酶i、苯酶核酸酶(benzonase nuclease)或其组合。
[0013]
在甚至进一步的方面，脂肪酶是以下中的一种：三酰基甘油脂肪酶、胰脂肪酶或其组合。
[0014]
在又甚至进一步的方面，糖酶是以下中的一种：淀粉酶、阿拉伯糖酶、纤维素、葡聚糖酶(glucanse)、木聚糖酶或其组合。
[0015]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织是动物组织。
[0016]
在仍又甚至进一步的方面，动物组织是以下中的一种：心包、心脏瓣膜、血管、小肠粘膜下层、基于胶原的组织或基于弹性蛋白的组织。
[0017]
在仍又甚至进一步的方面，动物组织是以下中的一种：牛类、猪类、羊类、禽类或人类。
[0018]
在仍又甚至进一步的方面，从生物假体组织中去除不需要的组织。
[0019]
在仍又甚至进一步的方面，不需要的组织是以下中的一种：脂肪、静脉、软骨或其组合。
[0020]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织被固定。
[0021]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织通过选自以下的方法被固定：灌注、浸没、冷冻、干燥或其组合。
[0022]
在仍又甚至进一步的方面，至少一种交联剂被用于固定生物假体组织。
[0023]
在仍又甚至进一步的方面，至少一种交联剂是以下中的一种：甲醛、戊二醛、多聚甲醛、福尔马林、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、或其组合。
[0024]
在仍又甚至进一步的方面，至少一种交联剂包括甲醛、戊二醛、多聚甲醛或福尔马林。并且生物假体组织内的醛交联得到稳定。
[0025]
在仍又甚至进一步的方面，稳定醛交联包括用热处理持续延长的时间段。
[0026]
在仍又甚至进一步的方面，至少一种交联剂包括甲醛、戊二醛、多聚甲醛或福尔马林。并且生物假体组织内的游离醛被封端。
[0027]
在仍又甚至进一步的方面，封端游离醛包括用还原剂、胺或其组合处理。
[0028]
在仍又甚至进一步的方面，至少一种交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)。并且生物假体组织内的羧基交联得到稳定。
[0029]
在仍又甚至进一步的方面，稳定羧基交联包括用热处理持续延长的时间段。
[0030]
在仍又甚至进一步的方面，酶促交联剂用于固定生物假体组织。
[0031]
在仍又甚至进一步的方面，酶促交联剂是以下中的一种：转谷氨酰胺酶、氧化还原酶或其组合。
[0032]
在仍又甚至进一步的方面，沉淀剂用于固定生物假体组织。
[0033]
在仍又甚至进一步的方面，沉淀剂是以下中的一种：甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或其组合。
[0034]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织内的游离羧基被封端。
[0035]
在仍又甚至进一步的方面，封端游离羧基包括用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)处理。
[0036]
在仍又甚至进一步的方面，在生物假体组织上进行生物负载降低处理。
[0037]
在仍又甚至进一步的方面，生物负载降低处理包括以下中的一种：用细胞毒性试剂处理、用抗微生物剂处理、热处理、压力处理、辐射处理、用去污剂处理、用交联剂处理、或其组合。
[0038]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织储存在溶液中。
[0039]
在仍又甚至进一步的方面，溶液是固定缓冲液或水中的环氧丙烷。
[0040]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织用溶液处理以便干式储存。
[0041]
在仍又甚至进一步的方面，用于干式储存的溶液包括甘油、聚乙二醇或糖类。
[0042]
在仍又甚至进一步的方面，用于干式储存的溶液的溶剂是水基或醇基的。
[0043]
在仍又甚至进一步的方面，甘油化作为用于干式储存的生物假体组织的处理而进行。
[0044]
在仍又甚至进一步的方面，用于干式储存的溶液包括选自约：50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比的甘油。
[0045]
在仍又甚至进一步的方面，用于干式储存的溶液包括选自约：0％、10％、20％、30％、40％或50％的百分比的c
1-c3醇。
[0046]
在仍又进一步的方面，对生物假体组织进行灭菌。
[0047]
在仍又甚至进一步的方面，灭菌包括选自以下的处理：γ照射、气体等离子体、醛、环氧乙烷、电子束、及其组合。
