一种基于改良双抗体夹心ELISA法的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒的制备方法与流程

一种基于改良双抗体夹心elisa法的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒的制备方法
技术领域
1.本发明涉及蛇毒素检测技术领域，具体涉及一种基于改良双抗体夹心elisa技术的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒的制备方法。


背景技术：

2.生活中，毒蛇咬伤事件常有发生，医院急救中常根据患者对毒蛇的描述或带来毒蛇尸体来判断毒蛇种类，以此来选择有针对性的抗蛇毒血清进行抢救治疗，在无法判断毒蛇种类时，之前的做法是常选择多价抗蛇毒血清进行解毒，但是多价抗蛇毒血清效价低，需要大剂量注射，且其副作用大；现在国内只生产单价抗蛇毒血清的形势下，快速准确的鉴定蛇伤种类，就成了当务之急。
3.现有技术中，国外已有蛇毒检测试剂盒(venom detection kit，vdk)用于临床，然而针对的是少数国外蛇种，由于种属的差别，国外的测试盒不适用于中国的毒蛇鉴别；目前国内外尚无针对毒蛇咬伤快速准确检测的方法，因而十分有必要探索一种简便、高效的蛇毒检测方法，能够快速诊断常见毒蛇咬伤蛇种。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种尖吻蝮蛇蛇毒快速检测试剂盒的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.在本发明的描述中需要说明的是，术语“马抗尖吻蝮蛇igg”指的都是初步纯化或者二次纯化的多克隆抗体，并非单克隆抗体或抗体片段。
6.本发明实施例公开了一种基于改良双抗体夹心elisa技术的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤一：初步提纯，采用饱和硫酸铵方法初步纯化马抗尖吻蝮蛇血浆中的马抗尖吻蝮蛇igg；
8.步骤二：重复提纯，采用亲和层析法将初步纯化的马抗尖吻蝮蛇igg进一步层析纯化，收集目标峰对应的抗体，再次过柱层析提纯，得到较纯的马抗尖吻蝮蛇igg；
9.步骤三：包被抗体，取部分步骤二中重复提纯的抗体作为包被抗体包被到48孔板中100ul/孔，孵育完成后将孔板中的液体甩干，用洗涤液洗涤甩干，孔板包被完成；
10.步骤四：标记抗体，取部分步骤二中纯化的马抗尖吻蝮蛇igg与辣根过氧化物酶(hrp)按比例混合，经一系列催化反应，即可获得辣根过氧化物酶标记抗体(hrp-igg)，以此作为夹心抗体；
11.步骤五：包装试剂盒，将步骤三中包被好的48孔板真空密封后与步骤四的夹心抗体装入试剂盒，试剂盒制备完成，按照经典的双抗体elisa夹心法操作说明，即可用于检测动物血清中是否含有尖吻蝮蛇毒素。若p(实验组)od值/n(空白组)od值≥2.1，则提示动物血清中含有尖吻蝮蛇蛇毒。
12.所述饱和硫酸铵法末次离心得到igg后，需透析且过滤后方能进行亲和层析。
13.所述亲和层析法获得的马抗尖吻蝮蛇igg，可采用bca蛋白检测方法测其浓度，也可以采用其他检测蛋白浓度方法，对本发明无影响。
14.所述亲和层析法获得的马抗尖吻蝮蛇igg，需加入蛋白酶抑制剂用以保护抗体的活性。
15.所述待测的人或动物血清，必须是非溶血的血清而非血浆，采血发生溶血的，会影响检测结果。
16.所述尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒制备完成后可于人或动物血清检测，在检测过程还需用到tmb底物溶液11、终止液12和洗涤液6，可直接购买成品亦可购买原料自行配制，不属于本发明的内容，但是作为本发明过程中需要用到的辅助试剂必不可少。
17.所述的检测动物血清时，必须设立空白组，一般设3孔，同一份血清也设3孔，3孔得到的od 值求均值后与空白孔od值均值比较，若出现某孔od值与另外两孔od值差距很大，应剔除后再求均值。p(实验组)od值/n(空白组)od值≥2.1是elisa检测方法中常用的一种阳性评判标准。od值是在选用酶标仪在450nm波长下进行测定获得。
18.与现有的国外技术相比，可检测的蛇毒种类更适合中国本土蛇类；且改良后的双抗体夹心法明显提升多克隆抗体用于诊断的灵敏度和特异度。
附图说明
19.图1为一种基于改良双抗体夹心elisa技术的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒的制备方法示意图。
20.图2为本发明的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒上面观示意图。图3为试剂盒贴膜，用于覆盖试剂盒所有孔，防止使用过程中异物入孔及孔内液体蒸发。
21.附图标记：
