积雪草五环三萜类成分在制备治疗肠纤维化药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及一类化合物的用途，具体涉及积雪草五环三萜类成分在制备治疗肠纤维化药物中的用途。


背景技术：

2.中药积雪草为伞形科植物积雪草centella asiatica(l.)urban的全草，始载于《神农本草经》，历代的中医药文献和《中国药典》均有记载。性味辛、苦、寒；入心、肺、脾、胃、大肠五经。具有清热利湿，解毒消肿之功效，常用于湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、痈肿疮毒、跌扑损伤等，在亚洲、欧洲和北美均有上百年的药用历史。积雪草主要含有五环三萜类成分，如羟基积雪草苷、羟基积雪草酸、积雪草苷和积雪草酸等，具有抗类风湿性关节炎、抗瘢痕疙瘩、抗胃黏膜损伤和抗肿瘤等药理活性。
3.肠纤维化患者以肠壁结构破坏及瘢痕收缩式肠腔狭窄为主要表现，发病率逐年升高。目前肠纤维化的形成机制尚不十分清楚，但普遍认为是肠道内活化的成纤维细胞引起的胶原代谢紊乱所致。临床尚无针对肠纤维化的有效治疗药物，现有药物仅能靶向控制炎症，而非纤维化过程，虽有一定的疾病缓解作用，但无法逆转肠纤维化所引起的肠道狭窄和肠梗阻等症状，且存在价格昂贵，应答不足等缺陷，亟需开发针对肠纤维化的有效治疗药物。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的在于提供积雪草五环三萜类成分在制备抗肠纤维化药物中的用途。
5.技术方案：积雪草五环三萜类成分在制备治疗肠纤维化药物中的用途。
6.所述积雪草五环三萜类成分包括羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸或积雪草酸。
7.所述羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸或积雪草酸提取自积雪草或其他植物或者经由化学合成获得。
8.所述积雪草五环三萜类成分可经口服、舌下、透皮、注射、滴注、粘膜、喷雾、输液、直肠给药。
9.所述药物由羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸或积雪草酸添加药学上可接受的辅料制成制剂。
10.所述药学上可接受的辅料选自赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂中的一种或几种。
11.所述制剂包括口服剂型和非口服剂型。
12.所述口服剂型包括胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂。
13.所述非口服剂型包括注射剂、输液剂、气雾剂。
14.本发明中建立小鼠肠纤维化模型(一种公认的肠纤维化实验动物模型)，分别口服
给予羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸。实验结果显示，羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸灌胃给药均能够明显改善肠纤维化小鼠体重减轻情况，下调结肠组织羟脯氨酸含量，抑制胶原的分泌，降低α-sma的转录。上述结果表明，羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸对小鼠肠纤维化均具有良好的治疗作用，可用于肠纤维化的治疗。
15.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：本发明通过实验证明了羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸均可以治疗小鼠肠纤维化，显示了积雪草五环三萜类成分在制备治疗肠纤维化药物中良好的应用前景。
附图说明
16.图1是羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸对肠纤维化小鼠体重减轻情况的影响(mean
±
s.e.m.，n＝6-12)，
##
p＜0.01，与正常组比较；
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，与模型组比较；
17.图2是羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸对肠纤维化小鼠结肠重量和长度比值的影响(mean
±
s.e.m.，n＝6-12)，
##
p＜0.01，与正常组比较；
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，与模型组比较；
18.图3是羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸对肠纤维化小鼠结肠组织羟脯氨酸含量的影响(mean
±
s.e.m.，n＝6-12)，
##
p＜0.01，与正常组比较；
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，与模型组比较；
19.图4是羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸对肠纤维化小鼠结肠组织胶原含量的影响(mean
±
s.e.m.，n＝6-12)，
##
p＜0.01，与正常组比较；
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，与模型组比较；