[0048]
在仍又甚至进一步的方面，生物假体组织被成形。
[0049]
在仍又甚至进一步的方面，成形包括以下中的一种：模切、激光切割、折叠、成型及其组合。
[0050]
在仍又甚至进一步的方面，假体组织用于制造医疗装置。
[0051]
在仍又甚至进一步的方面，医疗装置是以下中的一种：组织贴片、医疗器皿、导管、闭合装置或心脏瓣膜。
[0052]
在仍又甚至进一步的方面，医疗装置是心脏瓣膜并且假体组织用于形成小叶。
[0053]
另外的方面和特征部分地在以下的描述中阐述，并且部分地对于本领域技术人员在检查说明书时变得显而易见或者可以通过所描述的各个方面的实践来了解。通过参考形成本公开内容的一部分的说明书的其余部分和附图，可以实现对本公开内容的性质和优点的进一步理解。
附图说明
[0054]
参考以下附图将更充分地理解说明书和权利要求，这些附图作为示例性描述呈现并且不应被解释为对本公开内容范围的完整叙述。
[0055]
图1提供了根据本公开内容的一个方面制备用于临床用途的生物假体组织的流程
图。
[0056]
图2提供了根据本公开内容的一个方面从生物假体组织中去除抗原性生物分子和/或细胞的流程图。
[0057]
图3提供了根据本公开内容的一个方面制备用于组装到医疗装置中的生物假体组织的流程图。
具体实施方式
[0058]
现在转向附图和说明书，描述了制备生物假体组织的各种方法。在一些情况下，生物假体组织被制备用于临床或临床前用途，其包括(但不限于)用于移植或并入到医疗装置中。在一些情况下，生物假体组织被制备以并入到假体心脏瓣膜，假体心脏瓣膜包括(但不限于)主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣或肺心瓣膜。
[0059]
说明书的方面涉及在制备方法期间从生物假体组织中去除生物分子(例如，核酸、脂质、碳水化合物和蛋白质)。现在已经理解，生物假体组织内的许多生物分子可以在接受生物假体组织的患者体内产生免疫反应。例如，接受并入生物假体组织的心脏瓣膜的患者可能对生物假体组织产生免疫反应，将生物假体组织识别为外来物(例如，非在患者体内自然生长的组织)。这种反应类似于针对细菌的免疫反应和/或自身免疫反应。当免疫系统识别出外来物质时，该物质被称为抗原，免疫系统试图将其去除。因此，当生物假体组织诱导免疫反应时，生物假体组织受到免疫细胞的攻击，这会导致生物假体组织降解。这种免疫反应会导致许多并入生物假体组织的植入式医疗装置的短寿命。因此，根据本公开内容的几个方面，目标是减轻针对并入生物假体组织的医疗装置的免疫反应，以便延长装置寿命并防止患者需要额外的手术来更换装置。如其内所述，几个方面涉及通过减少和/或去除可能存在于生物假体组织内的抗原性生物分子和细胞来减轻针对医疗装置的免疫反应。
[0060]
制备生物假体组织的方法
[0061]
几个方面涉及制备用于医疗应用的生物假体组织的方法，其包括临床和临床前程序。根据几个方面，生物假体组织是用于医疗装置和/或医疗程序的动物组织。生物假体组织的实例包括(但不限于)动物心包、心脏瓣膜、血管、小肠黏膜下层(sis)、基于胶原的组织和基于弹性蛋白的组织。生物假体组织可以源自任何合适的动物来源，其包括(但不限于)牛类、猪类、羊类、禽类和人类供体。在许多情况下，生物假体组织来自非自体(例如，非自身)来源，但是根据本公开内容的一些方面可以利用自体(例如，自身)来源。在许多情况下，生物假体组织经过处理和制备用于临床用途，其可包括去除抗原性生物分子和细胞。在某些情况下，处理的生物假体组织是不可生物降解的。在某些情况下，处理的生物假体组织是可生物降解的。
[0062]
根据几个方面，抗原性生物分子是生物假体组织内能够在接受生物假体组织的患者中产生免疫反应的任何生物分子。在许多情况下，抗原性生物分子包括(但不限于)抗原性蛋白质、抗原性脂质、抗原性代谢物和抗原性核酸。
[0063]
图1中提供了制备用于临床或临床前用途的生物假体的示例性方法。方法100从获得101生物假体组织开始。生物假体组织可以源自任何合适的动物来源，包括(但不限于)牛类、猪类、羊类、禽类和人类供体。在许多情况下，生物假体组织来自非自体(例如，非自身)来源，但根据该方法的一些应用，可以利用自体(例如，自身)来源。
[0064]
在一些应用中，组织在从来源取回后进行处理，以去除不需要的组织。例如，可以去除脂肪、静脉、软骨和/或任何其他不需要的组织。
[0065]
方法100还从生物假体组织中去除103抗原性生物分子和/或细胞。在许多情况下，被去除的抗原性生物分子包括(但不限于)抗原性蛋白质、抗原性脂质、抗原性代谢物和抗原性核酸。许多方式可用于去除抗原性生物分子，其包括(但不限于)用去污剂处理、用还原剂处理、用水解或分解生物分子的酶(例如，核酸酶、脂肪酶、糖酶、解聚酶)处理。
[0066]