22.1-试剂盒盖，2-48孔板，3-试剂盒侧壁外侧面，4-试剂盒前壁外侧面，5-对照血清，6-洗涤液， 7-试剂盒后壁内侧面，8-夹心抗体(hrp-igg)，9-试剂盒侧壁内侧面，10-48孔板中的检测孔，11-tmb底物溶液，12-终止液，13-泡沫软垫。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的、技术方案及有点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例
24.如图1所示，一种基于改良双抗体夹心elisa技术的尖吻蝮蛇蛇毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
25.步骤一：初步提纯，采用饱和硫酸铵方法初步纯化马抗尖吻蝮蛇血浆中的马抗尖吻蝮蛇igg；
26.步骤二：重复提纯，采用亲和层析法(protein g柱)将初步纯化的马抗尖吻蝮蛇igg进一步层析纯化，收集目标峰对应的抗体，再次过柱层析提纯，得到较纯的马抗尖吻蝮
蛇igg；
27.步骤三：包被抗体，取部分步骤二中重复提纯的抗体作为包被抗体包被到48孔板中100ul/孔，孵育完成后将孔板中的液体甩干，用洗涤液洗涤甩干，孔板包被完成；
28.步骤四：标记抗体，取部分步骤二中纯化的马抗尖吻蝮蛇igg与辣根过氧化物酶(hrp)按比例混合，经一系列催化反应，即可获得辣根过氧化物酶标记抗体(hrp-igg)，以此作为夹心抗体8；
29.步骤五：包装试剂盒，将步骤三中包被好的48孔板2真空密封后与步骤四的夹心抗体8装入盒中，试剂盒制备完成，按照经典的双抗体elisa夹心法操作说明，即可用于检测动物血清中是否含有尖吻蝮蛇毒素。若p(实验组)od值/n(空白组)od值≥2.1，则提示动物血清中含有尖吻蝮蛇蛇毒。
30.所述的包被抗体和夹心抗体8是本发明的最关键部分；包被抗体事先被包被到孔板各个孔中，孵育后其自动粘附于孔底，封闭后即可使用；夹心抗体8是由包被抗体与辣根过氧化物酶按比例混合后催化反应获得的。
31.如图2所示，本发明包含了试剂盒子本身盒子盖1，盒子侧壁3和9，盒子前壁4，盒子后壁7，灭菌透明塑胶袋真空密封着的48孔板2，孔板10中包被有包被抗体，对照血清5用于与待测血清作为对照比较，其与洗涤液6、夹心抗体(hrp-igg)8、tmb底物溶液11和终止液12均为独立瓶子包装，取出即可使用，上述的48孔板2、对照血清5瓶、洗涤液瓶6、tmb底物溶液瓶11、终止液瓶12和夹心抗体瓶8在运输过程中均置于泡沫软垫13中避免倾倒；其中所有运输均需在4℃环境中进行，非运输时，对照血清5与夹心抗体8需放置在-20℃或-80℃环境中保存。
32.如图3所示，贴膜14在检测血清过程中用来覆盖所有孔板孔，避免异物落入孔中污染反应液，也避免孔中反应液在孵育时蒸发。
33.所述包被好的48孔板2、洗涤液6、夹心抗体8、对照血清5、tmb底物溶液11和终止液12 等具体的使用方法及顺序如下：打开试剂盒，取出48孔板2，撕去真空塑胶袋，设至少3个孔为空白孔， 1份人或动物血清设3个孔(最多可以同时检测15份人或动物血清)，往3个空白孔中加入对照血清5，各100μl，往另3个待测孔中分别加入100μl待测血清，把贴膜14覆盖孔上相对密封，把48孔板2放置于37℃恒温箱中孵育1小时，随后取出孔板揭开贴膜14，将孔中液体甩干，用洗涤液洗涤各孔，每孔加入300μl洗涤液，等待1-3分钟后甩干孔中液体，再重复洗板2次，往孔板中加入夹心抗体8各100 μ1/孔，覆盖上贴膜14，放到恒温箱中37℃孵育1小时，取出孔板甩干孔中液体再洗板3次，避光条件下往各孔中加入100μl tmb底物溶液11，覆盖贴膜14，放入恒温箱37℃孵育10-20分钟，取出孔板2，揭开贴膜14，直接往各孔中加入终止液50ul。在15分钟内，置于酶标仪中调波长450nm检测各孔od值，若p(实验组)od值/n(空白组)od值≥2.1，则提示动物血清中含有尖吻蝮蛇蛇毒，若达不到此比值，则认为血清中无尖吻蝮蛇蛇毒。
34.所述的包被抗体及夹心抗体8是本发明的关键试剂，属于本发明的自研产品；洗涤液6、tmb 底物溶液11和终止液12均可在市场上购买，不属于本发明自研的产品，但是属于本发明使用过程中必不可少的试剂，本发明中一起装入试剂盒中，方便使用。
35.所述的试剂盒检测人或动物血清的方法是基于经典的双抗体夹心elsia法进行的操作，但夹心 .抗体的选择与经典方法不同，这正是本发明所改良的地方。
36.所述的对照血清5及夹心抗体8需在-20℃或-80℃冰箱中长期保存，包被有包被抗体的48孔板 2、洗涤液6、tmb底物溶液11和终止液12需在4℃冰箱中保存。
37.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引申出的显而易见的变化或变动均应饱含在本发明的保护范围之内。