生产异胡豆苷苷元和单萜吲哚生物碱的方法与流程

1.本发明涉及用于生产异胡豆苷苷元(strictosidine aglycone)和任选的其他植物衍生的化合物的微生(microbial)工厂，例如微生物(microorganism)工厂，尤其是酵母工厂和细菌工厂。还提供了在微生物中生产异胡豆苷苷元的方法，以及有用的核酸、载体和宿主细胞。


背景技术：

2.植物产生了一些最有效的人类治疗剂，并且已被用于治疗疾病数千年。尽管植物衍生的药物种类繁多，但这些产品的绝大部分并没有进入市场，这是因为它们在植物中的含量极少，难以提取，而且对其生物合成途径的了解有限。
3.此外，基于植物提取来获得植物衍生的药物有导致物种灭绝的危险。新的监管法案力图为促进生物多样性的保护和遗传资源的可持续利用创造条件，预计这在短期内将进一步影响许多有价值的植物天然产品的供应链。
4.此外，许多植物物种不容易进行基因操作，并且合成化学几乎无望大量生产复杂的植物衍生的治疗剂。总之，需要在遗传上易处理的可持续生产宿主中重构生物合成新药和现有药物。
5.单萜吲哚生物碱(monoterpenoid indole alkaloid，mia)是植物次级代谢产物，具有显著的结构多样性和药学上有价值的生物活性，例如抗癌和抗精神病特性。这些生物碱的产生是通过高度复杂的途径发生的。
6.不同mia的共同前体是异胡豆苷(strictosidine)及其去糖基化形式，即异胡豆苷苷元。异胡豆苷是通过在由异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase)催化的反应中将断马钱子苷(secologanin)与色胺(tryptamine)偶联而形成的。异胡豆苷苷元是通过异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(strictosidine-beta-glucosidase，sgd)水解异胡豆苷而自然产生的。从异胡豆苷苷元可以产生超过2,000种mia。
7.为了实现治疗性mia的可持续供应，数十年来，研究人员一直试图阐明植物中生产mia的生物合成途径，包括常见mia前体异胡豆苷和抗癌药物长春碱(vinblastine)的平台生物合成途径。此外，在酵母细胞工厂中，从香叶醇(geraniol)到异胡豆苷的平台生物合成途径，以及从水甘草碱(tabersonine)到文多灵(vindoline)的七步生物合成途径，长春碱的直接前体都受到了重构。
8.目前生产异胡豆苷苷元的方法主要基于化学合成或植物提取。此类方法不具有成本效益，并且对环境也有显著影响。因此，需要有成本效益且对环境友好的异胡豆苷苷元生产方法。


技术实现要素：

9.本发明涉及一种能够生产异胡豆苷苷元的微生物以及在微生物中生产异胡豆苷苷元和单萜吲哚生物碱(mia)的方法。
10.在一个方面，提供了一种能够生产异胡豆苷苷元的微生物，所述微生物表达异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)，其能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元，
11.其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
12.和/或；
13.其中所述sgd是嵌合(mosaic)sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
14.d
1-d
2-d
3-d415.其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
16.其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
17.其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
18.其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
19.其中，所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
20.本文还提供了在微生物中生产异胡豆苷苷元的方法，其包括以下步骤：
21.a)提供微生物，所述细胞表达：
22.异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)，其能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元；
23.b)在包含异胡豆苷或可被所述微生物转化为异胡豆苷的底物的培养基中，培养所述微生物；
24.c)任选地，回收异胡豆苷苷元；
25.d)任选地，进一步将异胡豆苷苷元转化为单萜吲哚生物碱，
26.其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:
65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
27.和/或；
28.其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
29.d
1-d
2-d
3-d430.其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
31.其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
32.其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
33.其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
34.其中所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
35.本文还提供了一种核酸构建体，其包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106和/或seq id no:107相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的序列。
36.还提供了包含上述核酸的载体，以及包含所述载体和/或所述核酸的宿主细胞。
37.还提供了包含本文所述的微生物和/或本文所述的核酸构建体和/或本文所述的载体以及使用说明的试剂盒。
38.还提供了上述核酸、载体或宿主细胞用于生产异胡豆苷苷元的用途。
39.本文还提供了在微生物中生产单萜吲哚生物碱(mia)的方法，所述方法包括以下步骤：
40.a)提供能够将异胡豆苷苷元转化为水甘草碱(tabersonine)和/或长春质碱(catharanthine)的微生物，所述细胞表达：
41.任选地，异胡豆苷合成酶(str)；
42.异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(strictosidine-beta-glucosidase，sgd)；
43.nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(nadph
‑‑
cytochrome p450 reductase，cpr)；
44.细胞色素b5(cytochrome b5，cyb5)；
45.缝籽木嗪合成酶(geissoschizine synthase，gs)；
46.缝籽木嗪氧化酶(geissoschizine oxidase，go)；
47.redox1；
48.redox2；
49.花冠木碱o-乙酰转移酶(stemmadenine o-acetyltransferase，sat)；
50.o-乙酰基花冠木碱氧化酶(o-acetylstemmadenine oxidase，pas)；
51.脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶(dehydroprecondylocarpine acetate synthase，dpas)；
52.水甘草碱合成酶(tabersonine synthase，ts)；和/或
53.长春质碱合成酶(catharanthine synthase，cs)；
54.b)在包含异胡豆苷或可被所述微生物转化为异胡豆苷的底物的培养基中，培养所述微生物；
55.c)任选地，回收mia；
56.d)任选地，将mia加工成药物化合物，
57.其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
58.和/或；
59.其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
60.d
1-d
2-d
3-d461.其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
62.其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
63.其中d3是由seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的第三氨基酸序列，
64.其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
65.其中所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
66.本文还提供了通过本文所述的方法获得的异胡豆苷苷元、四氢鸭脚木碱(tetrahydroalstonine)、异育亨宾碱(heteroyohimbine)、水甘草碱和/或长春质碱。
67.本文还提供了治疗例如癌症、心律失常、疟疾、精神病(psychotic diseases)、高血压、抑郁症、阿尔茨海默病、成瘾和/或神经元疾病等病症的方法，包括施用治疗足量(therapeutic sufficient amount)的如本文所述地获得的mia或药物化合物。
附图说明
68.图1：通过对表达衍生自长春花(catharanthus roseus)的sgd(crosgd)单独和多个带标记的且crosgd-融合形式，以及来自蛇根木(rauvolfia serpentina)的sgd(rsesgd)的酵母细胞(酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))进行lc-ms分析所获得的四氢鸭脚木碱(tha)的高分辨率分析结果。
69.图2：衍生自长春花(crosgd)、蛇根木(rsesgd)、萝芙木(rauvolfia verticillata)(rvesgd)、常绿钩吻(gelsemium sempervirens)(gsesgd)、喜树(camptotheca acuminate)(cacsgd)、尖端赛多孢子菌(scedosporium apiospermum)(sapsgd)、绒毛钩藤(uncaria tomentosa)(utosgd)和野大豆(glycine soja)(gsosgd)的sgd之间的序列同一性。将8个蛋白序列使用t-coffee网络服务器进行比对。
70.图3：在lc-ms上测量的异育亨宾碱四氢鸭脚木碱的生物合成。在表达gsosgd、cacsgd、crosgd、utosgd、gsesgd、sapsgd、rvesgd或rsesgd的酵母菌株中测量四氢鸭脚木碱(tha)的产生。酵母菌株gsosgd用作阴性对照。p值代表阴性对照(gsosgd)分别与cacsgd、crosgd或utosgd之间的比较。
71.图4：gfp标记的crosgd和rsesgd在酵母中的定位。a)表达gfp-crosgd的酵母细胞。b)表达gfp-rsesgd的酵母细胞。箭头标记了酵母细胞中sgd的定位。
72.图5：表达rsesgd、crothas和gsesbe的酵母细胞工厂中的异育亨宾碱鸭脚木碱的生物合成，如图5中一式三份地所示。鸭脚木碱通过orbitrap fusion