方法100还固定105和/或保存生物假体组织。许多方法和试剂可用于固定和保存生物假体组织。在若干情况下，组织通过灌注、浸没、冷冻、干燥或其组合来固定。可以使用许多固定试剂，其包括交联剂和沉淀试剂。交联剂包括(但不限于)甲醛、戊二醛、多聚甲醛、福尔马林、其他醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和酶促交联剂。在一些情况下，使用胺交联剂，比如(例如)甲醛、戊二醛、多聚甲醛、福尔马林或京尼平。在一些情况下，使用羧基交联剂，比如(例如)edc，其可以减少游离羧基的钙化。在一些情况下，分别使用胺和羧基交联，其可以同时或相继地使用。
[0067]
在一些情况下，生物假体组织使用可生物降解的交联剂固定，比如(例如)酶促交联剂，其可以增加组织的生物相容性。酶促交联剂包括转谷氨酰胺酶(例如，因子xiii)和氧化还原酶(例如，酪氨酸酶、具有过氧化物酶的漆酶和具有胺氧化酶的赖氨酰氧化酶)。有关酶促交联剂的更多实例，请参见j.c.schense and j.a.hubbell,bioconjug chem.1999；10(1):75
–
81；以及t.heck,et al,appl microbiol biotechnol.2013；97(2):461
–
75；出于所有目的，其公开内容均通过引用并入本文。在某些情况下，使用可生物降解的交联剂代替化学交联剂，使交联的组织保持可生物降解。在一些应用中，可生物降解的组织被用作临时植入物，并允许天然组织在其中生长并替换可生物降解的组织。在一些情况下，利用生物正交锚定和双官能连接化合物进行交联，比如在benton的美国专利号9,925,303中所描述的那些，出于所有目的，其公开内容通过引用并入本文。
[0068]
在一些情况下，使用沉淀试剂。沉淀试剂包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇和丙酮。使用的适当固定方法和试剂可能会变化，并且通常取决于最终产品。例如，当将固定(或交联的)组织用于临床应用时，可能需要使用毒性较低的固定剂或者可以通过固定后程序降低毒性的固定剂。
[0069]
方法100进一步制备107生物假体组织用于临床或临床前用途。确切的制备取决于临床或临床前应用。在某些情况下，生物假体组织用于制造医疗装置。在一些特定情况下，生物假体组织用于制造心脏瓣膜。在某些情况下，在移植方法中使用生物假体组织。在一些情况下，生物假体组织用于脉管系统假体。在一些情况下，生物假体组织用于治疗患者。在某些情况下，生物假体组织用于临床前应用，比如(例如)在尸体、动物模型或拟人模型上的训练程序。
[0070]
可以采取许多措施来制备用于临床或临床前用途的生物假体组织。在某些情况下，生物假体组织被清洗和/或灌注以去除有害的固定剂和其他化学物质。在一些情况下，生物假体组织被切割、折叠和/或形成为所需的形状。在某些情况下，对生物假体组织进行生物负载降低(例如，微生物去除和抑制)。在某些情况下，生物假体组织中的游离醛被封端(例如，修饰游离醛以防止它们与宿主受体中的钙结合的化学程序)。
[0071]
在某些情况下，制备假体组织以便用于储存，这可能有助于长期保存。储存可以是
干式储存或湿式储存。湿式储存方法包括将组织储存在溶液中，比如(例如)固定缓冲液(例如，戊二醛缓冲液)或水中的环氧丙烷。干式储存方法包括用包含生物相容性分子的溶液处理组织持续一段时间，这可以使溶液的组分在组织内平衡。然后，除了在其中平衡的水溶液的组分之外，组织在储存时不含液体。用于干式储存的溶液中包含的生物相容性分子包括(但不限于)甘油、丙二醇、聚乙二醇和糖类。用于干式储存的溶剂包括(但不限于)水基溶剂、醇基溶剂、任何其他生物相容性溶剂以及其任何溶剂混合物。对于干式储存方法的更多描述，参见chen等人的美国专利号6,534,004、tian等人的美国专利号8,007,992以及dong等人的美国专利号10,383,978，为了所有目的，其公开内容均通过引用并入本文。在一些情况下，对假体组织进行灭菌，这可以使用γ照射、气体等离子体、醛类、环氧乙烷和/或电子束进行。
[0072]
已经描述了许多组织制备程序，其包括以下出版物中的描述：dove等人的美国专利号7,972,376、dove等人的美国专利号8,748,490、dove等人的美国专利号9,029,418，dove等人的美国专利号9,320,830，ashworth等人的美国专利号10,722,613，wang等人的美国公开号2017/0173214以及lehenberger等人的美国公开号2019/0374680，出于所有目的，其公开内容均通过引用并入本文。
[0073]
虽然以上描述了抗原去除和去细胞化(decellularization)、固定以及生物假体组织的制备的具体实例，但是本领域普通技术人员可以理解，该方法的各个步骤可以以不同的顺序进行，并且根据说明书的某些方面，某些步骤可能是可选的。因此，应该清楚的是，可以根据具体应用的要求适当地使用该方法的各个步骤。此外，根据本说明书的各个方面，可以使用适合于给定应用要求的用于抗原去除和脱细胞、固定和生物假体组织制备的多种方法中的任一种。
