检测血清中15种胆汁酸的方法与流程

8.5min，35％b，8.5-8.6min，10％b，8.6-10min，10％b；流速0.6ml/min。
15.优选的是，所述步骤2)中，色谱柱为kinetex c18。
16.优选的是，所述步骤2)中，质谱条件为：负离子模式，采用esi源，碰撞气12psi，气帘气16psi，雾化气50psi，辅助加热气60psi，喷雾电压-4500v，雾化温度500℃。
17.本发明的有益效果是：本发明提供的检测血清中15种胆汁酸的方法，在样本处理中通过增加氮吹后复溶再离心的步骤，并配合以甲醇乙腈为沉淀剂、乙腈为水复溶液的方案，极大的提高了测试前样本的纯净度和色谱柱使用寿命，同时还能有效提高目标物质的响应，降低定量限，提高检测准确度；本发明可一次进样同时精确检测不同类型的胆汁酸，分析时间短，分析速度快。
附图说明
18.图1为本发明中的胆汁酸标品图；
19.图2-16为本发明中构建的15种胆汁酸的标准曲线；
20.图17a-17b、18a-18c为本发明实施例2中氮吹步骤的优化对比结果；
21.图19a-19b、20a-20e、21a-21b为本发明实施例2中复溶液的优化对比结果；
22.图22a-22c为本发明实施例2中沉淀剂优化的优化对比结果。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
24.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
25.实施例1
26.本实施例提供一种检测血清中15种胆汁酸的方法。
27.一、试剂、仪器说明
28.(1)标准品(胆酸ca、脱氧胆酸dca、鹅脱氧胆酸cdca、熊脱氧胆酸udca、甘氨胆酸gca、甘氨脱氧胆酸gdca、甘氨鹅脱氧胆酸gcdca、甘氨熊脱氧胆酸gudca、牛磺胆酸tca、牛磺脱氧胆酸tdca、牛磺鹅脱氧胆酸tcdca、牛磺熊脱氧胆酸tudca、石胆酸lca、甘氨石胆酸glca、牛磺石胆酸tlca)均购自上海甄准生物科技有限公司；
29.(2)内标品(胆酸-d4 ca-d4、脱氧胆酸-d4 dca-d4、鹅脱氧胆酸-d4 cdca-d4、熊脱氧胆酸-d4 udca-d4、甘氨胆酸-d4 gca-d4、甘氨脱氧胆酸-d4 gdca-d4、甘氨鹅脱氧胆酸-d4 gcdca-d4、甘氨熊脱氧胆酸-d4 gudca-d4、牛磺胆酸-d4 tca-d4、牛磺脱氧胆酸-d4 tdca-d4、牛磺鹅脱氧胆酸-d4 tcdca-d4、牛磺熊脱氧胆酸-d4 tudca-d4、石胆酸-d4 lca-d4、甘氨石胆酸-d4 glca-d4、牛磺石胆酸-d4 tlca-d4)均购自上海谱芬生物科技有限公司；
30.(3)甲醇：使用fisher chemical公司67-56-1号试剂，纯度为lc/ms级，常温密封储存；
31.(4)乙腈：使用fisher chemical公司75-05-8号试剂，纯度为lc/ms级，常温密封储存；
32.(5)水：符合国标gb/t 6682-2008的一级水。
33.二、检测方案
34.1、试剂配制
35.(1)配制胆汁酸的标准品工作液组sw，精确称量1mg标准品，使用1ml甲醇充分溶解，得到1mg/ml母液，经稀释后得到工作液组sw，浓度如下：
[0036][0037]
(2)生物标准曲线样品的制备
[0038]
精密吸取90μl的空白基质(牛血清)，加入10μl标准品的工作溶液sw1-sw8，涡旋混匀，经前处理过程，制备得到生物标准曲线样品组s1-s8，浓度如下：
[0039]
[0040][0041]
(3)配制内标工作液isw
[0042]
将内标母液1mg/ml经稀释后得到内标工作液isw，浓度如下：
[0043]
[0044][0045]
2、样品处理与标准曲线构建：
[0046]
(1)样本制备
[0047]
每个待测血清样本吸取100μl，冷冻储存备用；
[0048]
(2)样本处理：
[0049]
取出待测样本解冻，取生物标准曲线样本，对生物标准曲线样本和待测样本均进行如下操作，且检测时，先检测生物标准曲线样本，并构建出标准曲线，然后检测待测样本：
[0050]
加入内标工作液10μl，然后加入沉淀剂(体积比，甲醇：乙腈＝1:1)200μl，2500转涡旋混匀5min；于4℃下14000转离心10min；取上清液200μl，40℃氮气下吹干；使用100μl复溶液(体积比，乙腈：水＝3:7)复溶，涡旋震荡5min；最后，于4℃下14000转离心10min；取上清液100μl作为测试样本。
[0051]
3、上机检测
[0052]
将测试样本在液相色谱(珂睿)-串联质谱(天津国科htq2020)设备中进行检测。采用多反应监测(mrm)扫描方式，色谱测试条件为：流动相a为水溶液；流动相b为乙腈溶液；洗针液为乙腈水(1:1)；色谱柱为kinetex c18，50*3mm，2.6μm；柱温为50℃；检测时间为10min；进样量为10μl；梯度洗脱条件：0-1min，10％b，1-1.5min，17％b，1.5-3.5min，25％b，3.5-4.6min，30％b，4.6-6.5min，30％b，6.5-6.6min，35％b，6.6-8.5min，35％b，8.5-8.6min，10％b，8.6-10min，10％b；流速0.6ml/min。质谱条件为负离子模式，采用esi源，碰撞气12psi，气帘气16psi，雾化气50psi，辅助加热气60psi，喷雾电压-4500v，雾化温度500℃。化合物质谱参数如下：