tm
tribrid
tm
ms进行测量。
73.图6：用0.1mm断马钱子苷(secologanine)和1mm色胺喂养酵母菌株mia-dc，并且通过lc-ms测量水甘草碱和长春质碱的产生。a)长春质碱产生，b)水甘草碱产生，c)长春质碱标准品，和d)水甘草碱标准品。
74.图7：用0.1mm断马钱子苷和1mm色胺喂养酵母菌株mia-dc，并且通过lc-ms测量mia-dc和mia-da(对照)中水甘草碱和长春质碱的浓度水平。
75.图8：在lc-ms上测量异育亨宾碱四氢鸭脚木碱的生物合成。在表达crosgd、vmisgd1、ahusgd、himsgd2、sinsgd、telsgd、vunsgd、nsisgd1、lprsgd、achsgd1、hsusgd、mrosgd、rsesgd2、pgrsgd、opusgd、hpisgd、hansgd1、achsgd2、himsgd1、ipesgd、lsasgd1、carsgd、oeusgd、achsgd3、cmasgd、mmysgd、vmisgd3、inisgd或nsisgd2的酵母菌株中测量四氢鸭脚木碱(tha)的产生。p值代表阴性对照(crosgd)与oeusgd、achsgd3、cmasgd、mmysgd、vmisgd3、inisgd和nsisgd2之间的比较。
76.图9：在lc-ms上测量的异育亨宾碱四氢鸭脚木碱的生物合成。在表达以下嵌合sgd之一的酵母菌株中测量四氢鸭脚木碱(tha)的产生：rrcc-sgd、rccc-sgd、cccc-sgd、crcc-sgd、crcr-sgd、rrcr-sgd、cccr-sgd、rccr-sgd、crrc-sgd、rrrc-sgd、rcrc-sgd、ccrc-rgd、rcrr-sgd、crrr-sgd、rrrr-sgd和ccrr-sgd。cccc-sgd和rrrr-sgd与两个野生型序列crosgd和rsesgd相同。p值代表阴性对照(cccc-sgd/crosgd)与以下所有包含crosgd结构域3的sgd之间的比较：rrcc-sgd、rccc-sgd、crcc-sgd、crcr-sgd、rrcr-sgd、cccr-sgd和rccr-sgd。颜色表示结构域3和4的标示(idnetity)：浅灰色
–
rsesgd结构域3和4，中灰色
–
rsesgd结构域3和crosgd结构域4，深灰色
–
crosgd结构域3和crosgd/rsesgd结构域4。
77.图10：在lc-ms上测量的异育亨宾碱四氢鸭脚木碱的生物合成。在表达野生型sgd
(utosgd、gsesgd、crosgd或rvesgd)之一或工程化sgd(uurr-sgd、ggrr-sgd、ccrr-sgd或vvrr-sgd)之一的酵母菌株中测量四氢鸭脚木碱(tha)的产生。
78.图11：通过lc-ms测量的艾希氏大肠杆菌(e.coli)中的常见mia前体异胡豆苷(a)和异育亨宾碱四氢鸭脚木碱(b)的生物合成。在表达crosgd或rsesgd的细菌菌株中测量异胡豆苷和四氢鸭脚木碱的产生。纳入具有空表达载体的菌株作为阴性对照。
79.图12：衍生自长春花(crosgd)、蛇根木(rsesgd和rsesgd2)、萝芙木(rvesgd)、常绿钩吻(gsesgd)、喜树(cacsgd)、尖端赛多孢子菌(sapsgd)、绒毛钩藤(utosgd)、野大豆(gsosgd)、小蔓长春花(vinca minor)(vmisgd1和vmisgd3)、蟾蜍树(tabernaemontana elegans)(telsgd)、胡氏水甘草(amsonia hubrichtii)(ahusgd)、短小蛇根草(ophiorrhiza pumila)(opusgd)、蓝果树(nyssa sinensis)(nsisgd1和nsisgd2)、阿拉比卡咖啡(coffea arabica)(carsgd)、吐根(carapichea ipecacuanha)(ipesgd)、紫花风铃木(handroanthus impetiginosus)(himsgd2和himsgd1)、芝麻(sesamum indicum)(sinsgd)、油橄榄(olea europaea)(oeusgd)、中华猕猴桃(actinidia chinensis var.chinensis)(achsgd1、achsgd2和achsgd3)、向日葵(helianthus annuus)(hansgd)、莴苣(lactuca sativa)(lsesgd)、牵牛(ipomoea nil)(inisgd)、白屈菜(chelidonium majus)(cmasgd)、豇豆(vigna unguiculata)(vunsgd)、木蹄层孔菌(heliocybe sulcate)(hsusgd)、稻瘟病菌(pyricularia grisea)(pgrsgd)、多育孢子虫(lomentospora prolificans)(lprsgd)、hydnomerulius pinastri md-312(hpisgd)、足马杜拉分枝菌(madurella mycetomatis)(mmysgd)和moniliophthora roreri mca 2997(mrosgd)的sgd蛋白的多序列比对。将蛋白序列使用t-coffee网络服务器进行比对。
80.图13：图8中比对的36个sgd蛋白序列之间的成对序列同一性。通过使用clc main workbench 8进行比对来计算成对序列同一性(pairwise sequence identity)。
具体实施方式
81.本公开涉及生产异胡豆苷苷元和单萜吲哚生物碱(mia)的微生物和方法。
82.微生物可以是任何非天然或天然微生物。非天然意指工程化的微生物，其包含一个或多个不是微生物天然具有的基因。在本发明的一些方面，微生物表达异源sgd、嵌合sgd或其变体。
83.微生物是以单细胞、多细胞或细胞簇形式存在的微观生物。微生物可分为不同类型，例如细菌、古细菌、酵母、真菌、原生动物、藻类和病毒。因此，在一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母、真菌、原生动物、藻类和病毒组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母、真菌、原生动物和藻类组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母、真菌和藻类组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母和真菌组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自细菌、酵母和真菌。在另一个实施方案中，微生物选自细菌或酵母。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌或酵母。
84.在一些实施方案中，微生物是细菌。在一个实施方案中，所述细菌的属选自埃希氏菌(escherichia)、棒状杆菌(corynebacterium)、假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、乳球菌(lactococcus)、乳杆菌(lactobacillus)、盐单胞菌(halomonas)、双歧
杆菌(bifidobacterium)和肠球菌(enterococcus)。在优选的实施方案中，所述细菌的属是埃希氏菌属。在另一个实施方案中，微生物可以选自由以下组成的组：埃希氏菌(escherichia)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、lactococcus bacillus、halomonas elongate、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)和粪肠球菌(enterococcus faecali)。在优选的实施方案中，微生物是埃希氏菌。在一些实施方案中，细菌选自由以下组成的组：艾希氏大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、lactococcus bacillus、halomonas elongate、婴儿双歧杆菌和粪肠球菌。
85.在一些实施方案中，微生物是酵母。在一些实施方案中，微生物是来自gras(generally recognized as safe，一般公认为安全)生物体或非致病性生物体或菌株的细胞。在一些实施方案中，所述酵母(yeast)的属选自酵母菌(saccharomyces)、毕赤酵母(pichia)、耶氏酵母(yarrowia)、克鲁维酵母(kluyveromyces)、假丝酵母(candida)、红酵母(rhodotorula)、红冬孢酵母(rhodosporidium)、隐球菌(cryptococcus)、毛孢子菌(trichosporon)和油脂酵母(lipomyces)。在优选的实施方案中，所述酵母的属是酵母菌。
86.微生物可选自由以下组成的组：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、白色隐球菌(cryptococcus albidus)、lipomyces lipofera、斯达氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(rhodotorula glutinis)、trichosporon pullulan和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。在优选的实施方案中，微生物是酿酒酵母细胞。
87.微生物
88.因此本文提供了一种能够生产异胡豆苷苷元的微生物，所述微生物表达异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)，其能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元，
89.其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
90.和/或；
91.其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
92.d
1-d
2-d
3-d493.其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
94.其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
95.其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
96.其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
97.其中所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
98.因此，当向本文公开的微生物提供异胡豆苷时，所述微生物全部能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。在一些实施方案中，向微生物提供异胡豆苷，例如通过用异胡豆苷喂养培养基中的微生物。在其他实施方案中，微生物能够合成异胡豆苷，例如微生物如下所述被进一步工程化。
99.在另一个实施方案中，所述微生物进一步表达异胡豆苷合成酶(str)，其能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷。因此，当向进一步表达str的微生物提供断马钱子苷和色胺时，所述微生物能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷苷元。可以提供断马钱子苷和色胺，例如提供在培养基中。然而，在一些实施方案中，微生物能够合成断马钱子苷和/或色胺，例如，微生物被进一步工程化以合成断马钱子苷和/或色胺。