[0074]
去除抗原性生物分子的方法
[0075]
本说明书的许多方面涉及从假体组织中去除抗原性生物分子和/或细胞的方法。如现在所理解，假体组织内的抗原可以刺激宿主免疫系统，进而促进假体组织的降解和组织的最终失效。通常，假体组织移植物和/或并入假体组织的医疗装置需要大约每5到20年进行更换。因此，在多种情况下，从假体组织中去除抗原会减轻宿主的免疫反应并减轻组织的降解。此外，在某些情况下，抗原去除延长了移植物或医疗装置的寿命预期，进而可减少更换移植物或医疗装置的需要。
[0076]
在一些情况下，使用去污剂、还原剂和/或酶从假体组织中去除抗原。在许多情况下，要去除的抗原是生物分子，其包括(但不限于)蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物。
[0077]
图2中提供了去除抗原性生物分子的方法的示例性方法。方法200以获得201生物假体组织开始。生物假体组织可以来源于任何合适的动物来源，包括(但不限于)牛类、猪类、羊类、禽类和人类供体。在许多情况下，生物假体组织来自非自体(例如，非自身)来源，但根据说明书的一些方面，可以使用自体(例如，自身)来源。
[0078]
在一些情况下，组织在从来源取回后进行处理，以去除不需要的组织。例如，可以去除脂肪、静脉、软骨和/或任何其他不需要的组织。在一些情况下，使用去稳定剂或解聚剂。
[0079]
方法200溶解203生物假体组织中的亲水性生物分子。亲水性生物分子的溶解导致它们从生物假体组织中释放出来，其又可以通过冲洗、洗涤、灌注和/或其他适当的方法去
除可溶性组分。在许多情况下，待溶解的亲水性生物分子是存在于生物假体组织内的任何水溶性生物分子，其包括(但不限于)胞质蛋白、胞外蛋白、多糖、寡糖、单糖、代谢物、氨基酸、核酸寡聚体和单体以及其他可溶于组织的细胞质或细胞外空间的生物分子。
[0080]
在若干情况下，亲水性生物分子的溶解是通过使用去污剂、还原剂、分解亲水性分子的酶或其组合来实现的。在许多情况下，使用至少一种还原剂。可以使用的还原剂包括(但不限于)β-巯基乙醇(bme或2-me)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、二硫苏糖醇(dtt)、三丁基膦(tbp或tnbp)和其组合。
[0081]
在许多情况下，亲水性生物分子的溶解是在水溶液中进行的。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约7.5和8.5之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。亲水性生物分子的溶解可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。亲水溶解的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所使用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织用亲水性溶解溶液处理大约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0082]
方法200还溶解205生物假体组织中的亲脂性生物分子。亲脂性生物分子的溶解导致它们从生物假体组织中释放出来，其可以通过冲洗、洗涤、灌注和/或其他适当的方法去除脂溶性组分。在许多情况下，待溶解的亲脂性生物分子是存在于生物假体组织内的任何脂溶性生物分子，其包括(但不限于)磷脂、跨膜蛋白、胆固醇、核孔和其他可溶于组织膜部分的生物分子。
[0083]
在若干情况下，亲脂性生物分子的溶解是通过使用去污剂、还原剂、分解亲脂性分子的酶或其组合来实现的。在许多情况下，使用至少一种还原剂。还原剂包括(但不限于)β-巯基乙醇(bme或2-me)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、二硫苏糖醇(dtt)、三丁基膦(tbp或tnbp)及其组合。在许多情况下，使用至少一种去污剂。在一些情况下，至少一种去污剂是两性离子去污剂。在一些情况下，至少一种去污剂是非离子去污剂。在一些情况下，至少一种去污剂是离子去污剂。在一些情况下，同时使用非离子和离子去污剂。在某些情况下，同时使用非离子和两性离子去污剂。在一些情况下，同时使用离子和两性离子去污剂。在一些情况下，同时使用非离子、离子和两性离子去污剂。