用于异种移植的供体猪的制作方法

1.本发明总体涉及非常适于异种移植的猪新品系。第一个新的猪品系缺乏功能性猪内源性逆转录病毒，因此适合作为组织和/或细胞异种移植到人受者中的供体。这些猪也可用作基础猪用于进一步操作，例如通过异种抗原的基因编辑以产生猪的第二新品系，其不仅不含感染性猪逆转录病毒，而且不含引起超急性器官排斥的主要异种抗原。这些猪可用于将整个器官、组织和/或细胞移植到人受者中。
2.本发明还涉及选择缺乏传染性猪内源性逆转录病毒的猪的方法，以及它们用于组织和/或细胞异种移植到人中的用途，以及选择的猪的异种抗原的基因编辑方法，以进一步增强供体器官、组织和/或细胞的以避免异种移植排斥的方法。


背景技术：

3.异种移植具有解决人供体器官和组织短缺的世界性问题的潜力，尤其是使用来自猪的器官、组织和/或细胞的异种移植。
4.猪在大小和生理学上与人最接近，使其器官、组织和细胞适合作为人移植的供体。猪也易于在生物安全设施中繁殖和管理。然而，迄今为止阻止它们在异种移植中广泛使用的主要问题是猪是猪内源性逆转录病毒(perv)的载体。大多数猪品种具有整合到其所有细胞的基因组中的perv，并且这些病毒显示能够在体外感染人细胞。因此，存在猪器官、组织和细胞中的perv可被转染到人受者中的风险，不仅感染受者而且潜在地将感染性疾病传播到一般群体，其可引起逆转录病毒特有的疾病，诸如免疫缺陷和癌症。
5.有三种perv亚型，perv-a、perv-b和perv-c。perv-a和perv-b是普遍存在的并且可以传播给猪和人。perv-c仅能够感染猪细胞，但能够复制perv-a并与perv-a重组以产生高传染性的perv-a/c杂交品系(kimsa等人，2014)。整合的perv的数目在不同的猪品种/品系中不同，并且在1至超过300个拷贝的范围内。选择具有非常低perv拷贝数的猪是产生用于异种移植的猪的一种方法。
6.用于低perv状态的猪品种的已知选择方法传统上涉及使用聚合酶链反应(pcr)，使用与多种perv dna和rna序列互补的引物来鉴定perv病毒的某些区域(例如gag、pol或env基因序列)。pcr测试的结果可以是简单的阳性或阴性结果，或者可以使得能够计算perv拷贝数。具有天然低perv拷贝数的猪包括具有在4和40之间的perv拷贝数的奥克兰岛(ai)猪。pcr选择方法已经用于选择和繁殖具有非常低的perv拷贝数(0至30)的ai猪群用于异种移植(wo 2006/110054)也预先选择该群中的ai猪的其它性状以最小化宿主排斥，如具有o型血和不含mhc i类抗原，以及指定为无病原体(dpf)。
7.这些猪提供了适于异种移植的第一动物群体之一。然而，这种选择方法不能准确地从具有无活性perv的猪中鉴定出具有能够复制的全长perv的猪，即通过pcr测定的perv状态或拷贝数与能够复制的病毒无关。例如，对gag、pol或env perv序列的非常小的区域进行pcr扩增，不能区分全长perv序列和部分perv序列。基于pcr的测试也不能区分完整基因和含有无义突变(终止密码子)的基因。这意味着perv阳性pcr试验可能与不能复制的部分
序列或含有无义突变的全长序列(假阳性)有关，而perv阴性结果可能错过一些小env蛋白基因序列(假阴性)。
8.此外，低至1的拷贝数可能意味着移植到人受者中的器官、组织和细胞可能仍具有足够的perv来复制并可能引起疾病。实际上，为了避免这个问题，在植入之前必须保护猪细胞免受受者的免疫系统，例如通过藻酸盐包囊或通过使用植入装置。
9.消除perv或至少perv失活以消除perv复制和因此感染的能力将是更期望的目标。
10.已经尝试了几种实现该目标的方法，包括rna干扰(rnai)疫苗，使用锌指核酸酶或tal效应物核酸酶的perv消除，但是取得了有限的成功。
11.最近，已经提出使用crispr技术作为通过基因编辑使基因组宽的perv失活的方法。yang等人(2015)在无限增殖的猪细胞系中成功灭活了62个perv序列，niu等人(2017)通过原代胎儿猪成纤维细胞中的crispr基因编辑和体细胞核移植克隆技术，成功生产了无活性perv的仔猪。这涉及灭活25个perv序列。
12.使用crispr或任何其它基因编辑技术灭活所有perv基因，结合体细胞核移植克隆技术，似乎被视为产生与人相容的用于异种移植的猪器官的最佳方法。例如，egenesis(cambridge，ma)正在促进crispr cas-9技术的使用，以产生已被基因编辑的活的克隆猪胚胎，从而使所有perv失活。
13.perv感染不是唯一的问题。猪也应该不含可能传播给人受者的其它病原体，包括例如嗜淋巴疱疹病毒(plhv)、环状病毒(pcv)和巨细胞病毒(pcmv)。
14.要克服的另一个主要障碍是与受者的免疫不相容性和因此产生的超急性器官排斥。同样，crispr或任何其它基因编辑技术可用于编辑异种抗原基因(例如α1,3半乳糖转移酶(ggta1)和胞苷单磷酸-n-乙酰基神经氨酸羟化酶(cmah)基因等)以除去或灭活不需要的异种抗原以减少免疫不良反应。此外，可将调节免疫系统的人基因加入猪以帮助避免排斥(revivicor，blacksburg，va)。
15.然而，使用基因编辑技术去活化/去除所有perv和异种抗原基因的组合(egenesis谈论引入“双位”基因编辑以降低器官排斥的可能性(weintraub，2019))可能意味着所得克隆动物具有几十种基因编辑，这可能损害动物和/或具有不可预见的遗传后果。
16.因此，生产无perv的动物而不必进行这种多重基因编辑的更好方法将是优选的，并且提供不具有可能引起大量基因编辑的潜在问题的动物。
17.本发明的目的是以某种方式克服这个问题和/或为公众提供有用的选择。
18.在参考专利说明书、其它外部文件或其它信息来源的本说明书中，这通常是出于提供讨论本发明特征的上下文的目的。除非另外具体说明，否则对这些外部文件或这些信息来源的引用不应被解释为承认这些文件或这些信息来源在任何权限中是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。


技术实现要素：

19.本发明提供了使用全基因组测序(cgs)作为工具来选择perv-c和perv-a/c阴性猪，即没有或无活性、非复制perv-c和perv-a/c的猪，用于将组织和/或细胞异种移植到人受者中；和/或作为基础猪用于进一步操作，例如通过基因编辑异种抗原，以提供不仅perv-a和perv-a/c阴性而且不含造成超急性器官排斥的异种抗原的猪，使得该新型猪品系适合
作为供体用于将整个器官、组织和/或细胞异种移植到人受者中。
20.在第一方面，本发明提供了选择适合作为供体用于组织和/或细胞的异种移植的猪，或作为基础猪用于进一步操作的方法，该方法包括以下步骤：
21.a)提供具有4至40之间的低perv拷贝数的指定无病原体(dpf)猪群；
22.b)使用全基因组测序(cgs)检测畜群个体猪的perv状态；
23.c)鉴定具有perv-c阴性和perv-a/c阴性状态的个体猪；
24.d)选择所述perv-c阴性和perv-a/c阴性猪作为供体猪用于异种移植，或作为基础猪用于进一步操作。
25.该方法优选进一步包括鉴定步骤d)的perv-c阴性和perv-a/c阴性猪的perv-a和perv-b状态，并进一步选择具有1-10，优选1-5，最优选1-2的非常低数量的全长和潜在功能性perv-a和perv-b序列的猪。
26.优选地，猪是奥克兰岛(ai)猪，一种具有指定的无病原体(dpf)状态并具有令人惊讶的低perv拷贝数的猪品种。更优选地，ai猪已经在生物安全设施中针对非常低的perv拷贝数进行了选择性繁殖。更优选地，ai猪是perv-无效的，即其基因组中存在的任何perv序列不能产生感染性perv颗粒(garkavenko等人，2008)。
27.被指定为无病原体且具有类似低perv拷贝数和perv-无效状态的其它猪品种/品系也可用于本发明。
28.在第二方面，本发明提供了通过第一方面的方法选择的猪。
29.令人惊奇地发现，通过第一方面的方法选择的perv-c和perv-a/c阴性猪中的全长和潜在功能性perv-a/b序列仅位于y染色体上，因此可用于繁殖功能性perv。因此，本发明的第三方面提供了繁殖一群不具有功能性perv基因组序列的猪的方法，该猪适于作为异种移植的供体或作为基础猪用于进一步操作，方法包括以下步骤：
30.a)使用第一方面的cgs选择方法选择perv-c和perv-a/c阴性雄性和雌性猪；
31.b)分析步骤a)的雄性猪中任何全长、潜在功能性perv-a和perv-b基因序列的染色体位置；
32.c)选择仅在y染色体中具有全长、潜在功能性perv-a和/或perv-b的雄性猪；
33.d)用步骤a)的雌性猪繁殖步骤c)的雄性猪以产生后代；以及
34.e)选择缺乏父系全长、潜在功能性perv-a和/或perv-b的雌性后代作为将来的种畜以产生猪群，该猪群不具有功能性perv基因组序列并且适合作为组织和/或细胞的供体用于异种移植，或作为基础猪用于进一步操作。
35.本发明还考虑选择步骤e)的雌性后代作为组织和/或细胞异种移植的合适供体，或作为基础猪用于进一步操作。
36.在第四方面，本发明提供了通过第三方面的方法繁殖的猪群。
37.通过本发明的第一方面的cgs选择方法选择的或通过本发明的第三方面的方法繁殖的基础猪可以使用基因编辑技术进一步操作以消除和/或灭活选自ggta1、camh、b4galnt2、neu5gc、asgr1和sla的一种或多种异种抗原，例如以最小化组织和/或细胞以及移植到人受者中的整个器官的超急性排斥的风险。因此，本发明的第五方面提供了一种提供适于将整个器官、组织和/或细胞异种移植到人受者中的供体猪的方法，其包括以下步骤：
38.(a)使用第一方面的cgs方法选择perv-c和perv-a/c阴性供体猪；
39.(b)从步骤(a)的猪建立perv-c和perv-a/c阴性细胞系；
40.(c)基因编辑步骤(b)的选择的细胞，以消除或灭活一种或多种异种抗原基因；
41.(d)任选地基因编辑步骤(c)的选择的分离的细胞以表达一种或多种选自a20、cd39、cd46、cd47、cd55、cd59、血红素加氧酶-1(ho-1)、hla-e、hla-g、血栓调节蛋白(tm)、ctla4-ig和lea29y的人基因；
42.(e)从步骤(c)或步骤(d)的猪细胞建立基因编辑的细胞系；
43.(f)在体外将一个或多个步骤(e)的基因编辑细胞进行体细胞核移植至perv-c和perv-a/c阴性猪的卵母细胞中；
44.(g)培养至胚泡期；
45.(h)将胚泡转移至雌性perv-c和perv-a/c阴性猪并生长至足月；以及
46.(i)提供perv-c和perv-a/c阴性并且针对一种或多种异种抗原进行基因编辑的供体猪。
47.一种或多种异种抗原基因可以选自ggta1、camh、b4galnt2、neu5gc、asgr1和sla，或可用于降低免疫反应，尤其是超急性器官排斥可能性的任何其它异种抗原，如技术人员所理解的。
48.本发明的第六方面提供了猪细胞系，其是perv-c和perv-a/c阴性的，被基因编辑以灭活或缺失一种或多种异种抗原，并且任选地表达一种或多种人基因，是通过第五方面的方法产生的。细胞系可用于克隆供体猪以将整个器官、组织和/或细胞异种移植到人受者中。
