基于光子晶体效应增强稀土掺杂上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇传感器及其制备方法与流程

1.本发明属于荧光传感器技术领域，具体涉及一种聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)蛋白石光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4稀土掺杂上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇传感器及其制备方法，该传感器可以在血清中检测胆固醇方面得到应用。


背景技术：

2.胆固醇是人体组织细胞不可缺少的必需物质，在基本的细胞生命活动中起着至关重要的作用。健康人血清胆固醇水平为2.60～5.20mmol/l，研究结果表明人体血液中高水平的胆固醇会导致动脉粥样硬化、心脑血管疾病；而低水平的胆固醇会增加脑出血的风险并降低身体的抵抗力。胆固醇水平是临床生化检查和预防心血管疾病的重要指标。因此，测定血液中的胆固醇对于维持身体健康具有重要的现实意义。
3.目前胆固醇检测有比色法、高效液相色谱法、电化学分析、化学发光和荧光法。其中，荧光技术已成为实时检测活细胞、血清和组织中胆固醇的重要方法。尽管该方法取得了许多进展，但大多数使用的有机染料和纳米发光材料的激发光源为紫外或可见光，而生物分子在此区域具有很强的吸收，容易产生生物自发荧光，严重影响检测灵敏度。因此，探索一种高灵敏度、无干扰和可回收的荧光方法来监测胆固醇水平仍然是一个挑战。
4.稀土掺杂上转换荧光材料纳米颗粒由于其无自荧光、无漂白现象和组织穿透度深的优点，在荧光传感器的构建中受到了广泛关注。然而，由于稀土离子吸收截面小，荧光量子产率低，限制了其在生物荧光传感器中的进一步应用。因此提高上转换荧光强度以提高生物检测的灵敏度是非常重要的。利用光子晶体效应已成为了一种提高上转换发光强度的有效手段。因此，开发基于光子晶体效应增强稀土掺杂荧光材料的荧光探针或系统，用于血清中胆固醇的高灵敏度检测，具有重大的实际意义和应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于pmma蛋白石光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4稀土掺杂上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇传感器及其制备方法。本发明旨在利用光子晶体效应来增强上转换发光，进而提高检测的灵敏度。通过构建非接触式传感器，提供一种无干扰和可回收利用的检测胆固醇荧光的方法，该传感器可以在血清中检测胆固醇方面得到应用。
6.本发明首先制备lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子与pmma蛋白石光子晶体复合薄膜来增强上转换发光进而提高检测的灵敏度，并构建了一种非接触式荧光传感器。基于胆固醇级联反应产生的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)氧化产物(ox tmb)对lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子强近单色红光的猝灭作用，根据红光强度变化与胆固醇浓度的线性关系来定量检测胆固醇。该荧光传感器对胆固醇的检测具有灵敏度高，特异性好和稳定性强的优点，在全血检测中具有广阔的应用前景。
7.本发明所述的一种基于pmma蛋白石光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇传感器的制备方法，其步骤如下：
8.(1)核壳结构的lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的合成：利用高温溶剂热法首先制备粒径20～25nm lierf4:0.5％tm
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裸核，然后在lierf4:0.5％tm
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裸核上外延生长liyf4惰性壳层，得到粒径30～35nm lierf4:0.5％tm
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@liyf4核壳结构上转换纳米粒子，最后将lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子分散到环己烷溶液中；
9.(2)pmma蛋白石光子晶体薄膜的制备：制备微球平均直径在350～450nm之间的单分散pmma微球溶液，然后将清洁的载玻片垂直插入单分散pmma微球溶液中，在30～40℃条件下保持20～25h，将载玻片取出后烘干，再将烘干后的载玻片在120～140℃条件下加热40～60min，从而在载玻片上得到pmma蛋白石光子晶体薄膜；
10.(3)pmma蛋白石光子晶体与lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的复合：将pmma蛋白石光子晶体薄膜固定在旋转台上，在400～600r/s转速下，将0.5～1.5ml、0.5～1.0mmol/ml的lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的环己烷溶液喷涂到pmma蛋白石光子晶体薄膜上；随着环己烷的蒸发，lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子自组装到光子晶体薄膜上，在载玻片上得到光子晶体与上转换纳米粒子的复合薄膜；
