一种血细胞染色方法与流程

羟乙基哌嗪-n
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2-乙磺酸（hepes）、n-3-（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸（tes）、三羟甲基甲胺基丙磺酸（taps）、硼酸盐、3-(n-吗啉基)丙磺酸（ mops）、n-氨基甲酰甲基乙磺酸（aces）、哌嗪-n，n
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二（2-乙磺酸）（pipes）中的一种或多种的组合物。
6.优选地，缓冲剂e为磷酸盐，并不是磷酸盐是缓冲溶液中最好的，主要是血液存在的血浆环境也是磷酸盐体系，是最接近血液生存环境的。
7.优选地，防腐剂包括叠氮化钠、硫柳汞、庆大霉素、proclin150、proclin200、proclin300和proclin5000中的一种或多种的组合物。
8.优选地，溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙二醇、乙腈、甘油、乙酸乙酯、丙酮、二甲亚砜、四氢呋喃中的一种或多种的组合物。
9.所述制作工艺x的具体过程如下，s1 称量荧光试剂c、d-海藻糖、溶剂依次放入干净的透明的玻璃瓶，盖上瓶盖摇晃至溶解充分，；配比后的荧光试剂c的含量为0.05-5g/l、d-海藻糖含量为0.5-35g/l；s2 用10-100ml注射器连接0.22um或0.45um过滤头，过滤s1中的液体放置在10-100ml干净的棕色玻璃瓶，4至8度冷藏保存；s3 将s2中的荧光试剂分装成10-30ul/支，放置在37度至60度烤箱烤干，或者冷冻干燥后备用，室温避光干燥储存。
10.上述制作工艺x的优点：（1）单人份提供，即开即用，增加了试剂的开瓶有效期；（2）单人份提供，方便客户计划采购与使用；（3)干粉装供给，降低了试剂的批间差，提高了试剂的稳定性，有效期更有保证；（4）干分装试剂方便运输、储存。
11.所述制作工艺y的具体过程如下，且配比后各物质含量为：缓冲剂 e 6-15g/l,防腐剂0.1-0.5 ml/l,其余物质为溶剂；s1 量取溶剂、缓冲剂e依次加入烧杯中，搅拌溶解完全；s2 称量氯化钠、含量比范围0.65%-0.85%、放入s1中的烧杯中，搅拌溶解完全；s3 称量乙二酸四乙酸二钠或乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钾，含量为1.5-2.2mg/ml、放入s2中的烧杯中，搅拌溶解完全；s4 量取防腐剂放入s3的烧杯中，搅拌均匀；s5用0.1%-10%hcl调s4溶液至ph7.3-7.7，搅拌均匀，静置15-60分钟；s6 用0.22um或0.45um滤头过滤s5中的液体后放置在干净的透明试剂瓶，室温密闭保存；s7 将s6中的缓冲液分装成470-1500ul/支备用，室温密闭储存。
12.上述制作工艺y的优点：（1）单人份提供，即开即用，增加了试剂的开瓶有效期；（2）单人份提供，方便客户计划采购与使用；（3）严格控制渗透压、ph值的细胞等渗溶液，血细胞能长时间保持正常形态、活性。
13.所述微流控卡壳包括卡壳本体、卡壳盖、加样孔、观察室1、观察室2、排气孔1和排气孔2；卡壳盖盖在卡壳本体的上表面，卡壳盖为塑料材质，卡壳本体为玻璃材质；卡壳本体上表面左端的中间位置开设有加样孔；卡壳本体中部中心位置前后两边分别开设有观察室1和观察室2；观察室1和观察室2的右方分别对应开设有排气孔1和排气孔2；观察室1和观察室2的长、宽、高不同、观察室1高度低于观察室2高度，且观察室1和观察室2的长、宽和高相交的
位置均为圆弧状、非成夹角状；加样孔分别与观察室1和观察室2通过通道相通，观察室1和观察室2分别与排气孔1和排气孔2通过通道相通。
14.上述结构设置的目的是：1)观察室1和2的长宽高设置不同的，考虑到正常血液中相同体积内红细胞个数是白细胞个数的1000倍，观察红细胞用观察室1，观察白细胞用观察室2，观察室1高度低于观察室2高度，保证拍照时，视野中红细胞不重叠，白细胞数量不会太少，便于后续的统计分析；2)观察室内的长宽高夹角做成圆弧的主要是便于血细胞在观察室内分布均匀，不会出现角落中细胞偏多，影响后续的分析统计。
