丹酚酸A在制备抗食管癌药物和增加放化疗敏感性药物中的应用的制作方法

丹酚酸a在制备抗食管癌药物和增加放化疗敏感性药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及丹酚酸a的新用途，尤其是在制备抗食管鳞状细胞癌药物中的应用，及在制备增加食管鳞状细胞癌放化疗敏感性药物中的应用。


背景技术：

2.在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程，分为致癌、促癌、演进三个过程，与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不合理膳食、遗传因素密切相关。恶性肿瘤已经成为引起人类死亡的主要原因之一。
3.恶性肿瘤种类众多，其中食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率排名第七，死亡率排名第六。食管癌是中国第六大常见恶性肿瘤，且是致死率第四位的恶性肿瘤。中国仍是世界食管癌发病率和死亡率最高的国家。食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, eadc）和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, escc）是食管癌最常见的两种组织学亚型。在中国，超过90%的食管癌病例是食管鳞状细胞癌，其数量约占地球上所有食管鳞状细胞癌病例的一半。食管鳞状细胞癌具有侵袭性强、远处转移率高等特点，且在早期多无明显症状，临床上首次被确诊的食管鳞状细胞癌患者中，95%以上均为中晚期。手术、放疗、化疗是食管癌治疗的主要手段，放疗不敏感和传统化疗药物的耐药是食管癌晚期治疗失败的重要原因。寻找新的治疗靶点和靶向药物、探索新的用药方案，是目前抗食管癌研究的重要领域。
4.新型抗癌药物的研发既昂贵又耗时。系统生物学方法已经表明，正在开发的非抗癌药物也可以攻击癌症进展中起关键作用的靶点，且由于其已经过临床前和部分或全部临床开发，因此将此类药物用于恶性肿瘤治疗的成本将大大降低，并大幅缩短开发时间。
5.丹酚酸a（salvianolic acid a，saa）是一种抗氧化剂和抗炎剂，具有丹参的生物活性，具有抗凝血作用、抗血小板聚集作用、抗分泌和抗溃疡作用等。近年来，多个研究表明，saa可以通过下调transgelin 2的表达，逆转紫杉醇耐药性，并抑制人乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，因此在乳腺癌辅助治疗中可能起到作用。研究还发现saa具有一定的抗肺癌细胞活性，被应用于肺癌的治疗中。针对部分肿瘤，saa虽然能够逆转肿瘤耐药，增加抗癌活性，但是目前尚未有saa针对食管癌的相关研究。