11.(4)在光子晶体与上转换纳米粒子的复合薄膜上覆盖一层厚度50～150μm的超薄玻璃板以隔离待测液体与复合薄膜，再在超薄玻璃板上粘有带有正方形孔洞的亚克力板以容纳待测液体，亚克力板的尺寸小于或等于超薄玻璃板的尺寸，从而得到基于pmma蛋白石光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇传感器。
12.本发明所述的一种基于pmma蛋白石光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇传感器，其是由上述方法制备得到。
13.工作原理：
14.本发明利用光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子发光，提高检测的灵敏度。在980nm的激发下，基于胆固醇级联反应产生的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)的氧化产物(ox tmb)能猝灭lierf4:0.5％tm
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@liyf4强的近单色红光，根据荧光强度的变化与胆固醇浓度的线性关系实现溶液及血清中胆固醇的定量检测。
15.本发明制备的基于光子晶体效应增强lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子发光的非接触式胆固醇荧光传感器具有以下优点：
16.1.利用光子晶体效应使得lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的发光强度得到数十倍增强，提高了胆固醇检测的灵敏度。
17.2.由于lierf4:0.5％tm
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@liyf4中er
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离子具有丰富的阶梯状能级，在多种激光(800nm、980nm、1530nm)的激发下均能产生近单色的红光发射，能够拓宽激发光源，有益于胆固醇检测的广泛应用。
18.3.测试采用激发光(980nm)处于近红外波段，能够消除来自生物样品的背景干扰，提高检测的灵敏度，同时具有良好的选择性和稳定性。
19.4.非接触式传感器可实现对血清样品无干扰、无污染的非接触式无损检测，且能循环使用，简化了检测方法并极大的降低了成本。
附图说明
20.图1：本发明所述的基于光子晶体效应增强上转换纳米粒子的非接触式胆固醇传感器的结构示意图；各部件名称为：载玻片1、光子晶体薄膜2、上转换纳米粒子3、超薄玻璃板4、带有正方形孔洞的亚克力板5、正方形孔洞6。
21.图2：检测例1中非接触式胆固醇传感器上lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子在980激发下上转换发光随胆固醇浓度变化曲线。
22.图3：检测例1中非接触式胆固醇传感器上lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子在980激发下红光强度淬灭(f/f0)与胆固醇浓度的线性关系图，其中f/f0为体系中加胆固醇和不加胆固醇后的上转换红光发射积分强度比值。
23.图4：检测例3的干扰检测结果统计图。
24.图5：本发明的原理图。将检测例1中配制的含不同浓度胆固醇的待测液滴加到实施例3中制备的非接触式胆固醇传感器上，在980nm激发下，lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的红光会被胆固醇级联反应产生的ox tmb猝灭，胆固醇浓度越高，产生的ox tmb越多，猝灭越显著。根据荧光强度的变化与胆固醇浓度的线性关系实现溶液及血清中胆固醇的定量检测。
具体实施方式
25.实施例1：lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的合成
26.以下实施例中，lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子通过参考文献(li,z.,zhang,y.,nanotechnology,2008.19,345606)中记载的高温溶剂热法制备而得。
27.(1)首先将tmcl3·
6h2o(0.005mmol)、ercl3·
6h2o(0.995mmol)、14ml十八烯(ode)和6ml油酸(oa)在50ml烧瓶中混合并搅拌30分钟。将上述溶液升温到160℃，持续40分钟，然后冷却到50℃。加入10ml含有lioh(2.500mmol)和nh4f(4.000mmol)的甲醇溶液，并加热至70℃反应40分钟。然后将混合物升温到300℃，持续90分钟，并冷却到50℃，用丙酮和乙醇离心后得到lierf4:0.5％tm
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裸核。最后，将lierf4:0.5％tm
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裸核溶解在8ml的环己烷中待用。请注意，在整个实验过程中，连续的氮气流和搅拌是必要的。