两性离子去污剂包括(但不限于)氨基磺基甜菜碱-14(asb-14)、氨基磺基甜菜碱-16(asb-16)、4-辛基苯甲酰胺-丙基-二甲氨基磺基甜菜碱(asb-c80)、磺基甜菜碱3-10(sb 3-10)、磺基甜菜碱3-12(sb 3-12)、磺基甜菜碱3-14(sb3-14)、磺基甜菜碱3-16(sb 3-16)、磺基甜菜碱3-18(sb 3-18)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐水合物(chaps)、3-([3-胆酰胺丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)、非去污剂磺基甜菜碱195(ndsb-195)、非去污剂磺基甜菜碱201(ndsb-201)、非去污剂磺基甜菜碱211(ndsb-211)、非去污剂磺基甜菜碱221(ndsb-221)、非去污剂磺基甜菜碱256(ndsb-256)及其组合。非离子去污剂包括(但不限于)聚山梨醇酯非离子去污剂(例如，聚山梨醇酯去污剂，croda international)，聚环氧乙烷非离子去污剂(例如，triton
tm
x聚环氧乙烷非离子去污剂，dow chemical)，正十二烷基-β-d-麦芽糖苷
(ddm)、洋地黄皂苷、igepal ca-630、n,n-双[3-(d-葡糖酰胺)丙基]胆酰胺(bigchap)和n,n-双[3-(d-葡糖酰胺)丙基]脱氧胆酰胺(deoxy big chap)。聚山梨醇酯非离子去污剂包括(但不限于)聚山梨醇酯20(例如，20)和聚山梨醇酯80(例如80)。聚环氧乙烷非离子去污剂包括(但不限于)2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇(triton
tm
x-100)和1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(triton
tm
x-114)。离子去污剂包括(但不限于)十二烷基硫酸钠(sds)、脱氧胆酸钠、胆酸钠、肌氨酰和十六烷基三甲基溴化铵(ctab)。
[0084]
在许多情况下，亲脂性生物分子的溶解是在水溶液中进行的。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约7.5和8.5之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以利用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。亲脂性生物分子的溶解可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。亲脂性溶解的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所使用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织用亲脂性溶解溶液处理约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0085]
方法200进一步酶促降解(207)生物假体组织中的生物分子，尤其是聚合生物分子。较大生物分子的酶促分解导致这些分子被还原成更小的组分，以增强它们从生物假体组织中的释放，进而可以通过冲洗、洗涤、灌注和/或其他适当的方法去除，从而去除生物分子组分。在许多情况下，要被酶促分解的生物分子是存在于生物假体组织中难以去除的任何较大的生物分子，其包括(但不限于)核酸(包括dna和rna)、蛋白质复合物、细胞骨架组分(包括微丝、微管和中间丝)以及组织内的其他大尺寸生物分子。在多种情况下，用于分解生物分子的酶包括(但不限于)核酸酶(例如，rna酶a、dna酶、苯酶(benzonase))、脂肪酶(例如，三酰基甘油脂肪酶和胰脂肪酶)、糖酶(例如，淀粉酶、阿拉伯糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶和木聚糖酶)和解聚酶(例如，细胞松弛素a、细胞松弛素b、细胞松弛素c、细胞松弛素d、细胞松弛素e、细胞松弛素f、细胞松弛素g、细胞松弛素h、细胞松弛素i、细胞松弛素j、swinholide a、scytophycin a、scytophycin b、scytophycin e、mycalolide a、mycalolide b和mycalolide c)。
[0086]
在许多情况下，亲脂性生物分子的酶促分解是在适合酶促活性的水溶液中进行的。在一些情况下，缓冲水溶液以维持高于8.0和低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约6.5和7.5之间的ph，这可赋予稳定水性环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。生物分子的酶促分解可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。酶促分解的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所使用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织用酶处理约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0087]