100.异胡豆苷-o-β-d-葡萄糖苷酶(sgd)
101.在微生物中表达的第一异源酶能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。第一异源酶不在微生物中天然表达。它可以衍生自真核生物或原核生物，如下详述，优选真核细胞，例如植物细胞。
102.在一些实施方案中，第一异源酶是异胡豆苷-o-β-d-葡萄糖苷酶，本文也称为sgd，并且具有ec编号ec 3.2.1.105。该酶催化以下反应：
103.异胡豆苷 h2o《＝》d-葡萄糖 异胡豆苷苷元。
104.异源sgd或其变体
105.因此，表达第一异源酶的微生物能够通过第一异源酶的作用将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。
106.异胡豆苷向异胡豆苷苷元的转化可以通过本领域已知地直接测量异胡豆苷苷元的量，或者可以如本领域已知地测量异胡豆苷向异胡豆苷苷元的转化的替代量值。由于异胡豆苷苷元具有高反应性，间接测定异胡豆苷苷元可以是优选的。例如，可以使用比色测定来追踪异胡豆苷消耗(consumption)，如geerlings et al.,2000中所述。也可以通过uv来监测异胡豆苷的消失(disappearance)，如guirimand et al.,2010中所述，或者可以测量细胞中的整体β-葡萄糖苷酶活性，例如通过uv检测合成底物，例如4-甲基伞形基-β-d-葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-β-d-glucoside)(guirimand et al.,2010)。
107.因此，为了确定sgd是否能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元，本领域技术人员可以使用任何所述方法，或者可以使用高精度质谱法来检测在培养表达sgd或猜想具有sgd活性的酶的菌株后，培养基中异胡豆苷苷元的准确质量；在培养基中为所述细胞提供异胡豆苷，或者所述细胞经过工程化并且能够合成异胡豆苷。可以在将培养液离心后直接在培养基或沉淀中检测异胡豆苷苷元。或者，可以监测异胡豆苷苷元下游的其他产物，例如四氢鸭脚木碱的存在；此类产物仅在功能性sgd、异胡豆苷和能够使用异胡豆苷苷元的酶的存在下
才会形成，如例如stavrinides et al.,2015中所述。
108.在一些实施方案中，第一异源酶是对选自以下的生物天然的sgd或其功能性变体：蛇根木、常绿钩吻、尖端赛多孢子菌或萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。
109.换句话说，在一些实施方案中，sgd是来源于以下的sgd或其功能性变体：蛇根木、常绿钩吻、尖端赛多孢子菌、萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。sgd的功能性变体是经修饰的酶，其保留了将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的能力。在一些实施方案中，sgd是如seq id no:24中所示的rsesgd或与seq id no:24具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:25中所示的gsesgd或与seq id no:25具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:26中所示的sapsgd或与seq id no:26具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:27中所示的rvesgd或与seq id no:27具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:47中所示的vmisgd1或与seq id no:47具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:48中所示的ahusgd或与seq id no:48具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:49中所示的himsgd2或与seq id no:49具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:50中所示的sinsgd或与seq id no:50具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:51中所示的telsgd或与seq id no:51具有至少70％，例如至少
80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:52中所示的vunsgd或与seq id no:52具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:53中所示的nsisgd1或与seq id no:53具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:54中所示的lprsgd或与seq id no:54具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:55中所示的achsgd1或与seq id no:55具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:56中所示的hsusgd或与seq id no:56具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:57中所示的mrosgd或与seq id no:57具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:58中所示的rsesgd2或与seq id no:58具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:59中所示的pgrsgd或与seq id no:59具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:60中所示的opusgd或与seq id no:60具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:61中所示的hpisgd或与seq id no:61具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:62中所示的hansgd1或与seq id no:62具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施
方案中，sgd是如seq id no:63中所示的achsgd2或与seq id no:63具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:64中所示的himsgd或与seq id no:64具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:65中所示的ipesgd或与seq id no:65具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:66中所示的lsasgd或与seq id no:66具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在其他实施方案中，sgd是如seq id no:67中所示的carsgd或与seq id no:67具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
110.优选地，sgd是rsesgd或其功能性变体。
111.在一些实施方案中，sgd源自产生mia的植物物种，其中所述sgd与rsesgd具有至少65％的序列同一性。因此，在一些实施方案中，sgd选自由以下组成的组：rsesgd、rvesgd、telsgd或vmisgd或与seq id no:24、seq id no:27、seq id no:51或seq id no:47具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
112.在一些实施方案中，sgd源自产生mia的植物物种，其中所述sgd与rsesgd具有至多65％的序列同一性。因此，在一些实施方案中，sgd选自由以下组成的组：gsesgd、nsisgd、opusgd、ahusgd或rsesgd2或与seq id no:25、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:48或seq id no:58具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
113.本领域技术人员将知晓如何通过使用本领域已知的方法来确定两个物种之间的序列同一性。
114.在一些实施方案中，sgd源自不产生mia(non-mia producing)的植物物种。因此，在一些实施方案中，sgd选自由以下组成的组：achsgd1、achsgd2、carsgd、hansgd、himsgd1、himsgd2、lsasgd1、sinsgd、vunsgd或ipesgd或与seq id no:55、seq id no:63、seq id no:67、seq id no:62、seq id no:64、seq id no:49、seq id no:66、seq id no:50、seq id no:52或seq id no:65具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
115.在一些实施方案中，sgd源自不产生mia的真菌物种。因此，在一些实施方案中，sgd选自由以下组成的组：hpisgd、hsusgd、lprsgd、mrosgd、pgrsgd或sapsgd或与seq id no:61、seq id no:56、seq id no:54、seq id no:57、seq id no:59或seq id no:26具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
116.在其他实施方案中，所述微生物，例如酵母细胞或细菌细胞，能够产生至少1μm的四氢鸭脚木碱。因此，在一些实施方案中，sgd选自由以下组成的组：rsesgd、vmisgd或ahusgd，或与seq id no:24、seq id no:47或seq id no:48具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
117.在其他实施方案中，sgd选自由以下组成的组：rsesgd、gsesgd、sapsgd或rvesgd，或与seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26或seq id no:27具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
118.在其他实施方案中，sgd选自由以下组成的组：rsesgd、gsesgd、sapsgd、rvesgd、vmisgd、ahusgd，或与seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:47或seq id no:48具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