15.具体使用：将荧光试剂加入血液混匀后，用吸液管吸取0.2-0.4ml加入微流控卡壳的加样孔，混匀了血液的荧光试剂会自动充满微流控卡壳（忌大幅摇晃与颠倒放置）。最后，将填充了试剂的微流控卡壳插入血细胞分析仪，屏幕点击测试即可。
16.使用优点：鉴于目前很多机器法，使用同一个加样针取样，在同一个混合槽中混合，试剂从同一个管路流过，这样在分析不同样本的时候，使用了相同的加样针、混合槽和管路，这样不同样本之间就存在试剂残留和样本的交叉污染，本发明使用上述微流控卡壳，一次性使用，单人份提供，无样本交叉污染，无试剂残留污染；完全模拟手工染色法，活细胞染色后在卡壳中能很快的沉降，均匀排布，便于机器拍照计数。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1. 试剂单人份提供，节约了成本，减少了浪费，更适合门诊、诊所及私人医生等特殊需求；2. 荧光试剂提供干粉装，降低了试剂的批间差，提高了试剂的稳定性，提高检验的准确率；3. 染色时间短，效果好，操作便捷；4. 使用微流控卡壳，一次性使用，单人份提供，无样本交叉污染，无试剂残留污染。
附图说明
18.图1为本发明的配方一的人血wbc-中性粒细胞（neu）荧光染色效果图片；图2为本发明的配方一的人血wbc-单核细胞（mon）荧光染色效果图片；图3为本发明的配方一的人血wbc-淋巴细胞（lym）荧光染色效果图片；图4为本发明的配方一的人血wbc-嗜酸性粒细胞（eos）荧光染色效果图片；图5为本发明的配方一的人血wbc-嗜碱性粒细胞（bas）荧光染色效果图片；图6为本发明的配方一的人血plt荧光染色效果图片；图7为本发明的配方二的人血wbc-中性粒细胞（neu）荧光染色效果图片；图8为本发明的配方二的人血wbc-单核细胞（mon）荧光染色效果图片；图9为本发明的配方二的人血wbc-淋巴细胞（lym）荧光染色效果图片；图10为本发明的配方二的人血wbc-嗜酸性粒细胞（eos）荧光染色效果图片；图11为本发明的配方二的人血wbc-嗜碱性粒细胞（bas）荧光染色效果图片；
图12为本发明的配方二的人血plt荧光染色效果图片；图13为本发明的配方八的人血wbc-中性粒细胞（neu）荧光染色效果图片；图14为本发明的配方八的人血wbc-单核细胞（mon）荧光染色效果图片；图15为本发明的配方八的人血wbc-淋巴细胞（lym）荧光染色效果图片；图16为本发明的配方八的人血wbc-嗜酸性粒细胞（eos）荧光染色效果图片；图17为本发明的配方八的人血wbc-嗜碱性粒细胞（bas）荧光染色效果图片；图18为本发明的配方八的人血plt荧光染色效果图片；图19为本发明微流控卡壳本体的外观立体图；图20为本发明微流控卡壳本体的内部腔道结构示意图；图19、20中标号说明：1、卡壳本体；2、加样孔；3、观察室1；4、观察室2；5、排气孔1；6、排气孔2。
19.具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.请参阅图1-20，本发明提供以下几种实施例：荧光试剂配方一sybr green i 0.75g/l磷酸盐缓冲溶液 20mmol/lproclin300防腐剂0.4ml/l溶剂为水荧光试剂配方二吖啶橙0.20g/ldapi
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0.30g/l磷酸盐缓冲溶液
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20mmol/lproclin300防腐剂
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0.4ml/l溶剂为水荧光试剂配方三sybr green i1.20g/ldapi