49.本发明的第七方面提供了猪细胞系，其是dpf、perv-c和perv-a/c阴性的，被基因编辑以灭活或缺失一种或多种异种抗原，并且任选地表达一种或多种人基因，并且是通过第五方面的方法产生的。这些供体猪代表新的猪品系，命名为nzeno-1。这些猪也优选具有1-10，优选1-5，最优选1-2的非常低数目的全长和潜在功能性perv-a和perv-b序列。
50.在第八方面，本发明提供了用于异种移植的来自第二、第四和第七方面的猪的组织和/或细胞。
51.在第九方面，本发明提供了来自第七方面的猪的用于异种移植的整个器官。
52.用于异种移植的器官、组织和/或细胞，选自肾、肝、肺、心脏、脑、胰腺、肌肉、血液、骨、睾丸和卵巢组成的组。
53.用于异种移植的组织和/或细胞，其选自胰岛细胞、肝细胞、非实质肝细胞、胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状隙细胞、脉络丛细胞、成纤维细胞、足细胞、肾上腺嗜铬细胞和肌细胞。
54.在第十方面，本发明提供了一种治疗患有或易患与器官功能不足或缺乏相关的疾病、障碍或病症的患者的方法，所述方法包括将第八方面的组织和/或细胞，或第九方面的整个器官移植至需要其的患者。
55.本文公开的数值范围(例如，1至10)的引用也包括该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数范围(例如，2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围在此明确公开。这些仅是具体意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合应被视为以类
似方式在本技术中明确陈述。
56.如本文所用，名词后面的术语
‘
(s)’意指该名词的复数和/或单数形式。
57.本说明书和权利要求中使用的术语“包括(comprising)”是指“至少部分由...组成”。当解释包括术语“包括”的本说明书和权利要求书中的陈述时，除了在每个陈述中由该术语开头的特征之外，还可以存在其他特征。诸如“包括(comprise)”和“包括(comprised)”的相关术语将以相似的方式解释。
58.如本文所用，术语
‘
和/或’意指
‘
和’或
‘
或’，或上下文允许两者。
59.本发明包括前述内容，并且还设想以下仅给出实例的构造。
60.本文所用的术语“perv-c阴性”和“perv-a/c阴性”是指在通过本发明的方法选择的猪中没有鉴定出全长前病毒基因组。当通过常规pcr评估时，这可与术语“perv-c阴性”和“perv-a/c阴性”区分，常规pcr仅可检测env区域(perv-c(a/c)阳性)的小部分的存在或perv-c和重组perv-a/c基因组序列的该区域(perv-c(a/c)阴性)的不存在。
61.本文所用术语“perv-无效”是指不能产生感染性perv颗粒。
62.术语“猪的(porcine)”可与术语“猪(pig)”和“猪(swine)”互换使用，并且是指猪科中的哺乳动物。这样的哺乳动物包括完全或部分近亲交配的猪，优选本文所述的奥克兰岛猪群的那些成员。
63.如本文所用的术语“受者”是指患有或易患与器官、组织或细胞功能缺陷或缺乏相关的疾病、障碍或病症的人。
64.术语“基因编辑”或“基因组编辑”是一种类型的基因工程，其中dna被插入、缺失、修饰或置换到活生物体基因组中的特定靶位点中。基因编辑技术包括使用工程化核酸酶，或在基因组中的期望位置产生位点特异性双链断裂的
‘
分子剪刀’。通过非同源末端连接或同源重组修复诱导的双链断裂，导致靶向突变或基因编辑。可以使用的工程化核酸酶包括锌指核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶、工程化大范围核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr/cas-9)系统。
65.本发明还可以广义地描述为包括在本技术说明书中单独地或共同地参考或指示的部分、要素和特征，以及在任何两个或更多个所述部分、要素或特征的任何或所有组合中，并且其中在此提及的具体整数在本发明涉及的领域中具有已知的对等词，这些已知的对等词被认为并入本文，如同单独阐述一样。
附图说明
66.现在将参照附图仅以示例的方式描述本发明，其中：
67.图1显示了针对野猪雄性1(sus scrofa male1)基因组序列的完整perv-c序列blast片段(hit)；
68.图2显示了野猪雄性1(sus scrofa male1)基因组的选定区域与已知perv序列的序列比对。perv-c参考kc116219的分歧以黑色突出显示；
69.图3显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性1(sus scrofa male1)(黑色)的8个所选片段(hit)的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
70.图4显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性1(sus scrofa male1)(黑色)
的18个基因组区域(在这些perv-a、b、c和a/c参考中不一致地发现，覆盖阈值为90％)的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
71.图5显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性1(sus scrofa male1)基因组(黑色)的所选gag区的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
72.图6显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性1(sus scrofa male1)基因组(黑色)的所选pol区的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
73.图7显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性1(sus scrofa male1)基因组(黑色)的所选env区的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
74.图8显示了针对野猪雄性2(sus scrofa male2)基因组序列的完整perv-c序列blast片段(hit)；
75.图9显示了野猪雄性2(sus scrofa male2)基因组的选定区域与已知perv序列的序列比对。perv-c参考kc116219的分歧以黑色突出显示；
76.图10显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性2(sus scrofa male2)(黑色)的8个所选片段(hit)的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
77.图11显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性2(sus scrofa male2)(黑色)的18个基因组区域(在这些perv-a、b、c和a/c参考中不一致地发现，覆盖阈值为90％)的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
78.图12显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性2(sus scrofa male2)基因组(黑色)的所选gag区的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
79.图13显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性2(sus scrofa male2)基因组(黑色)的所选pol区的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
80.图14显示了具有9个已知perv序列(红色)的野猪雄性1(sus scrofa male1)基因组(黑色)的所选env区的最大似然系统发育重建。树以perv-b序列为根。节点处的数字表示ml支持值。比例尺代表每个位点的预期替换数；
81.图15显示了在三种不同基质上培养的nzk1细胞的形态；
82.图16显示了nzk1细胞在三种不同基质上的增殖特征。tc＝组织培养物；
83.图17显示了nzk1细胞的中期染色体，其为在第3代从单个nzk1细胞释放的中期染色体总数的代表性实例。对个体染色体进行编号；
84.图18显示了ggta1基因中的crispr靶位点。如所示，通过crispr的切割预期删除152bp片段，这导致基因的功能性破坏；
85.图19显示了ai猪靶区域的序列验证。所示为与公开的猪基因组序列相比，ai猪细
胞中ggta1基因的相关靶区域的基因组序列；
86.图20显示了转染ggta1特异性crispr的野生型细胞(wt)和聚合型细胞(tc)的序列比较。箭头表示预测的crispr切割位点和在序列下方与转染细胞的序列重叠的区域；
87.图21显示了存在于汇集的crispr转染细胞的扩增靶位点中的不同序列的生物信息学鉴定。图中显示的是ggta1基因的两种不同crispr转染的细胞通过tracking of indels by decomposition(tide)分析的结果。条形图表示检测到的序列的特定百分比，其中0表示未改变的野生型序列，1至5表示1至5个碱基对的插入和-1至-10表示1至10个碱基对的缺失；
88.图22显示了ggta1-ko nzk1细胞克隆的表征。a显示单个细胞克隆(例如g53、g61、g12)和未转染对照细胞(wt)的ggta1靶区域的pcr扩增产物。b显示野生型细胞和细胞克隆g12的序列比较。细胞克隆g12中缺失的区域显示为以红色突出显示的黑色虚线。crispr结合和切割位点分别由黑条和箭头指示；
89.图23显示了cmah基因中的crispr靶位点。如所示，通过crispr的切割预期删除88bp片段，这导致基因的功能性破坏；
90.图24显示了ai猪靶区域的序列验证。所示为与公开的猪基因组序列相比，ai猪细胞中cmah基因的相关靶区域的基因组序列；
91.图25显示了转染cmah特异性crispr的野生型细胞(wt)和聚合型细胞(tc)的序列比较。箭头表示预测的crispr切割位点和在序列下方与转染细胞的序列重叠的区域；
92.图26显示了存在于汇集的crispr转染细胞的扩增靶位点中的不同序列的生物信息学鉴定。图中显示的是cmah基因的两种不同crispr转染的细胞通过tracking of indels by decomposition(tide)分析的结果。条形图表示检测到的序列的特定百分比，其中0表示未改变的野生型序列，1至5表示1至5个碱基对的插入和-1至-10表示1至10个碱基对的缺失；