119.在其他实施方案中，sgd选自由以下组成的组：rsesgd、rvesgd、vmisgd、ahusgd、himsgd、sinsgd或telsgd，或与seq id no:24、seq id no:27、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50或seq id no:51具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
120.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)或lsasgd1(seq id no:66)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
121.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd
(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
122.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
123.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
124.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
125.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:
25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
126.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
127.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
128.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
129.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
130.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
131.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
132.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如
至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
133.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
134.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
135.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
136.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至
少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
137.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
138.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
139.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
140.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:
66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
141.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
142.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
143.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
144.在一些实施方案中，所述sgd选自rsesgd(seq id no:24)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2
(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
145.在一些实施方案中，所述sgd选自gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
146.因此，在一些实施方案中，本发明的微生物可表达如上文所述的sgd。在其他实施方案中，本发明的微生物可以表达嵌合sgd。微生物可以是酵母细胞或细菌细胞，如本文所述。
147.嵌合sgd或其变体
148.本发明人已工程化出能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的新的活性嵌合sgd。所述嵌合sgd可用于用于生产异胡豆苷苷元、四氢鸭脚木碱和/或其他mia产品的微生物工厂，例如酵母工厂和细菌工厂。
149.因此，本发明还涉及嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
150.d
1-d
2-d
3-d4151.其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
152.其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
153.其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
154.其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
155.其中，所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
156.因此，嵌合sgd包含rsesgd的至少一个结构域，即第三结构域d3，和至少一个如上定义的不是rsesgd的结构域的其他结构域。
157.发明人发现sgd可以分为四个结构域：
[0158]-结构域1(d1)
[0159]-结构域2(d2)
[0160]-结构域3(d3)
[0161]-结构域4(d4)
[0162]
其示例描述在下文的实施例8和9中。
[0163]
结构域1-4中的每一个均由氨基酸的连续序列组成。结构域1是sgd中最n末端的氨基酸序列。结构域1中的第一个氨基酸残基通常是甲硫氨酸，因为这是从起始密码子翻译的第一个氨基酸，但是在结构域的部分将被切割的实施方案中，可能发生的情况是第一结构域实际上从另一个残基开始，从而去除甲硫氨酸。作为sgd中的第一结构域，结构域1之后是结构域2，然后是结构域3，然后是结构域4。结构域4是sgd中最c末端的氨基酸序列。结构域4中的最后一个氨基酸残基是sgd的连续序列中的最后一个氨基酸残基。
[0164]
sgd的结构域1-4中每一个的氨基酸位置都可以通过将sgd氨基酸序列与seq id no:24的氨基酸序列rsesgd进行比对来定义，在此使用rsesgd作为参考序列。因此，应当理解，在sgd氨基酸序列与seq id no:24的参考氨基酸序列之间的比对之后，如果一个氨基酸与seq id no:24的位置x对齐，则其对应于该位置。
[0165]
例如，结构域可以定义如下。从不是rsesgd的sgd开始，并且以下将其称为xxxsgd，进行rsesgd和xxxsgd的两个氨基酸序列的成对比对以确定xxxsgc中结构域的边界。
[0166]
因此，xxxsgd中的结构域1可以定义如下。rsesgd的结构域1(如seq id no:89中所示)用于比对xxxsgd。然后将第一结构域定义为从与seq id no:89的第一个残基对齐的氨基酸开始，并以与seq id no:89的最后一个残基对齐的氨基酸结束的xxxsgd的区域。在这个氨基酸不是甲硫氨酸的实施方案中，则可能需要在紧接该第一结构域的上游引入甲硫氨酸以确保蛋白的正确翻译，如本领域已知的。
[0167]
可以根据需要对结构域2和结构域3重复相同的过程。xxxsgd中的结构域2因此可以定义如下。rsesgd的结构域2(如seq id no:90中所示)用于比对xxxsgd。然后将第二结构域定义为从与seq id no:90的第一个残基对齐的氨基酸开始，并以与seq id no:90的最后一个残基对齐的氨基酸结束的xxxsgd的区域。xxxsgd中的结构域3因此可以定义如下。rsesgd的结构域3(如seq id no:91中所示)用于比对xxxsgd。然后将第三结构域定义为从与seq id no:91的第一个残基对齐的氨基酸开始，并以与seq id no:91的最后一个残基对齐的氨基酸结束的xxxsgd的区域。嵌合sgd的第三结构域是如seq id no:91中所示的rsesgd的结构域d3，但它仍然可用于确定xxxsgd中结构域3的位置，尤其是为了确定xxxsgd中结构域4的位置。
[0168]
xxxsgd中的结构域4优选对应于从紧接相同xxxsgd的结构域3的下游的第一个氨基酸开始并以xxxsgd的最后一个氨基酸结束的区域。换句话说，如果xxxsgd的结构域3以残基编号n结束，则结构域4以残基n 1开始，其中n是整数。
[0169]
如本文所用，术语“结构域1”是指与seq id no:24的位置1至115的氨基酸对应的一个或多个连续的氨基酸基团。
[0170]
如本文所用，术语“结构域2”是指与seq id no:24的位置116至266的氨基酸对应的一个或多个连续的氨基酸基团。
[0171]
如本文所用，术语“结构域3”是指与seq id no:24的位置267至456的氨基酸对应的一个或多个连续的氨基酸基团。
[0172]
如本文所用，术语“结构域4”是指与seq id no:24的位置457至532的氨基酸对应的一个或多个连续的氨基酸基团。
[0173]
如本领域已知的，嵌合sgd的四个结构域可以通过小序列，例如氨基酸接头，来进行连接或分隔。因此应当理解，嵌合sgd可以包含可添加至四个结构域中的每一个的额外氨
基酸，如本领域已知的。
[0174]
在一些实施方案中，嵌合sgd可以被进一步修饰，例如通过引入可以增加蛋白的稳定性或寿命或半衰期的额外结构域，或将嵌合sgd靶向至特定细胞定位的定位结构域(localidation domain)。相关的额外结构域是本领域已知的。
[0175]
如本文所用，非功能性sgd是指不能将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的sgd，而相反，功能性sgd能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。然而，通过将rsesgd的一些结构域引入至非功能性sgd，有可能恢复非功能性sgd的功能，如示例中所示，从而获得功能性嵌合sgd。
[0176]
在一些实施方案中，d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列。所述第一sgd可以是任何sgd，例如功能性或非功能性sgd。优选地，所述第一sgd与seq id no:24的rsesgd具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％的同一性。
[0177]