28.(2)将ycl3·
6h2o(0.750mmol)、10ml ode和5ml oa的混合物在50ml烧瓶中混合并搅拌30分钟。将上述溶液升温至160℃，持续40分钟，然后冷却至50℃。再加入4ml含有步骤(1)中制备的lierf4:0.5％tm
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裸核的环己烷溶液，并升温到85℃反应30分钟，然后冷却到50℃。加入5ml含有lioh(1.875mmol)和nh4f(3.000mmol)的甲醇溶液，并加热到70℃，持续30分钟。再将溶液升温至300℃，持续60分钟，然后冷却至50℃，用丙酮和乙醇洗涤离心后得到lierf4:0.5％tm
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@liyf4核壳结构上转换纳米粒子；最后将lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子溶解在4ml的环己烷中，待用。
29.实施例2：pmma光子晶体结构的制备
30.以下实施例中，光子晶体的合成是参考文献(yin,z.,li,h.,xu,w.,cui,s.,zhou,d.,chen,x.,zhu,y.,qin,g.,song,h.,2016.advanced materials 28,2518～2525)中记载的垂直沉积法制备而得。
31.用100ml、5mg ml-1
naoh水溶液清洗20ml甲基丙烯酸甲酯(mma)7次，然后将6ml清洗过的mma与80ml去离子水混合并加热，加入36mg k2s2o8，在90℃下反应90分钟，得到平均直
径尺寸为424nm单分散的pmma微球溶液。将清洗过的载玻片垂直插入pmma微球溶液中，在35℃下保持24小时，干燥，随后加热到130℃下维持60分钟，从而在载玻上得到pmma蛋白石光子晶体薄膜。
32.实施例3：光子晶体效应增强稀土掺杂上转换发光的非接触式胆固醇传感器的制备
33.将实施例2制备好的pmma蛋白石光子晶体薄膜连同载玻片固定在旋转台上，启动旋转台转速为500r/s，用喷枪将1ml、0.8mmol ml-1
实施例1制备好的lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子的环己烷溶液喷涂到光子晶体薄膜上。随着环己烷的蒸发，lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子自组装在光子晶体薄膜的表面，得到pmma蛋白石光子晶体与上转换纳米粒子复合薄膜。然后在光子晶体与上转换纳米粒子的复合薄膜上覆盖一层厚度为100μm、长度为7.5cm、宽为2.5cm的超薄玻璃板以隔离待测液体与复合薄膜，并在超薄玻璃板上粘贴上带有边长为0.6cm的正方形孔洞的长度为6.0cm、宽度为2.5cm、厚度为0.3cm的亚克力板以容纳待测液体，从而得到基于光子晶体效应增强上转换的非接触式胆固醇传感器。
34.检测例1：非接触式传感器对胆固醇含量的检测
35.将100μl磷酸盐缓冲液(0.1m，ph 7.0)、100μl胆固醇氧化酶(0.16u ml-1
)、200μl去离子水和100μl不同浓度(0μm、2μm、4μm、6μm、8μm、10μm、20μm、30μm、40μm、80μm、100μm、200μm)的胆固醇溶液(溶于甲醇)混合并在37℃下孵育30分钟，再将100μl醋酸缓冲液(0.1m，ph 4.0)、100μl辣根过氧化物酶(6mu ml-1
)、100μl 20mm tmb和1.2ml去离子水，在37℃下加入上述混合物30分钟。将得到的混合溶液注入到实施例3所述的正方形孔洞内，然后利用型号为quant master 8000的荧光光谱仪监测lierf4:0.5％tm
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@liyf4上转换纳米粒子在非接触式胆固醇传感器上的上转换发射光谱。结果见图2，随着胆固醇浓度的增加，红光强度逐渐减弱。同时胆固醇浓度与红光强度淬灭(f/f0)在2～30μm之间具有较好的线性关系，满足f/f0＝0.942-0.023c(μm)方程(其中f/f0为体系中加胆固醇和不加胆固醇的上转换红光发射积分强度比值，c为胆固醇浓度，单位为μm)，如图3所示。
36.检测例2：对血清中胆固醇的检测
37.本发明使用的人血清由吉林大学第一医院友情提供。
38.表1：应用非接触式胆固醇传感器检测人血清样品中的胆固醇含量
[0039][0040]
将人血清用去离子水稀释50倍，将稀释后的血清样品1、2和3代替检测例1中的胆固醇溶液，通过检测例1的方法对血清中的胆固醇进行检测。结果如表1所示，通过本发明的非接触式胆固醇荧光传感器测出的胆固醇检出浓度与临床上采用的酶联免疫法测得的胆
固醇浓度(临床数据)的相对标准偏差(rsd＝标准偏差/平均值)低于11.0％，结果表明本发明所述的胆固醇传感器可用于定量检测复杂血清样品中的胆固醇。
[0041]
检测例3：非接触式传感器对胆固醇含量的特异性检测
[0042]
与检测例1类似，进行检测特异性验证，分别加入2mm的葡萄糖、尿素、尿酸、抗坏血酸、半胱氨酸、氯化镁及20μm、100μm的胆固醇代替检测例1中的胆固醇进行特异性检测，测试结果如图3。从图中可以看出，只有加入胆固醇的样品，实现了红光上转换发射光谱的下降，而其他样品均未对荧光光谱信号产生影响，从而证实我们的实验方案可以实现胆固醇的特异性检测。