93.图27显示了cmah-ko nzk3细胞克隆的表征。a显示了具有单个细胞克隆的cmah靶区域的pcr扩增产物的代表性凝胶。显示了5个细胞克隆(38、86、89、90和104)，其被认为适合作为用于产生ko猪的cmah ko克隆。b显示野生型细胞和细胞克隆90的序列比较。在crispr 68rev的切割位点处的克隆90中的突变(1bp插入)通过黑框突出显示。crispr结合和切割位点分别由黑条和箭头指示；
94.图28显示了各个细胞克隆(例如4.68、4.10、4.16)和对照细胞(wt)的ggta1和cmah靶区域的pcr扩增产物；
95.图29显示双ko细胞克隆4.16中突变的序列分析。所示为野生型细胞和双ko候选细胞克隆4.16中存在的ggta1和cmah的靶序列的比较。缺失区域显示为以红色突出显示的黑色虚线。crispr结合和切割位点分别由黑条和箭头指示；
96.图30显示了ggta1-ko nzk3细胞克隆的表征。a显示单个细胞克隆的ggta1靶区域的pcr扩增产物，其中细胞克隆ga2、ga5和ga20显示具有推定的152bp缺失的单个片段。b显示野生型细胞和细胞克隆ga5的序列比较。细胞克隆g12中缺失的区域显示为以红色突出显示的黑色虚线。crispr结合和切割位点分别由黑条和箭头指示；以及
97.图31显示了nzk3细胞(a)、ggta1/cmah双ko细胞克隆(b)和人hek细胞结合对αgal表位具有结合特异性的荧光标记的同工凝集素的分析。
具体实施方式
98.本发明提供了非常适用于异种移植的猪新品系。第一个新的猪品系缺乏功能性猪内源性逆转录病毒，因此适合作为组织和/或细胞异种移植到人受者中的供体。这些猪也可用作基础猪用于进一步操作，例如通过异种抗原的crispr基因编辑以产生猪的第二新品系，其不仅不含功能性猪逆转录病毒，而且不含引起超急性器官排斥的主要异种抗原。这些猪可用于将整个器官、组织和/或细胞移植到人受者中。
99.更具体地，本发明涉及使用全基因组测序(cgs)作为高度灵敏和特异的工具来选择没有或无活性的非复制perv基因组序列的供体猪，用于组织和/或细胞异种移植到人受者中，或作为基础猪用于进一步操作。cgs可以鉴定猪基因组中的所有perv序列，即部分和全长序列，以鉴定和选择缺乏功能性perv序列的个体猪。
100.本发明的cgs选择方法克服了现有技术方法的问题，因为消除了与perv状态和/或拷贝数(通过pcr)相关的假阳性和假阴性的风险，消除了将功能性感染性perv序列传递给受者的风险，并且猪不必经历数十种crispr基因编辑以灭活所有perv基因，从而也消除了与供体动物上的这种多重基因编辑相关的潜在问题。通过本发明的cgs方法选择的来自猪的组织和/或细胞也可以直接移植到人受者中，而不需要针对受者免疫系统的保护性屏障，例如藻酸盐胶囊、植入装置等，但是如果在进行交叉配血试验后认为供体组织具有超急性排斥的风险，它们也可以与这些保护性屏障一起使用。
101.优选地，本发明使用cgs选择perv-c和perv-a/c阴性的猪。有三种perv亚型，perv-a、perv-b和perv-c，它们是指perv的包膜(env)区中的差异。病毒包膜蛋白是宿主范围的主要决定因素并且是感染所必需的。perv-a和perv-b是普遍存在的并且感染人和猪，而perv-c仅感染猪，然而，perv-a和perv-c可以重组形成高度感染性变体perv-a/c。因此，希望供体猪不含perv-c或仅具有非复制perv-c以避免与现有perv-a的任何重组，以及不含重组的perv-a/c。
102.因此，本发明提供了选择适合作为供体用于组织和/或细胞的异种移植的猪，或作为基础猪用于进一步操作的方法，该方法包括以下步骤：
103.a)提供具有4至40之间的低perv拷贝数的指定无病原体(dpf)猪群；
104.b)使用全基因组测序(cgs)检测畜群个体猪的perv状态；
105.c)鉴定具有perv-c阴性和perv-a/c阴性状态的个体猪；
106.d)选择所述perv-c阴性和perv-a/c阴性猪作为供体猪用于异种移植，或作为基础猪用于进一步操作。
107.该方法进一步包括鉴定perv-c和perv-a/c阴性猪的perv-a和perv-b状态，并选择具有1-10，优选1-5，最优选1-2的非常低数量的全长和潜在功能性perv-a和perv-b序列的猪。
108.在使用本发明的cgs方法选择之前，供体猪必须被指定为无病原体(dpf)。特别地，猪必须不含感染性微生物，例如疱疹病毒、plhv、pcmv、戊型肝炎病毒(hev)、弓形虫、附红细胞体、布鲁氏菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、钩端螺旋体、猪嗜血杆菌、任何引起猪呼吸性生殖综合征的病毒、任何引起狂犬病的病毒、任何引起假狂犬病的病毒、细小病毒、脑心肌炎病毒、任何引起猪水泡病的病毒、猪脊髓灰质炎病毒(techen)、任何引起血凝性脑心肌炎的病毒、甲型猪流感、腺病毒、传染性胃肠炎病毒和水泡性口炎病毒。应使用本领域已知的技
术如免疫学测定和pcr技术定期监测猪的无病原体状态。
109.供体猪也优选是天然低perv拷贝数的，或已经预先选择和繁殖低perv拷贝数。例如，奥克兰岛(ai)猪是具有指定的无病原体状态并具有令人惊讶的低perv拷贝数的猪品种。使用pcr/rt-pcr检测perv序列并计算perv拷贝数，然后如wo 2006/110054中所述选择繁殖具有最低perv拷贝数的猪，可在生物安全设施中进一步选择繁殖ai猪以获得非常低的perv拷贝数。ai猪也显示为perv-无效，即其基因组中存在的任何perv序列不能产生感染性perv颗粒(garkavenko等人，2008)。具有相同指定无病原体状态、低perv拷贝数和perv-无效状态的其它猪品种/品系也可用于本发明。
110.更优选地，在使用本发明的cgs方法进行选择之前，还针对其它性状对供体猪进行了预选择以使宿主排斥最小化，例如具有o型血液且不含mhc i类抗原。
111.本发明可以使用任何一种已知的全基因组测序(cgs)技术来检测供体猪的perv状态。cgs是测定生物体基因组序列的方法。本领域已知有几种获得基因组序列的方法。一种常用的技术是全基因组鸟枪法测序(venter，1998)。这通常涉及几个步骤：
112.·
从基因组中的随机位置获得大量短dna序列，
113.·
将短序列组装成较大重叠群的(基因组组装)，和
114.·
分析产生的数据。
115.本发明使用cgs来鉴定猪中的perv序列并分析那些序列以测定所鉴定的perv序列是否有功能，即是否能够复制。将鉴定的perv序列与参考序列比较，以测定它们是否是全长的，并鉴定可灭活perv的任何突变。也可以分析周围的基因组环境以测定perv是否可能被转录沉默。
116.本发明的cgs方法选择的猪也由本发明提供。这些猪可用作基础猪用于进一步操作，如下所述，或用作异种移植的组织和/或细胞的供体。
117.这些猪具有优于据称适合作为异种移植供体的所有当前猪品种的优势，包括wo2006/110054中选择的低perv拷贝数的ai猪。特别地，通过使用本发明的cgs方法，可以证实所选择的猪第一次是真正perv-c和perv-a/c阴性的，即它们不具有任何功能性基因组perv-c和重组perv-a/c序列，因此可以用作组织和/或细胞异种移植的供体猪，而不用担心将功能性perv-c和perv-a/c序列传递给受者。
118.本发明的选择方法的这一主要优点可以在本发明的实施例1和2中看出。
119.在本发明的实施例1中，事实上发现表观perv拷贝数为18的雄性ai猪(雄性1)仅具有两个全长perv，一个用perv-a参照分组，一个用perv-b参照分组。发现剩余的16个perv序列，包括perv-c序列，在gag、pol和/或env基因中具有多个无义突变(终止密码子)。通过常规pcr方法将该猪视为perv-c和perv-a/c阴性，并且通过本发明的cgs方法验证该状态。此外，本发明的cgs方法测定其仅包括两个潜在的功能性全长perv序列。此测定的准确性是cgs方法的主要益处，因为标准的基于pcr的测试仅给出阳性或阴性结果，当perv基因存在但含有无义突变时，其易于假阳性。当使用pcr计算perv拷贝数时，它可以大大高估功能性perv序列的真实数目。
120.然而，如在本发明的实施例2中所见，通过常规的基于pcr的测试确定的具有perv-c阳性状态的第二只雄性ai猪(雄性2)事实上被发现是perv-c阴性的，并且仅具有用perv-a分组的单个全长perv。如实施例1所述，发现包括perv-c序列在内的其余perv序列在gag、
pol和/或env基因中具有多个无义突变(终止密码子)，因此是无活性的。该结果非常令人惊讶。不期望本发明的选择方法将颠倒动物的基于pcr的perv-c阳性状态，特别是假设本发明的方法确认了被认为是雄性1的perv-c阴性状态的pcr。
121.本发明与测定perv-c和perv-a/c状态的常规pcr方法相比具有其它意想不到的优点，因为即使当pcr鉴定动物为perv-c阳性时，本发明的方法也可进一步鉴定perv-c序列是否完整，如果不是，如在雄性2的情况下，基因组中可不存在perv-a/c重组体。
122.因此，本发明的选择方法是高度灵敏的，并且远远优于以前的基于pcr的方法，该方法已经将供体猪雄性2鉴定为perv-c阳性。由于担心perv-c的传播和perv-a/c重组序列在受者体内具有高度传染性，这种供体猪被认为不适合用于异种移植。
123.本发明的cgs方法不仅可以鉴定和分析猪基因组中所有perv基因序列的功能状态，而且还可以鉴定perv基因序列位置。令人惊奇的是，在实施例2中，发现单一全长和潜在功能性perv-a序列位于y染色体上。这一令人惊讶的发现具有无法预料的益处，因为这些动物可用于在将来的后代中繁殖出功能性perv，这是通过用perv-c和perv-a/c阴性的雌性猪(如使用本发明的cgs方法选择的)选择性地繁殖这些猪并且选择雌性后代作为合适的供体猪或用于将来的繁殖，因为它们的后代将不具有功能性父系perv-a。这种选择性繁殖可最终产生用于异种移植的perv阴性群，即不具有功能性perv基因组序列的猪群。
124.因此，本发明提供了一种繁殖用于异种移植的perv阴性猪群的方法，该方法包括以下步骤：
125.a)使用本发明的cgs选择方法选择perv-c阴性和perv-a/c阴性雄性和雌性猪；
126.b)分析步骤a)的雄性猪中任何全长、潜在功能性perv-a和perv-b基因序列的染色体位置；
127.c)选择仅在y染色体中具有全长、潜在功能性perv-a和/或perv-b的雄性猪；
128.d)用步骤a)的雌性猪繁殖步骤c)的雄性猪以产生后代；以及
129.e)选择缺乏父本潜在功能性perv-a和/或perv-b的雌性后代作为将来的种畜，以产生适合作为异种移植的组织和/或细胞供体或作为基础猪用于进一步操作的perv阴性猪群。
130.本发明还考虑选择步骤e)的雌性后代作为组织和/或细胞异种移植的合适供体，或作为基础猪用于进一步操作。
131.本发明还提供了通过本发明的繁殖方法繁殖的perv阴性猪群。猪群可用作基础猪用于进一步操作或用作供体猪的来源用于将组织和/或细胞异种移植到人受者中。根据交叉配血试验的结果，组织和/或细胞可以直接移植，而不需要额外的免疫屏障，例如藻酸盐胶囊或植入装置，或者这种免疫屏障可能需要用于避免植入物的超急性排斥。