虽然上面描述了生物假体组织的抗原去除的具体实例，但是本领域普通技术人员可以理解，该方法的各个步骤可以以不同的顺序进行，并且根据本发明的某些方面，某些步骤可以是可选的。例如，亲水性溶解、亲脂性溶解和酶促分解的顺序可以各自以任何特定顺序发生和/或被去除和/或组合。在一些情况下，亲水性溶解和亲脂性溶解同时进行。因此，应该清楚的是，可以根据具体应用的要求适当地使用该方法的各种步骤。此外，根据本说明书的各个方面，可以使用适合于给定应用的要求的用于生物假体组织的抗原去除和脱细胞的多种方法中的任一种。
[0088]
组装和制备医疗装置的方法
[0089]
本说明书的若干方面涉及利用抗原去除和去细胞化和/或固定的生物假体组织的方法，该生物假体组织被并入到医疗装置中。在许多情况下，医疗装置是用于植入到接受者体内的任何假体装置。接受者包括(但不限于)患者、动物模型、尸体或拟人模型。在许多情况下，医疗装置是组织贴片、医疗器皿、导管、闭合装置或假体心脏瓣膜，其包括(但不限于)主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣和肺假体瓣膜。可以对生物假体组织进行多种处理，以制备用于临床或临床前用途，其包括(但不限于)抗原去除和去细胞化、组织固定、组织稳定、生物负载降低、组织切割和成形、组装至医疗装置、保存、灭菌及其任意组合。
[0090]
图3中提供了使用去除抗原和去细胞化的生物假体组织组装医疗装置并制备用于临床或临床前用途的装置的方法的示例性方法。方法300开始于获得301抗原去除和去细胞化的生物假体组织。生物假体组织可以源自任何合适的动物来源，其包括(但不限于)牛类、猪类、羊类、禽类和人类供体。在许多情况下，生物假体组织来自非自体(例如，非自身)来源，但根据说明书的一些方面，可以使用自体(例如，自身)来源。
[0091]
在一些情况下，在从来源取回之后和在抗原去除和去细胞化之前处理组织以去除不需要的组织。例如，可以去除脂肪、静脉、软骨和/或任何其他不需要的组织。在一些情况下，使用稳定剂或解聚剂。
[0092]
在多种情况下，抗原性生物分子被去除，其包括但不限于抗原性蛋白质、抗原性脂质、抗原性代谢物和抗原性核酸。许多方法可用于去除抗原性生物分子，其包括(但不限于)用去污剂处理、用还原剂处理、用水解或分解生物分子的酶(例如，核酸酶、脂肪酶、糖酶、解聚酶)处理。在某些情况下，抗原性生物分子被去除，如图2所述。
[0093]
方法300还制备303抗原去除和去细胞化的生物假体组织以用于临床或临床前用途。可以进行多种处理，其包括(但不限于)组织固定、组织稳定、生物负载降低、组织的切割和成形、保存、灭菌以及其任意组合的集合。值得注意的是，许多处理(即使不是所有)可以在抗原去除之前、之后或在去除抗原之前和之后进行。
[0094]
在许多情况下，生物假体组织被固定和/或被交联。在多种情况下，组织通过灌注、浸没、冷冻、干燥或其组合来固定。可以使用多种固定试剂，其包括(但不限于)交联剂和沉淀剂。在某些情况下，生物假体组织是新鲜的(例如，尚未固定)。在一些情况下，生物假体组织是酶促交联的。
[0095]
在许多情况下，交联固定在合适的水溶液中进行。在若干情况下，交联剂以约0.1％至1.5％(w/v)的活性浓度使用，这取决于试剂。例如，戊二醛可以以约0.5％至1.5％的浓度使用；京尼平可以以约0.1％至1.0％的浓度使用；并且edc可以以约1mmol/g的组织至10mmol/g的组织使用。在一些情况下，使用胺交联剂，比如(例如)甲醛、戊二醛、多聚甲
醛、福尔马林或京尼平。在一些情况下，使用羧基交联剂，比如(例如)edc，它可以减少游离羧基的钙化。在一些情况下，各自使用胺和羧基交联，它们可以同时或相继使用。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约7和8之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。交联固定可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。处理的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所使用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织被处理约：48小时、96小时、168小时、336小时、504小时或大于504小时。
[0096]