20.图5是羟基积雪草苷、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸对肠纤维化小鼠结肠组织α-sma mrna表达的影响(mean
±
s.e.m.，n＝6-12)，
##
p＜0.01，与正常组比较；
**
p＜0.01，
*
p＜0.05，与模型组比较。
具体实施方式
21.实施例1
22.对肠纤维化小鼠体重减轻现象的影响
23.balb/c小鼠适应性饲养3天，随机分为5组：正常组、模型组、羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组。除正常组外，其他组小鼠每周直肠给予1次45％的2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，tnbs)乙醇溶液，连续7周，每次0.1ml，tnbs的量依次为0.5、0.5、0.75、0.75、1.0、1.0和1.0mg。在建模后第5-7周，羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组小鼠分别灌胃给予上述药物；正常组和模型组小鼠灌胃给予等量溶媒。
24.每天观察并记录小鼠体重变化情况，计算每组平均值。结果如图1所示，与正常组小鼠相比，tnbs模型组小鼠体重自造模后第1周开始明显降低，灌胃给予羟基积雪草苷(50mg/kg)、积雪草苷(50mg/kg)、羟基积雪草酸(25mg/kg)和积雪草酸(25mg/kg)对此呈现
改善作用。
25.实施例2
26.对肠纤维化小鼠结肠重量/长度比值的影响
27.balb/c小鼠适应性饲养3天，随机分为5组：正常组、模型组、羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组。除正常组外，其他组小鼠每周直肠给予1次45％的tnbs乙醇溶液，连续7周，每次0.1ml，tnbs的量依次为0.5、0.5、0.75、0.75、1.0、1.0和1.0mg。在建模后第5-7周，羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组小鼠分别灌胃给予上述药物；正常组和模型组小鼠灌胃给予等量溶媒。
28.末次给药后，处死小鼠，取结肠，测定长度。随后，将肠段剪开，清洗干净内容物，滤纸吸干水分，电子天平称重。最后，计算小鼠结肠重量和长度之间的比值。
29.如图2所示，与正常组小鼠相比，tnbs模型组小鼠结肠重量和长度的比值明显升高，灌胃给予羟基积雪草苷(50mg/kg)、积雪草苷(50mg/kg)、羟基积雪草酸(25mg/kg)和积雪草酸(25mg/kg)可明显下调该比值。
30.实施例3
31.对肠纤维化小鼠结肠组织羟脯氨酸含量的影响
32.balb/c小鼠适应性饲养3天，随机分为5组：正常组、模型组、羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组。除正常组外，其他组小鼠每周直肠给予1次45％的tnbs乙醇溶液，连续7周，每次0.1ml，tnbs的量依次为0.5、0.5、0.75、0.75、1.0、1.0和1.0mg。在建模后第5-7周，羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组小鼠分别灌胃给予上述药物；正常组和模型组小鼠灌胃给予等量溶媒。
33.末次给药后，处死小鼠，取结肠，准确称取10mg组织，置于试管底部，加入1ml水解液，95℃条件下水解20min。在此期间，每隔5min混匀1次。随后，流水冷却试管，加指示剂1滴，调整ph值至6.5左右。管中加入双蒸水至10ml，混匀。取4ml稀释的水解液加入活性炭25mg，混匀，3500rpm离心10min，取上清液1ml。在上清液中加入预先配置好的检测试剂，混匀，60℃水浴15min，3500rpm离心10min。最后，取200μl上清液，于550nm波长处测定吸光度值，计算羟脯氨酸的含量。
34.如图3所示，tnbs模型组小鼠结肠组织中羟脯氨酸含量远高于正常组，灌胃给予羟基积雪草苷(50mg/kg)、积雪草苷(50mg/kg)、羟基积雪草酸(25mg/kg)和积雪草酸(25mg/kg)明显降低结肠组织中的羟脯氨酸含量。
35.实施例4
36.对肠纤维化小鼠结肠组织胶原含量的影响
37.balb/c小鼠适应性饲养3天，随机分为5组：正常组、模型组、羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组。除正常组外，其他组小鼠每周直肠给予1次45％的tnbs乙醇溶液，连续7周，每次0.1ml，tnbs的量依次为0.5、0.5、0.75、0.75、1.0、1.0和1.0mg。在建模后第5-7周，羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组小鼠分别灌胃给予上述药物；正常组和模型组小鼠灌胃给予等量溶媒。
38.末次给药后，处死小鼠，取结肠，准确称取10mg组织，置于玻璃匀浆器中，加入500μl pbs溶液进行匀浆。3000rpm、4℃离心20min，收集上清依据胶原检测试剂盒说明书所述方法，测定胶原的含量。
39.如图4所示，tnbs模型组小鼠结肠组织中胶原含量远高于正常组，灌胃给予羟基积雪草苷(50mg/kg)、积雪草苷(50mg/kg)、羟基积雪草酸(25mg/kg)和积雪草酸(25mg/kg)降低结肠组织中的胶原含量。
40.实施例5
41.对肠纤维化小鼠结肠组织α-smamrna表达的影响