132.如上所述，本发明提供了perv-c和perv-a/c阴性(即没有全长或非功能性全长perv-c和perv-a/c基因组序列)的基础猪，其已经通过本发明的cgs方法选择，和/或通过本发明的繁殖方法繁殖。这些基础猪代表具有真正的perv-c和perv-a/c阴性基因组状态的猪的新品系。可以使用基因编辑技术进一步操作这些原代猪以消除和/或灭活一种或多种异种抗原，从而提供高度适于将整个器官、组织和细胞异种移植到人受者中的新的猪品系(命名为nzeno-1)。如本领域技术人员所理解的，基因编辑技术可用于进一步改善原代猪的异种移植状态，即，使它们与人受者更相容，即，通过灭活和/或消除负责超急性器官排斥的异
种抗原。
133.例如，从dpf原代猪获得的合适的细胞可以用于建立无perv-c和perv-a/c的细胞系，dpf原代猪已经使用本发明的cgs选择方法选择了perv-c和perv-a/c阴性状态并且优选地具有非常低拷贝数的活性perv-a和perv-b(1-2)，和/或使用本发明的繁殖方法繁殖。然后可以对这些细胞进行基因编辑技术以敲除或灭活与已知在受者中引发免疫反应的异种抗原相关的基因，该免疫反应导致超急性器官排斥。超急性器官排斥由猪抗原的天然抗体，内皮细胞的补体结合和血管内凝血的快速起效介导。这些抗体的主要目标是通过酶α1,3半乳糖转移酶(ggta1)置于细胞表面的分支糖链上的特异性碳水化合物表位(αgal)。ggta1不存在于人中，因此这些αgal表位的存在触发该免疫应答。因此，去除供体猪中的ggta1可用于避免人受者中的器官、组织和/或细胞排斥。
134.降低与引发超急性器官排斥的异种移植器官结合的异种反应性抗体的其它靶标包括β1,4n-乙酰半乳糖氨基转移酶(b4galnt2)、cmp-neu5ac羟化酶(cmah)、猪白细胞抗原(sla)、n-乙酰神经氨酸(neu5gc)、asgr1以及技术人员将理解的其它靶免疫反应性基因。
135.可以进行其它基因编辑以避免人受者中的器官、组织和/或细胞排斥，例如人a20、cd39、cd46、cd47、cd55、cd59、血红素加氧酶-1(ho-1)、hla-e、hla-g、血栓调节蛋白(tm)、ctla4-ig和/或lea29y等的表达，如技术人员所理解的。
136.从这些基因编辑的细胞建立细胞系，并将基因编辑的细胞进行体细胞核移植以克隆理想地适合于异种移植的供体猪，因为它们不仅perv-c和perv-a/c阴性，而且它们也是低免疫原性的，因为当将克隆的供体猪的器官、组织和/或细胞移植到人供体中时，基因编辑将有助于防止不利的免疫反应并避免超急性器官排斥。
137.合适的细胞包括例如成纤维细胞、肾源性原代细胞或肝细胞。其他合适的供体细胞应至少具有以下性质：(1)表现出正确和稳定的核型，其可以简单地通过计数中期散布中的染色体数目来测定，(2)表现出良好的增殖，(3)具有长的寿命，以及(4)应该是可转移的。此外，体外scnt实验给出了关于直到胚泡阶段的发育能力的信息，如技术人员所理解的。然后使用crispr cas-9技术对细胞进行基因编辑，并使用已知方法进行随后的体细胞核移植(kurome等人，2015)。
138.因此，本发明提供了一种提供适于将整个器官、组织和/或细胞异种移植到人受者中的供体猪的新品系的方法，其包括以下步骤：
139.a)使用本发明的cgs选择方法选择perv-c阴性和perv-a/c阴性的基础猪；
140.b)从步骤a)的猪建立perv-c和perv-a/c阴性猪细胞系；
141.c)对步骤b)的猪的选择的分离的细胞进行基因编辑以消除或灭活一种或多种异种抗原基因；
142.d)任选地基因编辑步骤c)的选择的分离的细胞以表达一种或多种选自a20、cd39、cd46、cd47、cd55、cd59、血红素加氧酶-1(ho-1)、hla-e、hla-g、血栓调节蛋白(tm)、ctla4-ig和lea29y的人基因；
143.e)从步骤c)或d)的细胞建立基因编辑的细胞系；
144.f)将步骤e)的一个或多个编辑过基因的细胞进行体细胞核移植到perv-c阴性和perv-a/c阴性的猪卵母细胞中；
145.g)培养至胚泡期；
146.h)将胚泡转移至雌性perv-c和perv-a/c阴性猪并生长至足月；以及
147.i)提供供体猪的新品系，其是perv-c和perv-a/c阴性的，并且针对一种或多种异种抗原进行基因编辑，并且任选地进行基因编辑以表达一种或多种人基因。
148.一种或多种异种抗原基因可以选自ggta1、camh、b4galnt2、neu5gc、asgr1和sla，以及其它有益于灭活的异种抗原基因，以提高受者的免疫系统的接受度，如技术人员所理解的。
149.本发明还提供了通过上述方法的步骤e)产生的猪细胞系。本发明的猪细胞系的实例在以下实施例4-8中列出。具体地，产生来自通过本发明的csg方法选择的dpf ai猪的细胞系(即perv-c和perv-a/c阴性)，其已经使用crispr cas-9进行基因编辑以破坏ggta1(实施例4和7)；已经使用crispr cas-9进行基因编辑以破坏cmah(实施例5)；并且已经使用crisp cas-9进行基因编辑以破坏ggta1和cmah(实施例6和8)。本发明的细胞系可用于使用已知的体细胞转移技术克隆供体猪(实施例9)。克隆的供体猪然后可用于将整个器官、组织和/或细胞异种移植到人受者中。克隆的供体猪代表新的猪品系(nzeno-1)，其具有perv-c和perv-a/c阴性基因组状态，非常低数目(1-2)的全长潜在功能性基因组perv-a和perv-b序列，具有针对一种或多种异种抗原的基因编辑，并且任选地具有一种或多种基因编辑以表达人免疫相容性基因。nzeno-1供体猪也是dpf和perv-无效，使得它们特别适合于整个器官、组织和/或细胞异种移植，因为它们已经被选择和操作以最小化超急性器官排斥的风险。
150.本发明的nzeno-1新供体猪品系就其作为供体用于异种移植的适合性方面远优于任何当前可用的猪，其由本发明的cgs选择的组合方法产生为perv-c和perv-a/c阴性状态和低(1-2)perv-a和b，是dpf和perv-无效的，并且具有通过基因编辑技术消除或失活的ggta1、camh、b4galt2、neu5gc、asgr1和/或sla中的一种或多种。
151.如上所讨论产生猪作为用于异种移植的器官、组织和/或细胞来源的当前思路是使用crispr cas-9技术来基因编辑不仅异种抗原而且所有基因组宽的perv基因。然而，这将需要在供体猪细胞(通常是成纤维细胞)上进行种基因编辑，然后进行体细胞核移植并克隆所得胚胎。例如，yang等人成功地使无限增殖的猪细胞系中的62个perv序列失活，niu等人成功地使25个perv基因失活以产生具有失活perv的小猪。在perv基因编辑之上的额外基因编辑将需要灭活异种抗原(egenesis谈论引入“双位”基因编辑以降低器官排斥的可能性(weintraub，2019))。
152.如现在已知的，crispr cas-9技术可以在其基因组上的靶位点附近导致不希望的dna缺失和重排。crispr cas-9基因编辑依赖于cas-9酶在特定靶位点处切割dna。然后细胞尝试使用dna修复机制重新密封该断裂。修复机制不总是完美地工作，有时dna片段将被删除或重排或可能发生其它不希望的改变。显然，在单个细胞上进行的基因编辑越多，这些不需要的编辑发生的机会就越增加。
153.本方法产生perv-c和perv-a/c阴性猪，而不必进行基因编辑，并且仅考虑使用基因编辑来消除或灭活最少数量的异种抗原基因，从而避免必须产生具有数十种基因编辑的克隆动物，这可能损害动物和/或具有不可预见的遗传后果。
154.因此，本发明提供通过本发明的cgs选择方法选择的perv-c和perv-a/c阴性猪，优选也具有1-2的非常低拷贝数的活性perv-a和perv-b，作为用于组织和/或细胞异种移植的
供体猪或作为用于进一步操作的基础猪。
155.本发明的基础猪可以通过进行基因编辑以消除或灭活一种或多种选自ggta1、camh、b4galnt2、neu5gc、asgr1和sla的异种抗原，并任选地表达一种或多种选自a20、cd39、cd46、cd47、cd55、cd59、血红素加氧酶-1(ho-1)、hla-e、hla-g、血栓调节蛋白(tm)、ctla4-ig和lea29y的人基因来进一步操作或修饰，以产生新的nzeno-1品系。
156.用于鉴定perv-c和perv-a/c阴性状态的本发明的cgs选择方法可以在一种或多种异种抗原的基因编辑之前或之后进行。
157.通常，一种或多种异种抗原的基因编辑将在猪的合适细胞上进行，猪已经使用本发明的cgs方法预先选择为perv-c和perv-a/c阴性，由此将基因编辑的细胞进行体细胞核移植以产生克隆的猪，克隆的猪是perv-c和perv-a/c阴性的并且已经具有一种或多种消除/失活的异种抗原(新的nzeno-1品系)。
158.由于用于本发明的猪也被指定为无病原体的，是perv-无效的，并且也可以被预先选择用于血型o，并且不含存在于细胞表面的免疫原性抗原如mhc i类抗原，本发明的器官、组织和/或细胞特别适合于异种移植。预期本发明的供体猪的新nzeno-1品系的器官、组织和/或细胞，作为负责超急性器官排斥的免疫介导的应答的大部分，将能够移植到需要这种移植的大多数人受者中，其通常需要使用复杂的交叉配血来测试，并且已经通过消除或灭活负责这种免疫排斥的主要异种抗原和通过插入表达人凝血因子和/或炎症抑制剂的基因使之最小化。
159.本发明还提供了从通过本发明的cgs方法选择的一种或多种猪分离的组织和/或细胞。除了通过本发明的cgs选择方法，本发明还提供了分离自供体猪的新nzeno-1品系的整个器官、组织和/或细胞，经过了一种或多种异种抗原的crispr cas-9基因编辑。
160.优选地，器官、组织和/或细胞分离自一只或多只猪，其中一只或多只猪的大小与受者匹配。例如，用于移植到成人受者中的器官和组织优选从成年猪分离，用于移植到儿童中的器官和组织从年轻/幼年猪分离，如技术人员所理解的。用于移植入成人或儿童人受者的细胞优选从年轻/幼年猪分离。
161.器官、组织和/或细胞，选自肾、肝、肺、心脏、脑、胰腺、肌肉、血液、骨、睾丸和卵巢组成的组。
162.优选地，用于整个器官异种移植的器官选自肾、肝、肺和心脏。
163.优选地，用于异种移植的组织和/或细胞选自胰岛细胞、肝细胞、非实质肝细胞、胆囊上皮细胞、胆囊内皮细胞、胆管上皮细胞、胆管内皮细胞、肝血管上皮细胞、肝血管内皮细胞、窦状隙细胞、脉络丛细胞、成纤维细胞、足细胞、肾上腺嗜铬细胞和肌细胞。
164.本发明还提供了治疗患有或易患与器官功能不足或缺乏相关的疾病、障碍或病症的患者的方法，所述方法包括将根据本发明的器官、组织和/或细胞移植至需要其的患者。
165.这种移植优选能够恢复或增加人受者的细胞、组织或器官功能，同时使包括perv在内的异动物传染的感染因子的传播风险最小化，并使超急性器官排斥的风险最小化。
166.本发明的优选实施方案仅通过示例的方式进行了描述，并且在不脱离本发明的范围的情况下可以对其进行修改。
167.实施例
168.1.实施例1
169.本实施例描述了通过全基因组测序分析野猪的perv含量的方法。