在许多情况下，酶促交联在合适的水溶液中进行，这可以增加组织的生物相容性。酶促交联剂包括转谷氨酰胺酶(例如，因子xiii)和氧化还原酶(例如，酪氨酸酶、具有过氧化物酶的漆酶和具有胺氧化酶的赖氨酰氧化酶)。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约6.5和7.5之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。生物分子的酶促交联可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。酶促交联的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所使用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织用酶处理约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0097]
在某些情况下，对生物假体组织进行生物负载降低处理。生物负载降低是一种去除、消除或减轻可能存在于生物假体组织内、上或周围的微生物负荷的处理方法。可以通过多种方式进行生物负载降低，其包括(但不限于)用细胞毒性试剂(例如，乙醇和次氯酸钠)、抗微生物剂(例如，抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂)、加热、压力、辐射(例如，uv照射)、去污剂(例如，十二烷基硫酸钠、tween 20)、交联剂(例如，甲醛、戊二醛和/或edc)，及其组合。
[0098]
在许多情况下，生物负载降低是在合适的水溶液中进行的。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约6.5和7.5之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。生物负载降低可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。处理的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所使用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织被处理约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0099]
在一些情况下，对交联的生物假体组织进行交联稳定。交联稳定是进一步对生物假体组织进行的固定方法的处理。交联稳定化可以通过多种方式进行，其包括(但不限于)长时间段加热处理。在一些利用热处理的情况下，生物假体组织在交联剂(例如，甲醛、戊二醛和/或edc)的存在下保持在约0.5％和1.5％(w/v)之间的浓度。在一些使用热处理的情况
下，不使用交联剂(例如，甲醛、戊二醛和/或edc)。
[0100]
在许多情况下，交联稳定性在合适的水溶液中进行。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约5.5和6.5之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。交联的稳定可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的稳定，其包括(但不限于)～40℃、～50℃、～60℃或～70℃。重要的是，升高的温度不要太高以免组织受损。稳定的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织用酶处理约：24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144、168小时或大于168小时。
[0101]
在某些情况下，对已用醛固定的生物假体组织进行醛封端处理。醛封端是一种减少交联的生物假体组织内游离醛的量的处理，以便在移植到接受患者体内时减轻钙化。醛封端可以通过多种方式进行，其包括(但不限于)用还原剂或胺分子处理。关于醛封端的更多信息，请参见dove等人的美国专利号7,972,376、dove等人的美国专利号8,748,490、dove等人的美国专利号9,029,418和dove等人的美国专利号9,320,830，其公开内容均出于所有目的通过引用并入本文。
[0102]
在某些情况下，对生物假体组织进行羧基封端处理。羧基封端是一种减少生物假体组织内游离羧基数量的处理，以便在移植到接受患者体内时减轻钙化。羧基的封端可以通过多种方式进行，其包括(但不限于)用edc处理。关于羧基封端的更多信息，请参见davidson等人的美国专利号9,878,068，其公开内容均出于所有目的通过引用并入本文。
[0103]