技术实现要素：

6.针对以上问题，本发明提供一种丹酚酸a的新用途，具体是在制备抗食管鳞状细胞癌药物中的应用，及在制备增加食管鳞状细胞癌放化疗敏感性药物中的应用。
7.本发明第一方面的技术目的是提供丹酚酸a或其药用可接受的盐在制备抗食管鳞状细胞癌药物中的应用。在以上应用中，丹酚酸a或其药用可接受的盐作为唯一活性成分发挥抑制肿瘤细胞作用。
8.进一步的，在上述应用中，其中，食管鳞状细胞癌细胞包括kyse30细胞和kyse450细胞。
9.丹酚酸a通过抑制efna1的表达最终实现抑制食管癌细胞的增殖。
10.进一步的，在上述应用中，丹酚酸a的药用可接受的盐包括丹酚酸a的钠盐、镁盐、铵盐或钙盐等。
11.本发明第二方面的技术目的是提供丹酚酸a在制备增加食管鳞状细胞癌放化疗敏感性药物中的应用。
12.进一步的，在上述应用中，食管鳞状细胞癌细胞包括kyse30细胞和kyse450细胞。
13.进一步的，在上述应用中，所述增加食管鳞状细胞癌放化疗敏感性是丹酚酸a增加化疗药物顺铂对于食管癌细胞的杀伤作用。
14.进一步的，在上述应用中，所述增加食管鳞状细胞癌放化疗敏感性是丹酚酸a增加放疗对于食管癌细胞的杀伤作用。
15.实施本发明实施例，将具有如下有益效果：本发明实施例提供了丹酚酸a在制备在制备抗食管鳞状细胞癌药物中的应用及增加食管鳞状细胞癌放化疗敏感性药物中的应用。丹酚酸a具有良好的生物相容性，经验证，在抑制食管癌细胞方面具有明显的活性，其通过抑制efna1的表达最终实现抑制食管癌细胞的增殖，是一种安全的具有极大潜在应用价值的抗食管癌药物。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.其中：图1为实施例1中不同浓度的丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse30的抑制细胞生长曲线图；图2为实施例2中不同浓度的丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制细胞生长曲线图；图3为实施例3中20μm丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse30的抑制细胞生长曲线图；图4为实施例4中20μm丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制细胞生长曲线图；图5为实施例5中丹酚酸a与化疗药物顺铂单用及联用下对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制细胞生长曲线图；图6为实施例6中丹酚酸a与5gy的放疗剂量单用及联用下对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制细胞生长曲线图；图7为实施例7中丹酚酸a与10gy的放疗剂量单用及联用下对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制细胞生长曲线图；图8为实施例8中丹酚酸a抑制kyse30、kyse450细胞的efna1表达的电泳结果图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1本实施例中测定了丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse30的抑制作用，具体是不同浓度的丹酚酸a在24、48和72小时处理时间下对食管鳞状细胞癌kyse30的抑制作用。
20.具体方法是：将kyse30细胞消化后计数，以每孔3000个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加不同浓度的丹酚酸a（分别为0、2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm和80μm），设置3个复孔，并且振荡混合均匀。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出24h、48h、72h细胞的生长曲线。结果见图1，图1中可见，不同浓度的丹酚酸a对于食管癌细胞kyse30增殖的影响在不同时间存在一定的差别，其中相同浓度的丹酚酸a作用48h和作用72h对于食管癌细胞kyse30增殖的影响相当，丹酚酸a在接近40μm浓度下对于细胞增殖的抑制效果被体现出来。
21.实施例2本实施例中测定了丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制作用，具体是不同浓度的丹酚酸a在24、48和72小时处理时间下对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制作用。
22.具体方法是：将kyse450细胞消化后计数，以每孔3500个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加不同浓度的丹酚酸a（分别为0、2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm、80μm），设置3个复孔，并且振荡混合均匀。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出24h、48h、72h细胞的生长曲线。结果见图2，图2中可见，不同浓度的丹酚酸a对于食管癌细胞kyse450增殖的影响在不同时间存在一定的差别，丹酚酸a在20μm浓度下对于细胞增殖的抑制效果就足以体现出来。
23.实施例3本实施例中测定了浓度为20μm丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse30的抑制作用。
24.具体方法是：将kyse30细胞消化后计数，以每孔3000个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加丹酚酸a，终浓度为20μm，以添加相同浓度的溶剂（dmso）为对照组，设置3个复孔，并且振荡混合均匀。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出0h、24h、48h、72h细胞的生长曲线。结果见图3，图3中可见，20μm的丹酚酸a对于食管癌细胞kyse30增殖的抑制作用随时间的推移不断变大。
25.实施例4本实施例中测定了浓度为20μm丹酚酸a对食管鳞状细胞癌kyse450的抑制作用。
26.具体方法是：将kyse450细胞消化后计数，以每孔3500个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加丹酚酸a，终浓度为20μm，以添加相同浓度的溶剂（dmso）为对照组，设置3个复孔，并且振荡混合均匀。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加
cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出0h、24h、48h、72h细胞的生长曲线，结果见图4，图4显示，20μm的丹酚酸a对于食管癌细胞kyse450增殖的抑制作用随时间的推移不断变大。
27.实施例5本实施例证明丹酚酸a增强了化疗药物顺铂对食管鳞状细胞癌kyse450杀伤作用的敏感性。
28.具体方法是：将kyse450细胞消化后计数，以每孔3500个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中分别添加丹酚酸a（终浓度为20μm）、顺铂（终浓度为1μg/ml）以及二者联用（二者浓度均与单用时相同），并以添加空白培养基为对照组，每组设置3个复孔，并且振荡混合均匀。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出0h、24h、48h细胞的生长曲线，结果见图5，图5中可见，单纯用丹酚酸a或顺铂对于食管癌细胞增殖都有一定的效果，而二者联用的效果要优于单独用药。
29.在实施例6和实施例7中证明丹酚酸a增强放疗对食管鳞状细胞癌kyse450杀伤作用的敏感性。
30.实施例6具体方法是：将kyse450细胞消化后计数，以每孔3500个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加丹酚酸a（终浓度为20μm），并以添加空白培养基为对照组，每组设置3个复孔，并且振荡混合均匀。用5gy的剂量对这两组细胞进行放射处理。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出0h、24h、48h、72h细胞的生长曲线，结果见图6，图6中可见，丹酚酸a和5gy剂量的放射联用对于食管癌细胞增殖的抑制效果比单纯放射的效果要明显。
31.实施例7具体方法是：将kyse450细胞消化后计数，以每孔3500个细胞种到96孔板，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加丹酚酸a（终浓度为20μm），并以添加空白培养基为对照组，每组设置3个复孔，并且振荡混合均匀。用10gy的剂量对这两组细胞进行放射处理。采用1：10（cck8：培养基）的比例向培养基中添加cck8（购于mce），37度避光1h，之后用cytation5检测450nm波长下的吸光度，以此分别画出0h、24h、48h、72h细胞的生长曲线，结果见图7。图7中可见，丹酚酸a和10gy剂量的放射联用对于食管癌细胞增殖的抑制效果比单纯放射的效果更明显。
32.实施例8本实施例证明丹酚酸a能够抑制efna1表达。
33.具体方法是：分别将kyse30、kyse450细胞以每孔3
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104的浓度种于6孔板中，第二天待细胞贴壁后向培养基中添加丹酚酸a（终浓度为20μm），以添加空白培养基为对照组，每组设置3个复孔，并且振荡混合均匀。48h后收集细胞，用pbs洗涤3次后加入裂解液冰上裂解蛋白20min，每5min涡旋振荡一次。用bca法检测蛋白浓度之后加loading buffer于95℃煮10min。每孔上样20μg进行sds-page电泳，恒压90v，90min后转膜，恒流250ma转膜120min。用脱脂牛奶封闭1h后孵育一抗过夜，之后用tbst洗膜3次，每次10min，然后二抗孵育1h，显影，
结果见图8。图8中可见，kyse30和kyse450细胞经过丹酚酸a处理后能明显抑制efna1的表达。
34.以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。