170.1.1方法
171.野猪雄性1是被称为无病原体(dpf)的雄性ai猪，并且通过基于pcr的测试被鉴定为perv-c阴性。
172.野猪雄性1的完整基因组测序由macrogen inc.根据合同进行。从macrogen inc.获得二元比对图(bam)文件(显示被映射到参考基因组的过滤的dna序列读段，其中去除了重复的读段)和变体调用格式(vcf)文件(显示通过分析从比对的读段获得的信息而鉴定的dna序列变体)，并用于进一步分析。使用bcf工具(bcftools)用字符“n”替代没有来自共有序列的覆盖的区域。使用geneious对野猪雄性1基因组对kc116219全perv-c序列(8678bp；ncbi参考序列)进行blast。
173.1.2结果
174.1.2.1perv序列的基因组测序和鉴定
175.共检测到27个基因组区域覆盖超过50％的查询(kc116219)(图1)，只有8个覆盖超过90％。选择这些作为潜在功能性perv的候选物用于进一步分析(表1)。
176.表1.覆盖超过90％的perv-c序列(kc116219)的野猪雄性1的基因组区域。
[0177][0178]
1.2.2系统发育分析
[0179]
使用mafft将8个片段与变体a、b和c(变体c：kc116219、kc116221、am229311；重组变体a/c：ay570980、ay953542；变体a：aj279056、gu980187；变体b：eu523109、aj133816)的9个现有perv参考序列进行比对(图2)(tang等人，2016；xiang等人，2013)。
[0180]
此外，还使用perv-a、b、c和a/c参考进行了等同分析。当覆盖阈值提高到60％时，在blast结果中一致地发现相同的25个基因组区域。然而，当覆盖阈值提高到90％时，在这些perv-a、b、c和a/c参考中不一致地发现18个基因组区域。
[0181]
将具有大于90％perv-c序列(kc116219)覆盖率的8个片段的系统发育与9个现有perv参考序列一起构建以通过iq-tree鉴定每个基因组区域的最接近perv变体。系统发育结果表明具有2个perv-a参考序列的8个片段，这意味着雄性1基因组的所有这8个区域显示出与perv-a更大的相似性(图3)。此外，我们还对在perv-a、b、c和a/c参考中发现不一致的18个基因组区域进行了系统发育分析，覆盖阈值为90％。结果显示8个基因组区域(与perv-c序列覆盖度大于90％的区域相同)再次与2个perv-a参考序列分组，没有基因组区域与perv-a/c和perv-c分组(图4)。
[0182]
1.2.3perv基因分析
[0183]
这18个片段的蛋白编码区通过由ncbi网站实现的具有标准遗传密码的orf finder来鉴定。结果显示16个序列含有与功能丧失相关的特征，并且发现仅两个序列(染色体y上的nc_010462.3和染色体3上的nc_010445.4_2)包括3个逆转录病毒基因(gag、pol和env)的全长(表2)。
[0184]
表2.野猪雄性1的选择的18个片段的蛋白编码区。包括perv-c(kc116219)和perv-a(gu980187)的两个参考序列。
[0185][0186]
进一步的分析集中于独立地搜索三个perv基因。使用参考序列kc116219(gag 1566bp、env 1917bp和pol 3585bp)的每个基因对野猪雄性1基因组进行blast：
[0187]
gag：发现32个基因组区域具有》＝90％的查询覆盖率，但只有15个区域包括全长gag基因。选择具有≥70％查询覆盖率的总共45个序列用于系统发育分析(图5)。
[0188]
pol：发现25个基因组区域具有》＝90％的查询覆盖率，但只有11个区域包括全长pol基因。选择具有≥70％查询覆盖率的总共28个序列用于系统发育分析(图6)。
[0189]
env：发现15个基因组区域具有》＝90％的查询覆盖率，但只有4个区域包括全长env基因。选择具有≥70％查询覆盖率的总共17个序列用于系统发育分析(图7)。
[0190]
还进行了perv长末端重复序列(ltr)分析并证实了上述结果(结果未示出)。
[0191]
1.3结论
[0192]
对于野猪雄性1基因组，在用perv-a、b、c和a/c参考文献进行的四次检索的blast结果中一致地发现了覆盖perv序列的至少60％的25个基因组区域(图1)。与perv-b、c或a/c序列相比，具有大于90％perv-c覆盖的8个片段物显示与perv-a序列的更大相似性(图3)。
使用90％的覆盖阈值在perv-a、b、c和a/c参考中不一致地发现的18个基因组区域未与perv-a/c或perv-c序列分组(图4)。仅发现两个序列(染色体y上的nc_010462.3和染色体3上的nc_010445.4_2)包括3个逆转录病毒基因(gag、pol和env)的全长(表2)。此外，nc_010462.3的序列与perv-a分组，nc_010445.4_2的序列最接近perv-b。此外，在独立构建三个perv基因(gag、pol和env)的系统发育后，结果显示没有发现基因组区域与来自perv-a/c或perv-c的参考基因分组(图5-7)。
[0193]
这些分析表明在野猪雄性1基因组中没有功能性perv-a/c或perv-c序列的证据。这与显示雄性1为perv-c阴性的基于pcr的测试一致。
[0194]
根据perv分析，没有功能性基因分析(相当于使用rt-pct的perv拷贝数分析)，似乎该动物的基因组中有18个perv。由于人受者中perv-c和/或perv-a/c感染的风险太高，因此认为这种动物不适用于异种移植。
[0195]
然而，由于这种新的选择方法，以前认为由于存在活性perv而不能用于异种移植的猪现在可用作异种移植的供体猪，如果perv拷贝数对应于通过cgs鉴定的非功能性序列，或可用作基础猪用于通过如下所述的基因编辑技术进一步操作。
[0196]
2.实施例2
[0197]
该实施例描述了通过全基因组测序分析野猪的perv含量的另一个实例。
[0198]
2.1方法
[0199]
野猪雄性2是被称为无病原体(dpf)的ai雄性猪，并且通过基于pcr的测试被鉴定为perv-c阳性。的野猪雄性2的全基因组测序如实施例1第1.2节中所述进行。
[0200]
2.2结果
[0201]
2.2.1perv序列的基因组测序和鉴定
[0202]
共检测到25个基因组区域覆盖超过50％的查询(kc116219)(图8)，只有8个覆盖超过90％。选择这些作为潜在功能性perv的候选物用于进一步分析(表3)。
[0203]
表3.覆盖超过90％的perv-c序列(kc116219)的野猪雄性2的基因组区域。
[0204][0205]
采用mafft将8个片段与变体a、b和c(变体c：kc116219、kc116221、am229311；重组变体a/c：ay570980、ay953542；变体a：aj279056、gu980187；变体b：eu523109、aj133816)的9个现有perv参考序列进行比对(图9)(tang等人，2016；xiang等人，2013)。
[0206]
此外，还使用perv-a、b、c和a/c参考进行了等同分析。当覆盖阈值提高到60％时，在blast结果中一致地发现相同的25个基因组区域，除了使用perv-b参考序列不能检测到序列nc_010447.5。然而，当覆盖阈值提高到90％时，在这些perv-a、b、c和a/c参考中不一致
地发现18个基因组区域。
[0207]
2.2.2系统发育分析
[0208]
将具有大于90％perv-c序列(kc116219)覆盖率的8个片段的系统发育与9个现有perv参考序列一起构建以通过iq-tree鉴定每个基因组区域的最接近perv变体。系统发育结果表明具有2个perv-a参考序列的8个片段，这意味着雄性2基因组的所有这8个区域显示出与perv-a更大的相似性(图10)。此外，我们还对在perv-a、b、c和a/c参考中发现不一致的18个基因组区域进行了系统发育分析，覆盖阈值为90％。结果显示8个基因组区域(与perv-c覆盖度大于90％的区域相同)与2个perv-a参考，没有基因组区域与perv-a/c和perv-c分组(图11)。
[0209]
2.2.3perv基因分析
[0210]
这18个片段的蛋白编码区通过由ncbi网站实现的具有标准遗传密码的orf finder来鉴定。结果显示17个序列含有与功能丧失相关的特征，并且发现仅染色体y上的序列(nc_010462.3包括3个逆转录病毒基因(gag、pol和env)的全长(表4)。
[0211]
表4.野猪雄性2的选择的18个片段的蛋白编码区。显示了perv-c(kc116219)和perv-a(gu980187)的两个参考序列。
[0212][0213]
进一步的分析集中于独立地搜索三个perv基因。使用参考序列kc116219(gag 1566bp、env 1917bp和pol 3585bp)的每个基因对野猪雄性2基因组进行blast：
[0214]
gag：发现34个基因组区域具有》＝90％的查询覆盖率，但只有14个区域包括全长gag基因。选择总共46个查询覆盖率≥70％的序列进行系统发育分析(图12)。
[0215]
pol：发现25个基因组区域具有》＝90％的查询覆盖率，但只有11个区域包括全长
pol基因。选择总共27个查询覆盖率≥70％的序列进行系统发育分析(图13)。
[0216]
env：发现16个基因组区域具有》＝90％的查询覆盖率，但只有4个区域包括全长env基因。选择总共18个查询覆盖率≥70％的序列进行系统发育分析(图14)。还进行了perv长末端重复序列(ltr)分析并证实了上述结果(结果未示出)。
[0217]
2.3结论
[0218]
对于野猪雄性2基因组，在用perv-a、b、c和a/c参考文献进行的四次检索的blast结果中一致地发现了覆盖perv序列的至少60％的24个基因组区域，唯一的例外是不能通过perv-b参考检测到nc_010447.5序列。仅一个片段(nc_010456.5；染色体14，位置62,583,591-62,590,005)显示与perv-cgag基因高度相似，但这仅部分匹配kc116219的perv参考序列，具有73.91％的覆盖率(图8)。与perv-b、c或a/c序列相比，具有大于90％perv-c覆盖的8个片段物显示与perv-a序列的更大相似性(图10)。使用90％的覆盖阈值在perv-a、b、c和a/c参考中不一致地发现的18个基因组区域未与perv-a/c或perv-c序列分组(图11)。仅检测到一个序列(染色体y上的nc_010462.3)包括3个逆转录病毒基因(gag、pol和env)的全长(表4)。此外，nc_010462.3的序列与perv-a分组。此外，在独立构建三个perv基因(gag、pol和env)的系统发育后，结果显示没有发现基因组区域与来自perv-a/c或的参考基因分组(图5-7)。
[0219]
令人惊讶的是，这些分析显示野猪雄性2事实上是perv-c阴性的，尽管先前的基于pcr的测试阳性。该新的选择方法显示在野猪雄性2基因组中没有功能性perv-a/c或perv-c序列的证据，表明该个体是作为用于异种移植到人受者中的组织和/或细胞的供体猪的候选，或作为通过如下所述的基因编辑技术进一步操作的基础猪的候选。