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0.60g/l磷酸盐缓冲溶液 20mmol/lproclin300防腐剂
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0.4ml/l溶剂为水荧光试剂配方四赫斯特333420.25g/l三羟甲基氨基盐酸盐（tris） 20mmol/l
叠氮化钠
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0.5g/l溶剂为水荧光试剂配方五4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi） 0.25g/l三羟甲基氨基盐酸盐（tris）20mmol/lproclin150 0.5ml/l溶剂为水荧光试剂配方六赫斯特33342 0.25g/l奎纳克林芥子 0.15g/ln-2-羟乙基哌嗪-n
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2-乙磺酸（hepes）20mmol/l庆大霉素
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0.15g/l溶剂为水荧光试剂配方七4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi） 0.6g/l硫代黄素t
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0.25g/ln-2-羟乙基哌嗪-n
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2-乙磺酸（hepes）20mmol/lproclin300防腐剂
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0.4ml/l溶剂为水荧光试剂配方八sybr green i
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1.20g/l奎纳克林芥子
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0.25g/l哌嗪-n，n
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二（2-乙磺酸）（pipes） 20mmol/l叠氮化钠
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0.5g/l溶剂为水以配方三为例1）荧光试剂配制过程如下：s1 称量12mg sybr green i 放入干净的20ml透明的玻璃瓶；s2 称量6mg dapi放入s1中的干净的20ml透明玻璃瓶；s3 称量0.19g d-海藻糖放入s2中的干净的20ml透明玻璃瓶；s4 量取10ml蒸馏水放入s3中的20ml透明玻璃瓶中，盖上瓶盖摇晃至溶解充分，静置15分钟；s5 用10ml注射器连接0.22um过滤头，过滤s4中的液体放置入10ml干净的棕色玻璃瓶，4-8度冷藏保存；s6 将s5中的荧光试剂分装成10ul/支，放置37度烤箱烤干或者冷冻干燥后备用，室温避光干燥储存。
22.2）缓冲液配制过程如下：s1 量取500ml蒸馏水放入干净的1000ml烧杯中；s2 称量十二水和磷酸氢二钠3.58g放入s1中的烧杯中，搅拌溶解完全；
s3 称量3.41g氯化钠放入s2中的烧杯中，搅拌溶解完全；s4 称量0.055g乙二酸四乙酸二钠放入s3中的烧杯中，搅拌溶解完全；s5 量取0.25ml proclin300放入s4的烧杯中，搅拌均匀；s6 用0.5%hcl调s5溶液至ph7.5，搅拌均匀，静置15分钟；s7 用0.22um滤头过滤s6中的液体进入500ml干净的透明试剂瓶，室温密闭保存；s8 将s7中的缓冲液分装成490ul/支备用，室温密闭储存。