在一些实施方案中，d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列。所述第二sgd可以是任何sgd，例如功能性或非功能性sgd。优选地，所述第二sgd与seq id no:24的rsesgd具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％的同一性。
[0178]
有趣的是，发明人发现，由seq id no:91的氨基酸序列组成的rsesgd的结构域3(d3)能够挽救非功能性sgd对于将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的无能力(见图9和10)。因此，在优选的实施方案中，嵌合sgd包含4个结构域，其中至少一个包含rsesgd的结构域3或由其组成；这个结构域如seq id no:91所示。
[0179]
因此，在本发明的一些实施方案中，嵌合sgd包含d3，其中所述d3是由seq id no:91或与seq id no:91具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％的同一性的其变体的氨基酸组成的第三氨基酸序列。换言之，所述d3是rsesgd的结构域3的氨基酸序列。
[0180]
在一些实施方案中，d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％的同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列。所述第四sgd可以是任何sgd，例如功能性或非功能性sgd。优选地，所述第四sgd与seq id no:24的rsesgd具有至少70％，例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％的同一性。
[0181]
在一个优选的实施方案中，所述嵌合sgd包含d4，其中所述d4是由seq id no:92或其变体的氨基酸组成的第四氨基酸序列。
[0182]
所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。换言之，所述嵌合sgd可以不是seq id no:24的rsesgd。因此，所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以是相同物种或不同物种的，然而所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以不都对蛇根木是天然的。
[0183]
嵌合sgd的第三结构域包含如上详述的rsesgd的第三结构域或由其组成，并且第一结构域、第二结构域和第四结构域中的至少一个来自不是蛇根木的第二生物体，例如d1、d2或d4中的至少一个来自对选自以下的生物体天然的sgd或其变体：常绿钩吻、尖端赛多孢子菌或萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐
根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997，如上文所述，此处的变体不需要开始即具有功能性，因为它的活性可以被rsesgd的d3结构域挽救。
[0184]
在一些实施方案中，d1、d2和d4中的每一个来自不同的sgd，并且衍生自独立地选自由以下组成的组的不同生物体：尖端赛多孢子菌、萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。在这样的实施方案中，d1、d2和d4中的一个可以是分别如seq id no:89、seq id no:90或seq id no:92中所示的来自rsesgd的d1、d2或d4，或与其具有至少70％同一性或同源性的其变体。
[0185]
在一些实施方案中，d1、d2和d4中的两个来自相同的sgd，且衍生自一个生物体，并且剩下的结构域来自另一个sgd。相关生物体和sgd已描述在上文的“异胡豆苷-o-β-d-葡萄糖苷酶”部分中。例如，d1和d2来自来自第一生物体的一个sgd，且d4来自来自另一个生物体的另一个sgd；或d1和d4来自来自第一生物体的一个sgd，且d2来自来自另一个生物体的另一个sgd；或d2和d4来自来自第一生物体的一个sgd，且d1来自来自另一个生物体的另一个sgd，所述另一个生物体可以是蛇根木。第一生物体和其他生物体可以是独立地选自由以下组成的组的不同生物体：尖端赛多孢子菌、萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。
[0186]
在一些实施方案中，d1、d2和d4全部来自相同生物体的同一sgd，所述相同生物体不是蛇根木。d1、d2和d4可以是对选自由以下组成的组的生物体天然的sgd的d1、d2和d4：尖端赛多孢子菌、萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。
[0187]
因此，在一些实施方案中，第一、第二和第四sgd全部来自同一sgd，其不是rsesgd。在其他的实施方案中，第一和第二sgd来自同一sgd，且第四sgd来自另一个sgd；所述两个sgd中的至少一个不是rsesgd。在其他的实施方案中，第一和第三sgd来自同一sgd，第四sgd来自另一个sgd；所述两个sgd中的至少一个不是rsesgd。在其他的实施方案中，第四和第二sgd来自同一sgd，第四sgd来自另一个sgd；所述两个sgd中的至少一个不是rsesgd。在一些实施方案中，第一、第二和第四sgd全部来自不同的sgd，其中一个可以是rsesgd。
[0188]
在一个实施方案中，嵌合sgd包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:93、seq id no:94、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99或seq id no:108，或与其具有至少90％的同一性或同源性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同一性或同源性的其变体。
[0189]
sgd可以通过引入如下文进一步详述的编码sgd的核酸序列而在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:1相同或与seq id no:1具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至
少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。因此，本发明的微生物或本发明的方法中使用的微生物优选包含至少一个与seq id no:1相同或与seq id no:1具有至少90％同一性的核酸序列。
[0190]
在其他实施方案中，核酸序列与seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106或seq id no:107相同或具有至少90％的同一性，例如与seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106或seq id no:107具有例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0191]
如本领域已知的，在嵌合sgd中使用的xxxsgd的第一结构域不是甲硫氨酸的情况下，技术人员将能够容易地在编码嵌合sgd的核酸序列中引入起始密码子，以确保嵌合sgd的正确翻译。技术人员还将知晓如何引入对应于分隔嵌合sgd中不同结构域的接头的短核酸序列。
[0192]
表达异源sgd或其变体和/或嵌合sgd或其变体的本发明的微生物能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。
[0193]
异胡豆苷向异胡豆苷苷元的转化可以通过本领域已知地直接测量异胡豆苷苷元的量，或者可以如本领域已知地测量异胡豆苷向异胡豆苷苷元的转化的替代量值。由于异胡豆苷苷元具有高反应性，间接测定异胡豆苷苷元可以是优选的。例如，可以使用比色测定来追踪异胡豆苷消耗，如geerlings et al.,2000中所述。也可以通过uv来监测异胡豆苷的消失，如guirimand et al.,2010中所述，或者可以测量细胞中的整体β-葡萄糖苷酶活性，例如通过uv检测合成底物，例如4-甲基伞形基-β-d-葡萄糖苷(guirimand et al.,2010)。
[0194]
因此，为了确定sgd是否能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元，本领域技术人员可以使用任何所述方法，或者可以使用高精度质谱法来检测在培养表达sgd或猜想具有sgd活性的酶的菌株后，培养基中异胡豆苷苷元的准确质量；在培养基中为所述细胞提供异胡豆苷，或者所述细胞经过工程化并且能够合成异胡豆苷。可以在将培养液离心后直接在培养基或沉淀中检测异胡豆苷苷元。或者，可以监测异胡豆苷苷元下游的其他产物，例如四氢鸭脚木碱的存在；此类产物仅在功能性sgd、异胡豆苷和能够使用异胡豆苷苷元的酶的存在下才会形成，如例如stavrinides et al.,2015中所述。
[0195]
异胡豆苷合成酶(str)
[0196]
可以向微生物提供异胡豆苷，例如作为细胞在其中孵育的培养基的一部分。然而，在一些实施方案中，微生物经工程化并且能够从断马钱子苷和色胺合成异胡豆苷。
[0197]
因此，在一些实施方案中，微生物表达具有ec编号ec 4.3.3.2的异源异胡豆苷合成酶。此类酶催化断马钱子苷的醛基与色胺的氨基之间的皮克太特-斯彭格勒(pictet-spengler)反应以产生异胡豆苷。
[0198]
因此，表达异源str的微生物能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷。
[0199]
在一些实施方案中，str是对长春花天然的str或其功能性变体，其保留了将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷的能力。因此，在一些实施方案中，str是如seq id no:30中所示的crostr或与seq id no:30具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0200]
因此，在一些实施方案中，微生物表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物表达如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物表达如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物表达如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0201]
str可以通过引入如下文进一步详述的编码str的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:7相同或具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0202]
四氢鸭脚木碱合成酶、异育亨宾碱合成酶
[0203]
除了上述之外，还可以对微生物进行进一步工程化，从而其能够产生四氢鸭脚木碱。
[0204]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str，并且进一步表达非天然存在于细胞中的异源四氢鸭脚木碱合成酶(thas)。四氢鸭脚木碱合成酶的具有ec编号ec 1.-.-.-并催化异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱。因此，当表达thas时，微生物能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱，从而产生四氢鸭脚木碱。