[0220]
3.实施例3
[0221]
该实施例描述了来源于奥克兰岛(ai)猪肾的nzk1细胞系的产生和表征。
[0222]
3.1方法
[0223]
3.1.1分离肾源性ai猪细胞
[0224]
从来自两只个体动物的组织样品中分离肾源性原代ai猪细胞。一个是2018年2月6日出生后不久意外死亡的雄性新生仔猪(#18/pa007)，所得细胞系表示为nzk1。
[0225]
基于来自richter等人(2012)的方法分离肾细胞。简言之，首先洗涤来自肾皮质和髓质的1cm3立方体组织，然后在切碎后离心。之后，将组织重新悬浮在15ml含有0.1％(w/v)胶原酶(i型或ii型；invitrogen)的hank缓冲盐溶液中，并在37℃下孵育，同时搅拌1至1.5h。将含有肾细胞的上清液通过100μm筛网过滤，并用dulbecco's改良的eagle's培养基(dmem) glutamax(gibco)洗涤，并再次离心(5-10min，180
×
g)。将所得细胞团块接种到组织培养板或烧瓶上。将剩余的未消化的组织片在37℃下用0.25％胰蛋白酶/0.02％edta进一步处理15min以收获另外的细胞。在含有非必需氨基酸(gibco)，0.1mm 2-巯基乙醇(gibco)和10％胎牛血清(fcs)的dmem glutamax中培养肾细胞。前几天的培养基包含1％(v/v)青霉素g/链霉素和两性霉素b。
[0226]
通过在各种底物上培养nzk1细胞来测定原代ai肾细胞在连续传代中的群体倍增时间；包括直接在组织培养塑料上，以及0.1％明胶(sigma)或0.01％胶原(sigma)的涂层上。
[0227]
制备有丝分裂细胞扩散以测定nzk1细胞的染色体数目。
[0228]
使用类似方法从雌性ai仔猪的肾脏建立另外的细胞系，表示为nzk3。
[0229]
3.2结果
[0230]
在重复传代中接种1
×
105nzk1细胞/3cm培养皿后，与在明胶或胶原包被的培养皿上生长的细胞相比，组织培养塑料上的nzk1细胞的群体倍增时间(pdt)稳定增加(图15和16)。前5代的平均pdt为25.6h。尽管明胶和胶原培养皿上的pdt在培养的15-20代之间增加到44h，但在组织培养塑料上生长的细胞增加2.6倍。
[0231]
第3代的nzk1细胞显示大部分二倍体染色体数(2n＝38，图17)。
[0232]
4.实施例4
[0233]
该实施例描述了具有ggta1基因的功能性破坏，因此缺乏αgal异种抗原的奥克兰岛(ai)猪细胞系的产生。该细胞系由实施例3中所述的nzk1细胞产生。
[0234]
4.1方法
[0235]
4.1.1核酸构建体
[0236]
使用crispor设计工具(haeussler等人，2016)设计了两种指导rna(grna)，其对分别在ensemble基因enssscg00000005518的位置261,513,520和261,513,686处开始的ggta1外显子8(分别为65fw-ctctcgtaggtgaactcgtc和208rev
–
gatgcgcatgaagaccatcg)具有靶特异性。
[0237]
根据公开的方案(ran等人，2013)，用短衔接蛋白合成grna的两条链的dna寡核苷酸，退火并克隆到表达载体px330中。
[0238]
4.1.2细胞培养和转染
[0239]
将如实施例3中分离的肾源性原代ai猪细胞在dmem 具有非必需氨基酸、0.1mm 2-巯基乙醇和10％fcs的glutamax中在37℃下在用0.1％明胶(sigma-aldrich)涂覆的培养表面上培养1h，然后使用。根据制造商的说明(invitrogen)使用neon转染系统将crispr质粒递送到细胞中。简言之，通过胰蛋白酶酶切收获ai猪细胞，用不含钙和镁的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)(sigma-aldrich)洗涤并离心。将约2
×
106个细胞悬浮于120μl的再悬浮缓冲液(invitrogen)中，其当使用单个和两个crispr质粒含有总计5μg质粒dna，使用三个和四个crispr质粒时含10μg。使用neon程序a3(1500v脉冲电压，20ms脉冲宽度，1个脉冲)用100μl尖端电穿孔ai猪细胞。转染后，将细胞接种到在含有en strep(gibco)的培养基中明胶包被的板中，并在37℃用5％co2培养。
[0240]
4.1.3crispr活性测定
[0241]
转染后48h收获用ggta1特异性crispr的表达质粒(65fw，208rev)转染的肾源性原代ai猪细胞。将大约1
×
104个转染细胞在50℃下在pcr缓冲液(10mm tris-hcl、50nm kcl、1.5mm mgcl2、ph 8.3；roche)中的20μl裂解缓冲液(0.2μg/ml蛋白酶k(qiagen)中孵育30min)，然后在95℃孵育10min以灭活反应。将粗裂解物(2μl)与18μl kapa 2g fast hotstart ready mix(kapa biosystems)混合，用ggta1引物(ggta1f-ccagcagtattctggggataaga)和ggta1r-cccagaggttacatttacccca3)pcr扩增ggta1靶基因座。pcr条件如下：95℃，3min；95℃，15s，60℃，15s和72℃，1s循环40次；最终延伸步骤为72℃下5min。pcr片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后显现，使用nucleo-spin凝胶和pcr clean-up试剂盒(macherey-nagel)分离并测序。从crispr切割位点周围开始的多个序列的重叠被解释为切割活性的指示。利用tracking of indels by decomposition(tide；
brinkman等人，2014)对序列结果进行分析以对野生型序列的减少和在扩增的靶区域中具有小突变的几种不同序列的存在进行定量。
[0242]
4.1.4针对αgal的反选择和细胞克隆的分离
[0243]
如前所述(fujimura等人，2008)反选择用ggta1特异性crispr转染的肾源性原代ai猪细胞。简言之，转染后7天，收获细胞并将3
×
106个细胞与30μl生物素缀合的同工凝集素ib4(来自enzo life science,farmingdale n.y的ib4凝集素)在600μl的pbs中孵育15min。随后，将细胞在10ml的pbs中洗涤以除去未结合的同工凝集素缀合物，并与600μl链霉亲和素-缀合的dynabead(invitrogen)在冰上孵育，偶尔混合细胞悬浮液。孵育后，加入5ml的pbs，将细胞悬浮液转移到板磁体上的6孔板的单个孔中并孵育1min。ib4凝集素特异于αgal表位；不结合dynabead的细胞保留在代表不再表达αgal表位的细胞的上清液中。吸出上清液并将dynabed选择再重复两次。将来自最终上清液的细胞接种到35mm培养皿中并培养过夜。然后用玻璃毛细管手动挑取有丝分裂细胞并将单个细胞转移到8个96孔板的孔中以分离细胞克隆。约14天后，各个细胞克隆达到融合，首先转移到48孔板中，然后转移到12孔板和6孔板中进一步扩增。当细胞克隆在6孔或已经在12孔阶段达到融合时，取出小部分细胞用于突变筛选，冷冻保存剩余的细胞以捕获细胞克隆。
[0244]
4.1.5用于位点特异性突变和pcr分析的细胞克隆的表征
[0245]
用引物ggta1f/r对靶区域进行pcr扩增，如上所述进行可视化和测序。所有测序均由商业服务提供商(massey genome service，新西兰)进行。
[0246]
4.2结果
[0247]
4.2.1用于切割活性的crispr设计和测试
[0248]
基于公共猪基因组，cispor设计工具(haeussler等人，2016)用于鉴定删除破坏外显子8中ggta1基因的阅读框的152bp片段的crsipr对(图18)。
[0249]
然后测定ai猪细胞nzk1中ggta1基因的靶区域的序列。序列与公共猪基因组的比较揭示ai猪序列中不存在任何多态性(图19)。这证实了ai猪细胞中存在未改变的crispr结合位点，以及两种crispr 65fw和208rev用于编辑ai猪细胞的适用性。
[0250]
通过用编码两种crispr中的每一种的质粒转染nzk1细胞并分析用于编辑的靶基因座来验证crispr的活性。转染后，收获细胞并从它们的dna中pcr扩增ggta1靶区域。扩增片段的序列分析揭示了在起始处的独特序列，其从预测的crispr切割位点周围向前变为多个重叠序列，表明存在crispr诱导的突变(图20)。通过序列的tracking of indels by decomposition(tide)分析进一步证实了这一点。这检测到未改变的野生型序列从nzk1细胞的100％下降到ggta1特异性crispr转染的ai细胞的pcr片段的24.1％-26.0％。(图21)。此外，存在新的序列变体，其在crispr切割位点附近包括小的缺失和插入，并且存在具有小突变的几种不同序列。总之，这为这两种crispr的稳健的位点特异性切割活性提供了强有力的证据。
[0251]
4.2.2nzk1αgal敲除细胞克隆的分离
[0252]
用表达ggta1特异性crispr 65fw和208rev的两种质粒转染如实施例3中所述的肾源性原代ai猪细胞nzk1。培养7天后，针对αgal表位的存在反选择细胞。从所选择的细胞群中，手工挑选有丝分裂细胞并分别转移到96孔板中以分离细胞克隆。在将细胞克隆扩增到12孔或6孔板中之后，取出一小部分细胞用于突变筛选，并将剩余的细胞冷冻保存以捕获细
胞克隆。
[0253]
从细胞克隆中分离的基因组dna进行ggta1靶区域的pcr扩增，并在琼脂糖凝胶上分析扩增片段的大小(图22a)。这揭示了具有两个较小片段的细胞克隆，表明存在两个不同的缺失等位基因，而其它的仅具有可能携带具有相同缺失的两个等位基因的较小大小的单个片段(如细胞克隆g53、g61和g12)。对产生单个片段的细胞克隆测序以确定确切的突变并证实存在两个相同的缺失等位基因(图22b)。所有测序的细胞克隆具有两个相同的缺失等位基因(纯合的，双等位基因的)，大多数具有152bp缺失，这与两个预测的crispr切割位点之间的插入区域的精确切除相关。
[0254]
表征各个细胞克隆中编辑的ggta1突变的结果总结于表5中。
[0255]
表5.表征的ggta1敲除细胞克隆的总结。
[0256][0257]
4.3结论
[0258]
crispr设计是有效的，并且产生对ggta1基因中的靶基因座具有位点特异性切割活性的crispr。使用两种ggta1特异性引物产生了许多细胞克隆，其中精确切除了两种crispr的预测切割位点之间的插入序列。使用该方法，产生nzk1细胞系中的ggta1敲除。该新细胞系可用于敲除另外的异种抗原，用于表达人免疫相容性基因，和/或用于体细胞核移植以产生可存活的胚胎和最终可用作异种移植的器官、组织和细胞来源的动物。
[0259]
5.实施例5
[0260]
该实施例描述了具有cmah基因的功能性破坏，缺乏neu5gc异种抗原的奥克兰岛(ai)猪细胞系的产生。