23.3）血细胞染色，步骤如下：s1、取一管10ul/支烤干了的荧光试剂a，将分装成490ul/支缓冲液b直接倒入荧光试剂a管中后，盖好管盖，上下摇晃混匀30秒；s2、用50ul一次性的无菌吸管吸取10ul全血，混入s1中，充分混匀30秒；s3、用0.5ml一次性无菌吸管将s2中的溶液吸取0.2ml充入一次性的微流控卡壳中；s4、将微流控卡壳插入血细胞分析仪（poct），5分钟后自动分析出样本的测试结果；以配方二为例1）荧光试剂配制过程如下：s1 称量2mg吖啶橙 放入干净的20ml透明的玻璃瓶；s2 称量3mg dapi放入s1中的干净的20ml透明玻璃瓶；s3 称量0.19g d-海藻糖放入s2中的干净的20ml透明玻璃瓶；s4 量取10ml蒸馏水放入s3中的20ml透明玻璃瓶中，盖上瓶盖摇晃至溶解充分，静置20分钟；s5 用10ml注射器连接0.22um过滤头，过滤s4中的液体放置入10ml干净的棕色玻璃瓶，6度冷藏保存；s6 将s5中的荧光试剂分装成15ul/支，放置在50度烤箱烤干或者冷冻干燥后备用，室温避光干燥储存。
24.2）缓冲液配制过程如下：s1 量取500ml蒸馏水放入干净的1000ml烧杯中；s2 称量十二水和磷酸氢二钠3.58g放入s1中的烧杯中，搅拌溶解完全；s3 称量3.41g氯化钠放入s2中的烧杯中，搅拌溶解完全；s4 称量0.055g乙二酸四乙酸二钠放入s3中的烧杯中，搅拌溶解完全；s5 量取0.25ml proclin300放入s4的烧杯中，搅拌均匀；s6 用5%hcl调s5溶液至ph7.5，搅拌均匀，静置30分钟；s7 用0.22um滤头过滤s6中的液体进入500ml干净的透明试剂瓶，室温密闭保存；s8 将s7中的缓冲液分装成970ul/支备用，室温密闭储存。
25.3）血细胞染色，步骤如下：s1、取15ul/支烤干了的荧光试剂a，将分装成970ul/支缓冲液b直接倒入荧光试剂a管中后，盖好管盖，上下摇晃混匀45秒；s2、用50ul一次性的无菌吸管吸取30ul全血，混入s1中，充分混匀50秒；s3、用3ml一次性无菌吸管将s2中的溶液吸取0.3ml充入一次性的微流控卡壳中；
s4、将微流控卡壳插入血细胞分析仪（poct），10分钟后自动分析出样本的测试结果；以配方八为例1）荧光试剂配制过程如下：s1 称量12mg sybr green i放入干净的20ml透明的玻璃瓶；s2 称量2.5mg 奎纳克林芥子放入s1中的干净的20ml透明玻璃瓶；s3 称量0.19g d-海藻糖放入s2中的干净的20ml透明玻璃瓶；s4 量取10ml蒸馏水放入s3中的20ml透明玻璃瓶中，盖上瓶盖摇晃至溶解充分，静置15分钟；s5 用100ml注射器连接045um过滤头，过滤s4中的液体放置入100ml干净的棕色玻璃瓶，4-8度冷藏保存；s6 将s5中的荧光试剂分装成30ul/支，放置在60度烤箱烤干或者冷冻干燥后备用，室温避光干燥储存。
26.2）缓冲液配制过程如下：s1 量取500ml蒸馏水放入干净的1000ml烧杯中；s2 称量哌嗪-n，n
’‑
二（2-乙磺酸）（pipes）3.35g放入s1中的烧杯中，搅拌溶解完全；s3 称量3.45g氯化钠放入s2中的烧杯中，搅拌溶解完全；s4 称量0.055g乙二酸四乙酸二钠放入s3中的烧杯中，搅拌溶解完全；s5 量取0.25ml proclin300放入s4的烧杯中，搅拌均匀；s6 用10%hcl调s5溶液至ph7.5，搅拌均匀，静置60分钟；s7 用0.45um滤头过滤s6中的液体进入500ml干净的透明试剂瓶，室温密闭保存；s8 将s7中的缓冲液分装成1450ul/支备用，室温密闭储存。
27.3）血细胞染色，步骤如下：s1、取30ul/支烤干了的荧光试剂a，将分装成1450ul/支缓冲液b直接倒入荧光试剂a管中后，盖好管盖，上下摇晃混匀90秒；s2、用50ul一次性的无菌吸管吸取50ul全血，混入s1中，充分混匀90秒；s3、用5ml一次性无菌吸管将s2中的溶液吸取0.5ml充入一次性的微流控卡壳中；s4、将微流控卡壳插入血细胞分析仪（poct），15分钟后自动分析出样本的测试结果；8个配方染色效果如下表：
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。