[0205]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str，并且进一步表达不天然存在于细胞中的异育亨宾碱合成酶(hys)。杂育亨宾碱合成酶具有ec编号ec 1.-.-.-并催化异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱、阿吗碱(ajmalicine)或mayumbine。因此，当表达hys时，微生物能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱、阿吗碱或mayumbine，从而产生四氢鸭脚木碱。
[0206]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str，并且进一步表达thas和hys。
[0207]
在优选的实施方案中，thas是对长春花天然的thas或其功能性变体，其保留了将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱的能力。因此，在一些实施方案中，thas是如seq id no:28中所示的crothas或与seq id no:28具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0208]
thas可以通过引入如下文进一步详述的编码thas的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:5相同或与seq id no:5具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0209]
在其他优选的实施方案中，hys是对长春花天然的hys或其功能性变，其保留了将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱、阿吗碱或mayumbine的能力。因此，在一些实施方案中，hys是如seq id no:46中所示的crohys或与seq id no:46具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0210]
hys可以通过引入如下文进一步详述的编码hys的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:23相同或与seq id no:23具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0211]
在一些实施方案中，微生物表达crohys和/或crothas或与seq id no:46和/或seq id no:28具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0212]
表达thas和/或hys的微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0213]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0214]
sarpargan桥酶(sarpargan bridge enzyme，sbe)
[0215]
除了上述之外，可以将微生物进一步工程化，从而其能够产生异育亨宾碱，尤其是鸭脚木碱(alstonine)和蛇根碱(serpentine)。异育亨宾碱是单萜吲哚生物碱的一个普遍亚类，其发现于许多植物物种中，主要来自夹竹桃科(apocynaceae)和茜草科(rubiaceae)。异育亨宾碱的示例包括α1-肾上腺素能受体拮抗剂阿吗碱和苯二氮卓受体配体mayumbine(19-表阿吗碱(19-epi-ajmalicine))。氧化的β-咔啉异育亨宾碱也表现出强力的药理活性：蛇根碱已显示出拓扑异构酶抑制活性，且鸭脚木碱已显示出与5-ht2a/c受体相互作用，
并且可作为抗精神病药。此外，异育亨宾碱是许多羟吲哚生物碱(oxindole alkaloid)的生物合成前体，其也显示出广范围的生物活性。
[0216]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str，并且进一步表达非天然存在于细胞中的异源sarpargan桥酶(sbe)。该酶具有ec编号ec1.14.14.-并催化四氢鸭脚木碱和阿吗碱分别转化为相应的鸭脚木碱和蛇根碱，或通过环化将异胡豆苷衍生的缝籽木嗪转化为sarpargan生物碱阿枯米定碱醛(sarpagan alkaloid polyneuridine aldehyde)。因此，当表达sbe时，微生物能够将四氢鸭脚木碱转化为鸭脚木碱和蛇根碱。在细胞能够产生阿吗碱的实施方案中，当表达sbe时，微生物能够将四氢鸭脚木碱和阿吗碱转化为鸭脚木碱和蛇根碱。
[0217]
在优选的实施方案中，sbe是对常绿钩吻天然的sbe或其功能性变体，其保留了将四氢鸭脚木碱和阿吗碱转化为鸭脚木碱和蛇根碱的能力。因此，在一些实施方案中，sbe是如seq id no:29中所示的gsesbe或与seq id no:29具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0218]
sbe可以通过引入如下文进一步详述的编码sbe的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:6相同或与seq id no:6具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0219]
微生物还表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0220]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0221]
微生物还可以表达如本文所述的thas和/或hys，具体地，微生物表达crohys和/或crothas或与seq id no:46和seq id no:28具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0222]
nadph-细胞色素p450还原酶、细胞色素b5和缝籽木嗪合成酶
[0223]
可以将微生物进一步工程化，从而其能够产生19e-缝籽木嗪(19e-geissoschizine)。
[0224]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str，并且进一步表达非天然存在于微生物中的异源nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(cpr)、异源细胞色素b5(cyb5)和异源缝籽木嗪合成酶。nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶具有ec编号ec 1.6.2.4，并且是从nadp到细胞色素p450的电子转移所必需的。细胞色素b5具有ec编号ec 1.6.2.2，并且是作为电子载体起作用的膜结合血红素蛋白。缝籽木嗪合成酶具有ec编号ec 1.3.1.36，并且催化异胡豆苷苷元
还原为19e-缝籽木嗪。在表达cpr、cyb5和gs时微生物因此能够将异胡豆苷苷元转化为19e-缝籽木嗪，从而产生19e-缝籽木嗪。
[0225]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str并且进一步表达cpr、cyb5和gs。
[0226]
在优选的实施方案中，cpr是对长春花天然的cpr或其功能性变体，其保留了将电子从nadp转移至细胞色素p450的能力。因此，在一些实施方案中，cpr是如seq id no:31中所示的crocpr或与seq id no:31具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0227]
cpr可以通过引入如下文进一步详述的编码cpr的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:8相同或与seq id no:8具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0228]
在优选的实施方案中，cyb5是对长春花天然的cyb5或其功能性变体，其保留了作为电子载体起作用的能力。因此，在一些实施方案中，cyb5是如seq id no:32中所示的crocyb5或与seq id no:32具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0229]
cyb5可以通过引入如下文进一步详述的编码cyb5的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:9相同或与seq id no:9具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0230]
在优选的实施方案中，gs是对长春花天然的gs或其功能性变体，其保留了催化异胡豆苷苷元还原为19e-缝籽木嗪的能力。因此，在一些实施方案中，gs是如seq id no:33中所示的crogs或与seq id no:33具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0231]
gs可以通过引入如下文进一步详述的编码gs的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:10相同或与seq id no:10具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0232]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0233]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0234]
缝籽木嗪氧化酶、redox1和redox2
[0235]
可以将微生物进一步工程化，从而其能够产生花冠木碱(stemmadenine)。微生物可以如上文所述。在一些实施方案中，微生物是酵母细胞。在其他实施方案中，微生物是细菌细胞。
[0236]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5和gs，并且进一步表达不天然存在于细胞中的缝籽木嗪氧化酶(go)、redox1和redox2。缝籽木嗪氧化酶具有ec编号ec 1.14.14.-并催化19e-缝籽木嗪的氧化产生短寿命mia不稳定中间体，所述中间体可以被redox1和redox2氧化以产生花冠木碱和16s/r-去羟甲基花冠木碱(16s/r-deshydroxymethylstemmadenine，16s/r-dhs)或通过自发转化为阿枯米辛碱(akuammicine)。redox1具有ec编号ec 1.14.14.-并且催化两个氧化步骤中的第一个，其将由缝籽木嗪氧化酶(go)导致的19e-缝籽木嗪的氧化产生的不稳定产物转化为花冠木碱。redox2具有ec编号ec 1.7.1.-并催化两个氧化步骤中的第二个，其将由缝籽木嗪氧化酶(go)导致的19e-缝籽木嗪的氧化产生的不稳定产物转化为花冠木碱。微生物在表达go、redox1和redox2时因此能够将19e-缝籽木嗪转化为花冠木碱，从而产生19e-花冠木碱。
[0237]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5和gs，并且进一步表达go、redox1和redox2。
[0238]