[0261]
5.1方法
[0262]
5.1.1核酸构建体
[0263]
使用crispor设计工具(haeussler等人，2016)设计了指导rna(grna)以靶向分别在ensemble基因enssscg00000001099的位置19,917,647和19,917,702处开始的cmah(分别为68rev-taagaataagagccgcctga和165fw-ttgagattggcagcttcggc)的外显子3。
[0264]
根据公开的方案(ran等人，2013)，用短衔接蛋白合成grna的两条链的dna寡核苷酸，退火并克隆到表达载体px330中。
[0265]
5.1.2细胞培养和转染
[0266]
如实施例4第4.1.2节所述进行细胞培养和转染。
[0267]
5.1.3crispr活性测定
[0268]
使用cmah特异性crispr(68rev，165fw)和cmah引物(cmahf
–
gagctgccgtaaaggagctt和cmahr-ccttgatgggtaggatggcc3)如实施例4第4.1.3节所述进行crispr活性测定。
[0269]
5.2结果
[0270]
5.2.1用于切割活性的crispr设计和测试
[0271]
基于公共猪基因组，cispor设计工具(haeussler等人，2016)用于鉴定删除破坏外显子3中cmah基因的阅读框的88bp片段的crsipr对(图23)。
[0272]
然后测定ai猪细胞nzk1中cmah基因的靶区域的序列。序列与公共猪基因组的比较揭示ai猪序列中不存在任何多态性(图24)。这证实了ai猪细胞中存在未改变的crispr结合位点，以及两种crispr 68rev和165fw用于编辑ai猪细胞的适用性。
[0273]
通过用编码两种crispr中的每一种的质粒转染nzk1细胞并分析用于编辑的靶基因座来验证crispr的活性。转染后，收获细胞并从它们的dna中pcr扩增cmah靶区域。扩增片段的序列分析揭示了在起始处的独特序列，其从预测的crispr切割位点周围向前变为多个重叠序列，表明存在crispr诱导的突变(图25)。通过序列的tracking of indels by decomposition(tide)分析进一步证实了这一点。这检测到未改变的野生型序列从nzk1细胞的100％下降到cmah特异性crispr转染的ai细胞的pcr片段10.5％-14.3％(图26)。此外，存在新的序列变体，其在crispr切割位点附近包括小的缺失和插入，并且存在具有小突变的几种不同序列。总之，这为这两种crispr的稳健的位点特异性切割活性提供了强有力的证据。
[0274]
5.2.2nzk3 cmah敲除细胞克隆的分离
[0275]
用表达cmah特异性crispr 165fw和68rev的两种质粒转染如实施例3中所述的肾源性原代ai猪细胞nzk3。培养4天后，随机挑选有丝分裂细胞作为双联体，并分别转移到96孔板中以分离细胞克隆。在将细胞克隆扩增到12孔或6孔板中之后，取出一小部分细胞用于突变筛选，并将剩余的细胞冷冻保存以捕获细胞克隆。
[0276]
从25个候选细胞克隆中分离的基因组dna进行cmah靶区域的pcr扩增，并在琼脂糖凝胶上分析扩增片段的大小(图27a)。随后通过测序分析所有25个细胞克隆(图27b)，结果总结在表6中。
[0277]
表6.表征的cmah敲除nzk3细胞克隆的总结。*表示评估为产生活cmah敲除猪的合适候选物的细胞克隆。
[0278][0279]
在细胞克隆分析中，认为有5个适合产生cmah敲除猪(在表6表6中用*表示)。最好的候选物是具有纯合双等位基因1bp插入的克隆90。另一个纯合的双等位基因细胞克隆(38)在两个crispr切割位点都具有24bp和164bp的插入。剩余的三个细胞克隆(86、89和104)是杂合双等位基因，并具有两种不同的突变等位基因。若干细胞克隆(4)未被编辑，两个基因都显示野生型序列。另一组13个细胞克隆没有进一步详细分析，因为它们具有一个剩余的野生型等位基因或具有一个或两个不可能破坏基因功能的框内缺失。其它细胞克隆显示出混合序列，尽管扩增了作为单一pcr片段出现的序列。我们对混合序列的初步分析表明，它们不太可能是合适的候选物，因此我们没有进一步投入任何努力来鉴定这些细胞克隆中存在的确切突变。
[0280]
5.3结论
[0281]
crispr设计是有效的，并且产生对cmah基因中的靶基因座具有位点特异性切割活性的crispr。与实施例3中产生的ggta1突变不同，cmah基因中的实际和预测的切割位点是不同的，导致许多细胞克隆具有框内缺失和无功能性破坏。此外，我们观察到与第二cmah crisppr 165fw相比，cmah crispr 68rev具有更高的活性。
[0282]
总之，编辑效率足够高以允许分离cmah ko细胞克隆以产生新的细胞系。此外，可以选择分离的细胞克隆敲除的纯合双等位基因突变体，这将促进未来的繁殖方案。该新细胞系可用于敲除另外的异种抗原，用于表达人免疫相容性基因，和/或用于体细胞核移植以产生可存活的胚胎和最终可用作异种移植的器官、组织和细胞来源的动物。
[0283]
6.实施例6
[0284]
该实施例描述了具有对ggta1和cmah基因的功能性破坏并因此缺乏αgal和neu5gc异种抗原的奥克兰岛(ai)猪细胞系的产生。该细胞系由实施例3中所述的nzk1细胞产生。
[0285]
6.1方法
[0286]
6.1.1crispr
[0287]
ggta1 crispr如实施例4第4.2.1节所述，cmah crispr如实施例5第5.2.1节所述。
[0288]
6.1.2细胞培养和转染
[0289]
使用如实施例3所述的nzk1细胞。细胞培养和转染方法如实施例4第4.1.2节所述。
[0290]
6.1.3反选择αgal
[0291]
如实施例4第4.1.4节所述使用反选择。
[0292]
6.2结果
[0293]
6.2.1nzk1αgal/cmah双敲除细胞克隆的分离
[0294]
用表达两种ggta1特异性crispr(65fw和208rev)和两种cmah特异性crispr(165fw和68rev)的四种质粒转染nzk1细胞。培养7天后，基于具有ggta1突变的细胞有很好的机会在cmah基因座也突变并富集具有两种基因突变的细胞的假设，针对αgal表位的存在对细胞进行反选择。从所选择的细胞群中，手工挑选有丝分裂细胞，分别转移到96孔板中以分离细胞克隆。在将细胞克隆扩增到12孔或6孔板中之后，取出一小部分细胞用于突变筛选，并将剩余的细胞冷冻保存以捕获细胞克隆。
[0295]
使用实施例4和5中描述的方法分别pcr扩增从细胞克隆分离的基因组dna的ggta1和cmah靶区域。在琼脂糖凝胶上分析两个基因的扩增片段的大小(图28)。
[0296]
pcr分析揭示了具有一个或两个基因的两个片段的细胞克隆(例如4.10)，以及具有ggta1和cmah的单个片段的细胞克隆(例如4.68，4.16)。在通过pcr分析的总共20个细胞克隆中，通过序列分析进一步表征了12个细胞克隆的特异性突变。图29描述了细胞克隆4.16的结果，揭示了ggta1基因中的纯合双等位基因152bp缺失和两个较小的缺失(9bp和22bp)，两个cmah特异性切割位点各一个也存在于两个等位基因上(纯合双等位基因)。细胞克隆4.68是具有破坏两种基因的纯合双等位基因突变(ggta1中的152bp缺失和cmah中的1bp插入)的另一种细胞克隆。另外的细胞克隆(4.5)对两种基因都有破坏，但对每种基因都有两种不同的突变等位基因(杂合双等位基因)。细胞克隆表征的总结提供于表7中。
[0297]
表7.表征的ggta1和cmah双敲除nzk1细胞克隆的总结。*表示评估为产生活ggta1-cmah双敲除猪的合适候选物的细胞克隆。
[0298][0299]
6.3结论
[0300]
在反选择程序的帮助下，成功产生nzk1细胞系中的ggat1和cmah双敲除。此外，分离纯合双等位基因突变体用于分离的细胞克隆敲除以产生新的细胞系，其将促进未来的繁
殖方案。例如，该新细胞系可用于敲除另外的异种抗原，用于表达人免疫相容性基因，和/或用于体细胞核移植以产生可存活的胚胎和最终可用作异种移植的器官、组织和细胞来源的动物。
[0301]
7.实施例7
[0302]
该实施例描述了具有ggta1基因的功能性破坏，因此缺乏αgal异种抗原的奥克兰岛(ai)猪细胞系的产生。该细胞系由实施例3中所述的nzk3细胞产生。
[0303]
7.1方法
[0304]
7.1.1crispr
[0305]
ggta1特异性crispr 65fw和208rev如实施例4第4.2.1节所述。
[0306]
7.1.2细胞培养和转染
[0307]
用表达ggta1特异性crispr 65fw和208rev的两种质粒转染如实施例3中所述的肾源性原代ai猪细胞nzk3。转染方法如实施例4第4.1.2节所述。
[0308]
7.1.1反选择αgal
[0309]
如实施例4第4.1.4节所述使用反选择。
[0310]
7.2结果
[0311]
7.2.1nzk3αgal敲除细胞克隆的分离
[0312]
培养7天后，针对αgal表位的存在反选择细胞。从所选择的细胞群中，手工挑选有丝分裂细胞，分别转移到96孔板中以分离细胞克隆。在将细胞克隆扩增到12孔或6孔板中之后，取出一小部分细胞用于突变筛选，并将剩余的细胞冷冻保存以捕获细胞克隆。
[0313]
从细胞克隆中分离的基因组dna进行ggta1靶区域的pcr扩增，并在琼脂糖凝胶上分析扩增片段的大小(图30a)。在我们通过pcr分析的28个细胞克隆中，我们鉴定了具有单个较小片段的5个细胞克隆(ga2、ga5、ga20、ga35和ga65)，其可能携带我们在我们的上述实验中作为频繁编辑结果观察到的纯合双等位基因152bp缺失等位基因。测序证实所有5个细胞克隆在ggta1基因座中携带纯合双等位基因152bp缺失(图30b)。
[0314]
7.3结论
[0315]
如实施例3中，这次在nzk3细胞系中产生ggta1敲除。该新细胞系可用于敲除另外的异种抗原，用于表达人免疫相容性基因和/或用于体细胞核移植以产生可存活的胚胎和最终可用作异种移植的器官、组织和细胞来源的动物。
[0316]
8.实施例8
[0317]
该实施例描述了具有对ggta1和cmah基因的功能性破坏并因此缺乏αgal和neu5gc异种抗原的奥克兰岛(ai)猪细胞系的产生。该细胞系由实施例3中所述的nzk3细胞产生。
[0318]
8.1方法
[0319]
8.1.1crispr
[0320]
ggta1 crispr如实施例4第4.2.1节所述，cmah crispr如实施例5第5.2.1节所述。
[0321]
8.1.2细胞培养和转染
[0322]
用表达两种ggta1特异性crispr(65fw和208rev)和两种cmah特异性crispr(165fw和68rev)的四种质粒转染如实施例3中所述的肾源性原代ai猪细胞nzk3。转染方法如实施例4第4.1.2节所述。
[0323]
8.1.3反选择αgal
[0324]
如实施例4第4.1.4节所述使用反选择。
[0325]
8.1.4αgal表位的荧光激活细胞分选(facs)分析
[0326]
将来自双ko细胞克隆的细胞(1
×