[0053]
[0054][0055][0056]
参照图1，为胆汁酸标品图；图2-16为构建的15种胆汁酸的标准曲线
[0057]
实施例2对比实验
[0058]
本发明中，通过对样本处理步骤、试剂等进行优化，能显著提升检测效果。
[0059]
1、氮吹步骤优化的效果
[0060]
(1)相同浓度样本的响应有了明显的提高：
[0061]
进样浓度(250ng/ml的dca、500ng/ml的cdca、250ng/ml的udca)下，不加氮吹(优化前)后，复溶再离心步骤之后的响应如图17a所示；加入氮吹(优化后)后，复溶再离心步骤之后的响应如图17b所示。
[0062]
响应对比结果如下表1：
[0063]
表1
[0064][0065]
通过数据对比可以看出，以脱氧胆酸(dca)、鹅脱氧胆酸(cdca)、熊脱氧胆酸(udca)优化前后响应对比为例，加入氮吹后复溶再离心步骤可以有效提升目标物的响应，强度提升20倍以上、峰面积提升15倍以上。本发明中，加入氮吹后复溶步骤可以起到浓缩样本的作用，另外使用优化后的复溶液进样而不是直接取上清进样，可以更加完美的匹配液相流动相的配比，峰型较优化前也有了明显的改善。
[0066]
(2)增加色谱柱的使用寿命
[0067]
初始混标出峰情况如图18a所示，不加氮吹(优化前)，复溶再离心步骤之后，测试20针处理后样本峰型变化如图18b所示；加入氮吹(优化后)，复溶再离心步骤之后，测试20针处理后样本峰型变化如图18c所示。具体对比数据如下表2所示。
[0068]
表2
[0069][0070]
可以看出，优化后测试20针处理后样本后响应及峰型基本一致，可是优化前结果较差，峰展宽且强度降低50％左右，峰面积降低30％左右。主要原因在于，优化后的前处理样本更加洁净，进色谱柱后对柱子无污染，相反优化前的前处理方法洁净度不高，进样后柱子中会有蛋白或者磷脂残留，导致柱效降低，峰型变差且响应降低。
[0071]
2、复溶液优化的效果
[0072]
(1)复溶液中有机相的选择
[0073]
本实验中进行了30％乙腈水和30％甲醇水的对比，以胆酸(ca)为例，进样相同浓度情况下，30％乙腈水的响应结果如图19a所示，30％甲醇水的响应结果如图19b所示。具体对比数据如下表3所示。
[0074]
表3
[0075]
复溶液配比ca峰强度ca峰面积30％乙腈水5.13e51.52e630％甲醇水4.05e51.59e6
[0076]
从结果可以看出，复溶液使用乙腈与甲醇时，峰面积响应基本一致，可是使用乙腈时胆酸的峰强度响应更高，从峰型上看，使用乙腈时峰型更窄且对称，使用甲醇时峰宽且有前沿峰；而且理论上液质方法开发中复溶液的选择不要引入流动相以外的试剂为宜，所以很明显，30％乙腈水作为复溶液相比于30％甲醇水更加适用于本发明的方法。
[0077]
(2)复溶液的配比
[0078]
本实验中，测试了相同进样浓度下，10％、20％、30％、40％、50％的复溶液的响应比较，以石胆酸(lca)为例，10％-50％的乙腈水溶液下的响应如图20所示，图20a：10％，图20b：20％，图20c：30％，图20d：40％，图20e：50％。具体对比数据如下表4所示。
[0079]
表4
[0080]
复溶液配比lca峰强度lca峰面积
10％乙腈水1.41e54.77e520％乙腈水5.29e51.91e630％乙腈水9.97e53.75e640％乙腈水9.49e53.44e650％乙腈水5.30e52.23e6
[0081]
可见使用30％乙腈水和40％乙腈水时lca的响应最强，且相近。在此基础上，对比了胆酸(ca)的响应：如图21a(30％乙腈水)和21b(40％乙腈水)，具体对比数据如下表5所示。
[0082]
表5
[0083]
复溶液配比ca峰强度ca峰面积30％乙腈水5.13e51.52e640％乙腈水4.02e51.38e6
[0084]
可以看出，使用30％乙腈水作为复溶液时目标物响应最高。
[0085]
3、沉淀剂优化的效果
[0086]
本实验中，以牛磺熊脱氧胆酸(tudca)为例，对甲醇、乙腈、甲醇乙腈(体积比，1:1)作为沉淀剂的情况下，测试了处理相同浓度样本时的响应，甲醇沉淀剂的结果如图22a所示，乙腈沉淀剂的结果如图22b所示，甲醇乙腈(1:1)沉淀剂的结果如图22c所示，具体数据如下表6所示。
[0087]
可以看出，在15种胆汁酸种浓度最低的牛磺熊脱氧胆酸(tudca)测试结果中，使用甲醇乙腈(1:1)作为沉淀剂效果最好，响应较甲醇沉淀剂高出79％，较乙腈沉淀剂高出63％，只有甲醇乙腈沉淀剂才能够将tudca下限检出。
[0088]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。