在优选的实施方案中，go是对长春花天然的go或其功能性变体，其保留了催化19e-缝籽木嗪的氧化以产生短寿命mia不稳定中间体的能力，所述中间体可以被redox1和redox2氧化以产生花冠木碱。因此，在一些实施方案中，go是如seq id no:34中所示的crogo或与seq id no:34具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0239]
go可以通过引入如下文进一步详述的编码go的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:11相同或与seq id no:11具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0240]
在优选的实施方案中，redox1是对长春花天然的redox1或其功能性变体，其保留了催化两个氧化步骤中的第一个的能力，该步骤将由缝籽木嗪氧化酶(go)导致的19e-缝籽木嗪的氧化产生的不稳定产物转化为花冠木碱。因此，在一些实施方案中，redox1是如seq id no:35中所示的croredox1或与seq id no:35具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0241]
可以通过引入如下文进一步详述的编码redox1的核酸序列在微生物中表达redox1。具体地，核酸序列与seq id no:12相同或与seq id no:12具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0242]
在优选的实施方案中，redox2是对长春花天然的redox2或其功能性变体，其保留了催化两个氧化步骤中的第二个的能力，所述步骤将由缝籽木嗪氧化酶(go)导致的19e-缝籽木嗪的氧化产生的不稳定产物转化为花冠木碱。因此，在一些实施方案中，redox2是如
seq id no:36中所示的croredox2或与seq id no:36具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0243]
可以通过引入如下文进一步详述的编码redox2的核酸序列在微生物中表达redox2。具体地，核酸序列与seq id no:13相同或与seq id no:13具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0244]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0245]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0246]
花冠木碱o-乙酰转移酶(stemmadenine o-acetyltransferase)
[0247]
可以将微生物进一步工程化从而其能够产生o-乙酰花冠木碱(o-acetylstemmadenine)。
[0248]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1和redox2，并且进一步表达非天然存在于细胞中的花冠木碱o-乙酰转移酶。花冠木碱o-乙酰转移酶具有ec编号ec 1.7.1.-并催化花冠木碱乙酰化为o-乙酰花冠木碱。因此，微生物在表达sat时能够将花冠木碱转化为o-乙酰花冠木碱，从而产生o-乙酰花冠木碱。
[0249]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1和redox2，并且进一步表达sat。
[0250]
在优选的实施方案中，sat是对长春花天然的sat或其功能性变体，其保留了将花冠木碱转化为o-乙酰花冠木碱的能力。因此，在一些实施方案中，sat是如seq id no:37中所示的crosat或与seq id no:37具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0251]
sat可以通过引入如下详述的编码sat的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:14相同或与seq id no:14具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0252]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0253]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表
达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0254]
o-乙酰花冠木碱氧化酶
[0255]
可以将微生物进一步工程化从而其能够生产二氢前骨节心蛤碱乙酸酯(dihydroprecondylocarpine acetate)。
[0256]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2和sat，并且进一步表达不天然存在于细胞中的o-乙酰花冠木碱氧化酶(pas)。o-乙酰花冠木碱氧化酶具有ec编号ec 1.21.3.-并将o-乙酰花冠木碱转化为前骨节心蛤碱乙酸酯(precondylocarpine acetate)。因此，微生物在表达pas时能够将o-乙酰花冠木碱转化为前骨节心蛤碱乙酸酯，从而产生前骨节心蛤碱乙酸酯。
[0257]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2和sat，并且进一步表达pas。
[0258]
在优选的实施方案中，pas是对长春花天然的pas或其功能性变体，其保留了将o-乙酰花冠木碱转化为前骨节心蛤碱乙酸酯的能力。因此，在一些实施方案中，pas是如seq id no:38中所示的cropas或与seq id no:38具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0259]
可以通过引入如下文进一步详述的编码pas的核酸序列在微生物中表达pas。具体地，核酸序列与seq id no:15相同或与seq id no:15具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0260]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0261]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0262]
脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶(dehydroprecondylocarpine acetate synthase)
[0263]
可以将微生物进一步工程化从而其能够生产二氢前骨节心蛤碱乙酸酯。
[0264]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2、sat和pas，并且进一步表达不天然存在于细胞中的二氢前骨节心蛤碱乙酸酯(dpas)。二氢前骨节心蛤碱乙酸酯具有ec编号ec 1.1.1.-并且将前骨节心蛤碱乙酸酯转化为二氢前骨节心蛤碱乙酸酯。因此，微生物在表达dpas时能够将前骨节心蛤碱乙酸酯转化
为二氢前骨节心蛤碱乙酸酯，从而产生二氢前骨节心蛤碱乙酸酯。
[0265]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2、sat和pas，并且进一步表达dpas。
[0266]
在优选的实施方案中，dpas是对长春花天然的dpas或其功能性变体，其保留了将前骨节心蛤碱乙酸酯转化为二氢前骨节心蛤碱乙酸酯的能力。因此，在一些实施方案中，dpas是如seq id no:39中所示的crodpas或与seq id no:39具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0267]
dpas可以通过引入如下文进一步详述的编码dpas的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:16相同或与seq id no:16具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0268]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0269]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0270]
水甘草碱合成酶
[0271]
可以将微生物进一步工程化从而其能够产生水甘草碱。
[0272]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2、sat、pas和dpas，并且进一步表达非天然存在于细胞中的水甘草碱合成酶(ts)。水甘草碱合成酶具有ec编号ec 4.-.-.-并将二氢前骨节心蛤碱乙酸酯转化为水甘草碱。因此，微生物在表达ts时能够将二氢前骨节心蛤碱乙酸酯转化为水甘草碱，从而产生水甘草碱。
[0273]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2、sat、pas和dpas，并且进一步表达ts。
[0274]
在优选的实施方案中，ts是对长春花天然的ts或其功能性变体，其保留了将二氢前骨节心蛤碱乙酸酯转化为水甘草碱的能力。因此，在一些实施方案中，ts是如seq id no:40中所示的crots或与seq id no:40具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0275]
ts可以通过引入如下文进一步详述的编码ts的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:17相同或与seq id no:17具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0276]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0277]
细胞还可以进一步表达如本文所述的std，尤其是如seq id no:30中所示的crostr或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0278]
长春质碱合成酶(catharanthine synthase)
[0279]
可以将微生物进一步工程化从而其能够产生长春质碱。
[0280]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2、sat、pas和dpas，并且进一步表达非天然存在于细胞中的长春质碱合成酶(cs)。长春质碱合成酶具有ec编号ec 4.-.-.-并将二氢前骨节心蛤碱乙酸酯转化为长春质碱。因此，微生物在表达cs时能够将二氢前骨节心蛤碱乙酸酯转化为长春质碱，从而产生长春质碱。
[0281]
在一些实施方案中，微生物表达sgd和任选的str、cpr、cyb5、gs、go、redox1、redox2、sat、pas和dpas，并进一步表达cs。任选地，微生物还表达ts。
[0282]
在优选的实施方案中，cs是对长春花天然的cs或其功能性变体，其保留了将二氢前骨节心蛤碱乙酸酯转化为长春质碱的能力。因此，在一些实施方案中，cs是如seq id no:41中所示的crocs或与seq id no:41具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0283]