106)用胰蛋白酶消化，用pbs洗涤并且与如先前描述的fitc缀合的同工凝集素b4一起孵育(hauschild等人，2011)。随后，在facsverse(becton dickinson)上分析细胞的荧光水平。
[0327]
8.2结果
[0328]
8.2.1nzk3αgal/cmah双敲除细胞克隆的分离
[0329]
培养7天后，针对αgal表位的存在反选择细胞，手动挑选有丝分裂细胞并单独转移到96孔板中以分离细胞克隆。培养物的污染阻碍了细胞克隆在12孔或6孔板中的扩增，这将细胞克隆的数目限制为表8中总结的可用于分析的仅7个。仅一个细胞克隆gc15具有破坏两个靶基因的突变，尽管具有ggta1(一个等位基因上1bp插入加5bp缺失，另一个等位基因上152bp缺失)和cmah(一个等位基因上11bp缺失，另一个等位基因上107bp缺失)的两个不同突变等位基因。其它六个细胞克隆具有框内突变，并且一个或两个基因排除它们作为具有ggta1和cmah的功能性ko的细胞克隆的候选物。
[0330]
表8.表征的ggta1和cmah双敲除nzk3细胞克隆的总结。*表示被评估为产生活ggta1-cmah双敲除猪的合适候选物的细胞克隆。
[0331][0332]
由于对于两种基因仅具有杂合双等位基因突变的单细胞克隆的可用性，这两种基因由于不同等位基因的随机分离将使随后的繁殖程序复杂化，我们决定重复转染和分离另外的ko细胞克隆。对于该重复，我们用表达两种ggta1特异性crispr(65fw和208rev)和一种cmah特异性crispr(68rev)的三种质粒转染nzk3。培养7天后，针对αgal表位的存在反选择细胞，手动挑选有丝分裂细胞并单独转移到96孔板中以分离细胞克隆。在将细胞克隆扩增到12孔或6孔板中之后，取出一小部分细胞用于突变筛选，并将剩余的细胞冷冻保存以捕获细胞克隆。
[0333]
从52个细胞克隆分离的基因组dna分别pcr扩增ggta1和cmah靶区域，对21个克隆的靶区域测序以测定靶基因座处的精确序列变化。分析证明我们已经分离了具有纯合双等
位基因突变的四个细胞克隆，破坏了ggta1和cmah基因的阅读框(表9)。所有5个细胞克隆都是产生双ko ai猪的合适候选物。
[0334]
表9.具有ggta1和cmah的纯合敲除突变等位基因的双敲除细胞克隆。
[0335][0336]
8.2.2ggta1基因的功能性破坏的确认
[0337]
使用两种crispr破坏ggta1基因导致我们的大多数细胞克隆在外显子8中具有152bp片段的精确切除。为了证实该突变在功能上破坏了ggta1基因，我们分析了来自在ggta1中具有纯合的双等位基因152bp缺失的两个双ko细胞克隆(3cg33，3cg55)的细胞。将细胞与特异性结合αgal表位的同工凝集素b4-fitc缀合物一起孵育。除去任何未结合的同工凝集素缀合物后，通过流式细胞术分析细胞中荧光标记的同工凝集素的结合或未结合，作为αgal表位存在或不存在的指示。在不存在同工凝集素缀合物的情况下，野生型ai猪细胞是非荧光的。与同工凝集素一起孵育，由于同工凝集素缀合物与ai野生型细胞表面上的αgal表位的结合，通过荧光强度的强烈变化指示细胞变成荧光的(图31a)。相反，不表达αgal表位的人hek细胞不依赖于与同工凝集素缀合物的孵育而保持非荧光(图31c)。在ggta1外显子8中具有152bp缺失的双ko细胞在同工凝集素缀合物存在下保持非荧光，并显示与人hek细胞相同的模式，证明双ko ai猪细胞不再表达αgal表位(图31b)。
[0338]
8.3结论
[0339]
使用crispr、ggat1和cmah双敲除在nzk3细胞系中产生在反选择程序的帮助下以产生新颖细胞系。
[0340]
这些ggta1 ko细胞克隆中的主要突变是外显子8中的152bp缺失。使用流式细胞术，证明该突变功能性破坏ggta1基因并导致不再表达αgal表位的ai猪细胞。然而，不可能测试cmah的功能性破坏，因为cmah ko细胞可以从培养基中摄取并掺入cmah特异性糖基化neu5gc。一旦来自cmah ko胎仔和仔猪的组织或血液样品可用，测试将变得可行。该新细胞系可用于敲除另外的异种抗原，用于表达人相容性基因和/或用于体细胞核移植以产生可存活的胚胎和最终可用作异种移植的器官、组织和细胞来源的动物。
[0341]
*所有基因编辑都是在新西兰agresearch limited的合同下进行的。
[0342]
9.实施例9
[0343]
该实施例描述了用于从基因编辑的细胞系产生胚泡的猪体细胞核移植(scnt)的发展。
[0344]
9.1方法
[0345]
卵子来源于在ruakura abattoir(agresearch，新西兰)宰杀的青春期前母猪。卵泡抽吸回收卵丘-卵母细胞复合体(coc)，体外成熟(ivm)44h。比较了两种ivm系统与成熟猪卵母细胞：含有1mm二丁酰环单磷酸腺苷的双相(esof和lsof)ivm1/2培养基用于前20至24h(bagg等人，2006；somfai和hirao，2011)和在整个ivm期补充fgf2、lif和igf1的fli培养基
(yuan等人，2017)。
[0346]
通过用0.1％透明质酸酶(sigma)在2000rpm下涡旋约60-90s来裸露coc。将卵母细胞在hepes-缓冲的tcm199培养基(h199) 10％fcs中洗涤两次。将裸露的卵母细胞与0.2m蔗糖在h199 10％fcs中孵育10min。选择与第一极体(1pb)一起保持规则，圆形(但直径较小)的卵母细胞用于使用。丢弃在蔗糖处理后显示非常不规则形状的那些卵母细胞，因为这些卵母细胞的发育质量较差(dang-nguyen等人，2018；lee等人，2014)。
[0347]
对于无带scnt，用链霉蛋白酶去除透明带。在用5μg/ml h33342加7.5μg/ml细胞松弛素b(全部为sigma)将dna染色5min之前彻底洗涤卵母细胞。用外径24μm的平头移液管在35℃下进行中期ii期卵母细胞的uv辅助去核。
[0348]
在具有0.5％fcs的培养基中5-7天后，将供体细胞(例如nzk1肾成纤维细胞)胰蛋白酶化成单细胞悬浮液。借助于在h199 3mg/ml bsa中的20μg/ml植物凝集素将单个细胞粘附到每个去核胞质体上。在ivm开始后约48h，在不含钙的融合缓冲液中用1.2kv/cm(30μs)或2kv/cm(10μs)的两个直流脉冲实现电融合。融合后，将重建的胚胎在不含ca 10％fcs 5μg/ml细胞松弛素b的胚胎培养基中在38.5℃下在空气中的5％co2中保持2至4h，然后活化。
[0349]
为了在有助于核重编程的卵母细胞中保持高水平的成熟促进因子-细胞周期蛋白b复合物，一些实验比较了加入5μm蛋白酶体抑制剂mg132(sigma)。从卵母细胞的蔗糖选择的时间直到nt重建胚胎活化，将其加入培养基制剂中(le bourhis等人，2010)。
[0350]
在ivm开始后约50-52h，在含有0.1mm钙的缓冲液中，用1.0-1.5kv/cm的三次直流脉冲(每次80μs)启动重建的nt胚胎的活化。
[0351]
在电刺激的5min内，将重建的胚胎转移到补充有2mm的6-二甲基氨基嘌呤 5μg/ml细胞松弛素b的培养基(例如esof)中，并在38.5℃下在5％co2中以5μl滴单独培养3h。然后，在体外培养6-7天之前，在hepes sof中彻底洗涤胚胎。在38.5℃的模块化孵化器中，在20μl滴esof(或替代培养基)制成的微孔凹陷中，在低氧气氛(5:7:88，co2:o2:n2)中对大约10-12个去透明带胚胎进行4天的群体培养。从第4天到第7天，培养基配方更换为lsof(或替代培养基)。在第6天，将任何晚期桑椹胚和早期胚泡期胚胎在油下单独转移至5μl滴lsof(如果需要， 5％fcs)中并继续培养。在第6或7天评估胚胎发育，并在选择的实验中测定所得胚泡中的细胞核数目。
[0352]
9.2结果
[0353]
与ivm1/2相比，fli培养基系统在ivm后产生显著更多的可用卵母细胞。然而，对于双相ivm系统，scnt胚胎而非孤雌生殖激活的卵母细胞(pg)的发育高三倍(表10)。与pg对照相比，scnt胚胎的无带胚胎发育显著较少。
[0354]
表10.两种ivm系统用于从体细胞核移植(scnt)或孤雌生殖卵母细胞活化(pg)产生的猪胚胎发育的比较。nivm＝体外成熟的卵母细胞的数目。1pb＝卵母细胞中的第一极体。nivc＝体外培养的胚胎数。
ab
p《0.001.
cd
p《0.05
[0355][0356]
检查在卵母细胞选择和nt重建活化之间加入5μm蛋白酶体抑制剂mg132的初步实验不能显示在scnt或pg后体外发育方面的任何益处(表11)。
[0357]
表11.活化前加入蛋白酶体抑制剂mg132不会增加体细胞核移植(scnt)或孤雌生殖卵母细胞活化(pg)后的猪胚胎发育。nivc＝体外培养的胚胎数。
ab
p《0.05。
[0358][0359]
重点是在猪身上开发一种无透明带的scnt程序，因为在其他物种的经验表明，在简化胚胎重建和增加实验室产量方面具有优势。然而，如使用孤雌生殖活化的猪卵母细胞所证明的，在我们目前的猪中的无带体外培养系统中，胚胎发育速率仍低于更常规的带完整方法(表12)。
[0360]
表12.与无带的孤雌生殖活化卵母细胞(pg)相比，带完整的体外胚胎发育更多。nivc＝体外培养的胚胎数。
ab
p《0.0001。
[0361][0362]
9.3结论
[0363]
已知通过在用蔗糖处理后选择较高质量的卵母细胞，在体外培养的第6-7天，从无透明带的猪scnt胚胎到胚泡期的发育从5％增加到15％(dang-nguyen等人，2018)。尽管这里使用了这种卵母细胞选择程序，但是无带scnt后的发育结果通常是低的和可变的，特别是与孤雌生殖活化的卵母细胞对照相比。两相系统中卵母细胞体外成熟44h后，结合dbcamp的使用，scnt胚胎的胚泡发育比fli卵母细胞成熟系统的高(6％比2％)。
[0364]
无钙细胞融合缓冲液用于防止早熟卵母细胞活化，早熟卵母细胞活化是scnt后重新编程分化细胞核的障碍。加入mg132以维持成熟促进因子-细胞周期蛋白b复合物，促进供体核的表观遗传重编程和改善scnt胚胎发育的初步研究在这里检测的浓度和时间期间没
有显示出益处。
[0365]
猪中的无带scnt方案最初是有利的，因为在其它物种中，这在技术上更容易，并且与更常规的带完整方法相比导致更大的生产量。然而，与在牛中的情况不同，本发明的在猪中的无带胚胎培养系统与带完整的胚胎培养系统相比仍然损害体外发育潜能。因此，已经进行了利用电极针来提高细胞融合效率而产生带完整的scnt猪胚泡的初步实验。为了提高猪scnt胚胎在未来工作中体内发育的成功率，目前的建议是将重建的1细胞胚胎转移到受体小母猪的输卵管中，而不是将体外胚泡转移到子宫中。为了管理胚胎移植的物流，这可能需要胚胎玻璃化冷冻。
[0366]
本发明人预期使用本文描述的方法产生的具有一个或多个异种抗原敲除的胚泡，将其植入由本发明的cgs方法选择的雌性perv-c和perv-a/c阴性基础猪，以产生新的克隆的perv-c、perv-a/c和异种抗原阴性的猪品系(指定为nzeno-1)作为异种移植的供体。
[0367]
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