在许多情况下，醛和/或羧基封端在合适的水溶液中进行。在一些情况下，缓冲水溶液以维持低于约8.5的ph，并且在一些情况下维持在约6.5和7.5之间的ph，这可赋予稳定水环境和生物假体组织的益处。可以使用任何合适的缓冲盐，其包括(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(pbs)、氯化钾(kcl)、磷酸二氢钾(kh2po4)、磷酸氢二钾(k2hpo4)、氯化钠(nacl)(包括等渗盐水)、溴化钾(kbr)、溴化钠(nabr)、氯化钙(cacl2)、hepes、mes、mops、hepps、hepbs和tris-hcl。醛和/或羧基封端可以在任何适当的温度下进行以赋予适当的活性，其包括(但不限于)～4℃、室温(～25℃)和～30℃。处理的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织被处理约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0104]
在一些情况下，对生物假体组织进行灭菌处理。可以通过多种方法进行灭菌，其包括(但不限于)γ照射、气体等离子体、醛类、环氧乙烷、电子束和/或计算机断层扫描(ct)扫描。
[0105]
在某些情况下，制备假体组织以便进行储存，这可能有助于长期保存。储存可以是干式储存或湿式储存。湿式储存方法包括将组织储存在溶液中，比如(例如)固定缓冲液(例如，戊二醛缓冲液)或水中的环氧丙烷。干式储存方法包括用包含生物相容性分子的溶液处理组织持续一段时间，这可以使溶液的组分在组织内平衡。然后，除了在其中平衡的水溶液的组分之外，将组织无液体储存。用于干式储存的溶液中包含的生物相容性分子包括(但不限于)甘油、丙二醇、聚乙二醇和糖类。用于干式储存的溶剂包括(但不限于)水基溶剂、醇基
溶剂、任何其他生物相容性溶剂以及其任何溶剂混合物。关于干式储存方法的更多描述，参见chen等人的美国专利号6,534,004、tian等人的美国专利号8,007,992和dong等人的美国专利号10,383,978，其公开内容均出于所有目的通过引用并入本文。
[0106]
在许多情况下，用于干式储存的甘油化在合适的溶液中进行。在一些情况下，溶液包括一定百分比的甘油。在一些情况下，溶液包括一定百分比的甘油和c
1-c3醇。在一些情况下，甘油的百分比为约：50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些情况下，c
1-c3醇的百分比为约：0％、10％、20％、30％、40％或50％，c
1-c3醇包括甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇和其混合物。甘油化可以在任何适当的温度下进行，以赋予适当的活性，其包括(但不限于)室温(～25℃)和体温(～37℃)。处理的持续时间可以根据应用的需要进行，这取决于所用的试剂、温度和所需的结果。在一些情况下，生物假体组织被甘油化持续约：1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时或大于72小时。
[0107]
在一些情况下，生物假体组织被切割、折叠和/或形成为所需的形状。可以使用任何合适的方式来切割或成形生物假体组织，其包括(但不限于)模切和激光切割。
[0108]
应当理解，制备抗原去除的生物假体组织的各种方法可以以任何适当的顺序进行。此外，在某些情况下，各种方法未被使用，或者被使用不止一次。例如，可以在制备方法的早期进行生物假体组织的粗切割，然后在组装到医疗装置中之前进一步切割成更精确的形状。
[0109]
返回图3，方法300进一步将生物假体组织组装305到医疗装置中。在许多情况下，医疗装置是假体心脏瓣膜，其包括(但不限于)主动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣和肺假体瓣膜。在各种情况下，利用生物假体组织来形成血管贴片、组织贴片、导管、心包贴片和/或瓣膜的小叶。
[0110]
在一些情况下，在组装医疗装置之后，可以准备并入的装置用于临床或临床前应用，这可以包括组织稳定、生物负载降低、组织的切割和成形、组装到医疗装置、保存、灭菌，以及其组合的任意集合。因此，关于步骤303描述的各种方法可以在医疗装置组装之前、之后或之前和之后都进行。
[0111]
等同原则
[0112]
虽然以上描述包含本公开内容的许多特定方面，但这些不应被解释为对本公开内容范围的限制，而是作为其一个方面的各种实例。因此，本公开内容的范围不应由所说明的方面来确定，而应由所附权利要求及其等同物来确定。
[0113]
特别注意，如本领域技术人员将理解，本文描述的若干方法可以变化。例如，产生类似结果的等效(或接近等效)方法、试剂、浓度、温度、缓冲盐溶液、溶液ph和处理持续时间，如本领域技术人员所预期，将被涵盖在本公开内容的各个方面。
[0114]
尽管为了方便呈现以特定的顺序描述了一些公开的方法的操作，但是应当理解，这种描述方式包括重新排列，除非下文阐述的特定语言需要特定的顺序。例如，顺序描述的操作在某些情况下可以重新排列或同时进行。此外，为了简单起见，附图可能没有显示所公开的方法可以与其他方法和各种系统和装置结合使用的各种方式。