42.balb/c小鼠适应性饲养3天，随机分为5组：正常组、模型组、羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组。除正常组外，其他组小鼠每周直肠给予1次45％的tnbs乙醇溶液，连续7周，每次0.1ml，tnbs的量依次为0.5、0.5、0.75、0.75、1.0、1.0和1.0mg。在建模后第5-7周，羟基积雪草苷(50mg/kg)组、积雪草苷(50mg/kg)组、羟基积雪草酸(25mg/kg)组和积雪草酸(25mg/kg)组小鼠分别灌胃给予上述药物；正常组和模型组小鼠灌胃给予等量溶媒。
43.末次给药后，处死小鼠，取结肠，准确称取20mg组织，置于玻璃匀浆器中，加入1ml trizol试剂进行匀浆。随后，将匀浆液转移至1.5ml无酶ep管中，冰上裂解10min。加入氯仿200μl，充分混匀，冰上静置4min后，12000rpm、4℃离心15min。小心吸取上层无色透明液体至无酶ep管中，加入等体积预冷的异丙醇溶液，冰浴中静置30min，12000rpm、4℃离心10min，去上清。加入75％乙醇-depc溶液洗涤沉淀，7500rpm、4℃离心5min，弃上清，倒置晾干，得总rna，将其逆转录后得到相应的cdna。最后，采用myiq2检测系统实施q-pcr分析，2-δδct
法进行计算，评定α-sma的mrna水平。
44.如图5所示，tnbs模型组小鼠结肠组织中α-sma mrna水平升高至正常组小鼠的2倍左右，灌胃给予羟基积雪草苷(50mg/kg)、积雪草苷(50mg/kg)、羟基积雪草酸(25mg/kg)和积雪草酸(25mg/kg)明显抑制其水平的升高。
45.实施例6
46.羟基积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，装胶囊，制成胶囊剂。
47.羟基积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，加入硬脂酸镁混合，压片，制成片剂。
48.羟基积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，制成颗粒剂。
49.羟基积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量水作湿润剂，制成丸剂。
50.羟基积雪草苷1g，以白砂糖和优质蜂蜜或者木糖醇作甜味剂，白砂糖应先配成65-70％的糖浆，并将10-15％的蜂蜜加入。过滤后，加入稳定剂pvp和防腐剂羟苯乙酯，制成口服液。
51.羟基积雪草苷1g，依次加入月桂氮酮、聚山梨酯80，边搅拌边分次加入适量溶剂，超声溶解，定容至100ml，制成酊剂。
52.积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制
成软材，湿法制粒，装胶囊，制成胶囊剂。
53.积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，加入硬脂酸镁混合，压片，制成片剂。
54.积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，制成颗粒剂。
55.积雪草苷1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量水作湿润剂，制成丸剂。
56.积雪草苷1g，以白砂糖和优质蜂蜜或者木糖醇作甜味剂，白砂糖应先配成65-70％的糖浆，并将10-15％的蜂蜜加入。过滤后，加入稳定剂pvp和防腐剂羟苯乙酯，制成口服液。
57.积雪草苷1g，依次加入月桂氮酮、聚山梨酯80，边搅拌边分次加入适量溶剂，超声溶解，定容至100ml，制成酊剂。
58.羟基积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，装胶囊，制成胶囊剂。
59.羟基积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，加入硬脂酸镁混合，压片，制成片剂。
60.羟基积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，制成颗粒剂。
61.羟基积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量水作湿润剂，制成丸剂。
62.羟基积雪草酸1g，以白砂糖和优质蜂蜜或者木糖醇作甜味剂，白砂糖应先配成65-70％的糖浆，并将10-15％的蜂蜜加入。过滤后，加入稳定剂pvp和防腐剂羟苯乙酯，制成口服液。
63.羟基积雪草酸1g，依次加入月桂氮酮、聚山梨酯80，边搅拌边分次加入适量溶剂，超声溶解，定容至100ml，制成酊剂。
64.积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，装胶囊，制成胶囊剂。
65.积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，加入硬脂酸镁混合，压片，制成片剂。
66.积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量25％乙醇作湿润剂，制成软材，湿法制粒，制成颗粒剂。
67.积雪草酸1g，与微晶纤维素500mg、淀粉500mg混合，用适量水作湿润剂，制成丸剂。
68.积雪草酸1g，以白砂糖和优质蜂蜜或者木糖醇作甜味剂，白砂糖应先配成65-70％的糖浆，并将10-15％的蜂蜜加入。过滤后，加入稳定剂pvp和防腐剂羟苯乙酯，制成口服液。
69.积雪草酸1g，依次加入月桂氮酮、聚山梨酯80，边搅拌边分次加入适量溶剂，超声溶解，定容至100ml，制成酊剂。