cs可以通过引入如下文进一步详述的编码cs的核酸序列在微生物中表达。具体地，核酸序列与seq id no:18相同或与seq id no:18具有至少90％的同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0284]
微生物进一步表达如本文所述的sgd，尤其是如seq id no:24中所示的rsesgd、如seq id no:25中所示的gsesgd、如seq id no:26中所示的sapsgd或如seq id no:27中所示的rvesgd，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0285]
细胞还可以进一步表达如本文所述的str，尤其是如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。在一些实施方案中，微生物因此也表达如seq id no:24中所示的rsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:25中所示的gsesgd和如seq id no:30中所示的crostr；如seq id no:26中所示的sapsgd和如seq id no:30中所示的crostr；或如seq id no:27中所示的rvesgd和如seq id no:30中所示的crostr，或与其具有至少90％同一性的其功能性变体。
[0286]
一种生产异胡豆苷苷元和单萜吲哚生物碱的方法
[0287]
本文所述的微生物可用作生产植物化合物，尤其是异胡豆苷苷元和单萜吲哚生物碱(mia)的平台。
[0288]
本文提供了一种在微生物中生产异胡豆苷苷元的方法，所述方法包括以下步骤：
[0289]
a)提供微生物，所述细胞表达：
[0290]
异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)，其能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元；
[0291]
b)在包含异胡豆苷或可被所述微生物转化为异胡豆苷的底物的培养基中，培养所述微生物；
[0292]
c)任选地，回收异胡豆苷苷元；
[0293]
d)任选地，进一步将异胡豆苷苷元转化为单萜吲哚生物碱。
[0294]
微生物可以如上文所述。因此，微生物可以是任何微生物。
[0295]
因此，在一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母、真菌、原生动物、藻类和病毒组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母、真菌、原生动物和藻类组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母、真菌和藻类组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自由细菌、古细菌、酵母和真菌组成的组。在另一个实施方案中，微生物选自细菌、酵母和真菌。在另一个实施方案中，微生物选自细菌或酵母。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌或酵母。
[0296]
在一些实施例中，微生物是细菌。在一个实施例中，所述细菌的属选自埃希氏菌(escherichia)、棒状杆菌(corynebacterium)、假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、乳球菌(lactococcus)、乳杆菌(lactobacillus)、盐单胞菌(halomonas)、双歧杆菌(bifidobacterium)和肠球菌(enterococcus)。在优选的实施方案中，所述细菌的属是埃希氏菌属。在另一个实施方案中，微生物可以选自由以下组成的组：埃希氏菌(escherichia)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、lactococcus bacillus、halomonas elongate、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)和粪肠球菌(enterococcus faecali)。在优选的实施方案中，微生物是埃希氏菌。
[0297]
在一些实施方案中，微生物是酵母。在一些实施方案中，微生物是来自gras(一般公认为安全)生物体或非致病性生物体或菌株的细胞。在一些实施方案中，所示酵母的属选自酵母菌(saccharomyces)、毕赤酵母(pichia)、耶氏酵母(yarrowia)、克鲁维酵母(kluyveromyces)、假丝酵母(candida)、红酵母(rhodotorula)、红冬孢酵母(rhodosporidium)、隐球菌(cryptococcus)、毛孢子菌(trichosporon)和油脂酵母(lipomyces)。在优选的实施方案中，所述酵母的属是酵母菌。
[0298]
微生物可选自由以下组成的组：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、白色隐球菌(cryptococcus albidus)、lipomyces lipofera、斯达氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(rhodotorula glutinis)、trichosporon pullulan和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)。在优选的实施方案中，微生物是酿酒酵母细胞。
[0299]
在所述方法的一些实施方案中，细胞中产生的异胡豆苷苷元可以进一步转化为单萜吲哚生物碱。本文中的术语“进一步转化”简单意指将产生的异胡豆苷苷元转换或转化为萜吲哚生物碱的另一种化合物。转化可以在体内发生，即在细胞内发生，这可以能够催化异胡豆苷苷元进一步转化为其他化合物。然而，所述方法还可以包括通过本领域已知的方法
从微生物或从培养基中回收异胡豆苷苷元的步骤，并且然后将异胡豆苷苷元转化为单萜吲哚生物碱，即进一步转化可以是离体转化。
[0300]
优选地，微生物表达如本文所述的sgd；sgd可以是如上文所述的异源sgd或嵌合sgd。在优选的实施方案中，sgd选自rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，以及与其具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其功能性变体。
[0301]
微生物可以是本文所述的任何微生物。因此，在一些实施方案中，微生物表达如“异胡豆苷-o-β-葡萄糖苷酶(sgd)”部分所述的sgd，并且能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。在一些实施方案中，sgd是如“异源sgd或其变体”部分中所述的异源sgd。在一些实施方案中，sgd是如“嵌合sgd或其变体”部分中所述的嵌合sgd。嵌合sgd如上所述并且包含具有以下通式的氨基酸序列
[0302]d1-d
2-d
3-d4[0303]
其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
[0304]
其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
[0305]
其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
[0306]
其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
[0307]
其中，所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
[0308]
微生物还可以表达如“异胡豆苷合成酶(str)”部分中所述的str，并且因此可能以能够从断马钱子苷和色胺合成异胡豆苷。优选地，向细胞提供断马钱子苷和色胺，例如，在培养基中；在这样的实施方案中，培养基不需要包含异胡豆苷。在其他实施方案中，尤其是在微生物不能合成异胡豆苷的情况下，将异胡豆苷作为培养基的一部分提供给微生物。
[0309]
可以将微生物进一步工程化以产生如“四氢鸭脚木碱合成酶、异育亨宾碱合成酶”部分中所述的四氢鸭脚木碱。例如，微生物可以表达异源thas和/或异源hys。
[0310]
可以将微生物进一步工程化以产生异育亨宾碱，尤其是鸭脚木碱和蛇根碱，如“sarpargan桥酶(sbe)”部分中所述。例如，微生物可以表达异源sarpargan桥酶(sbe)。
[0311]
可以将微生物进一步工程化以产生本文所述的水甘草碱和/或长春质碱。具体地，可以将微生物进一步工程化以合成19e-缝籽木嗪，如“nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶、细胞色素b5和缝籽木嗪合成酶”部分所述。例如，微生物可以表达异源nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(cpr)、异源细胞色素b5(cyb5)和异源缝籽木嗪合成酶(gs)。可以将微生物进一步工程
化从而使其能够合成花冠木碱，如“缝籽木嗪氧化酶、redox1和redox2”部分中所述。例如，微生物可以表达go、redox1和redox2。可以将微生物进一步工程化从而使其能够合成o-乙酰花冠木碱，如“花冠木碱o-乙酰转移酶”部分中所述。例如，微生物可以表达sat。可以将微生物进一步工程化从而使其能够合成二氢前骨节心蛤碱乙酸酯，如“o-乙酰花冠木碱氧化酶”部分中所述。例如，微生物可以表达pas。可以将微生物进一步工程化从而使其能够产生二氢前骨节心蛤碱乙酸酯，如“脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶”部分中所述。例如，微生物可以表达dpas。可以将微生物进一步工程化从而使其能够产生水甘草碱，如“水甘草碱合成酶”部分中所述。例如，微生物表达ts。可以将微生物进一步工程化从而使其能够产生长春质碱，如“长春质碱合成酶”部分中所述。例如，微生物可以表达cs。
[0312]
因此，微生物可以是如上所述的，并且可以产生以下的一种或多种：
[0313]
·
异胡豆苷
[0314]
·
异胡豆苷苷元
[0315]
·
四氢鸭脚木碱
[0316]
·
鸭脚木碱
[0317]
·
水甘草碱
[0318]
·
长春质碱
[0319]
每种产物所需的底物可以作为用于细胞生长的培养基的一部分提供给细胞。或者，用于上述每种产物的底物可由细胞自身合成。在所有情况下，微生物都能够合成异胡豆苷苷元。
[0320]
如果需要，可以通过本领域已知的方法从培养基中回收上述每种产物。
[0321]
因此，所述方法可以包括回收以下的一种或多种的步骤：
[0322]
·
异胡豆苷
[0323]
·
异胡豆苷苷元
[0324]
·
四氢鸭脚木碱
[0325]
·
鸭脚木碱
[0326]
·
水甘草碱
[0327]
·
长春质碱
[0328]
在一些实施方案中，培养基包含底物异胡豆苷。微生物可以将所述异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元，如上文所详述。
[0329]
在一些实施方案中，培养基包含异胡豆苷，其浓度为至少0.05mm，例如至少0.1mm，例如至少0.5mm，例如至少1mm。
[0330]
在其他实施方案中，培养基包含色胺和断马钱子苷，优选其浓度为至少0.05mm，例如至少0.1mm，例如至少0.5mm，例如至少1mm。
[0331]
本发明还涉及在微生物中生产吲哚生物碱(mia)的方法。
[0332]
因此，本文提供了一种在微生物中生产单萜吲哚生物碱(mia)的方法，所述方法包括以下步骤：
[0333]
i)提供能够将异胡豆苷转化为水甘草碱和/或长春质碱的微生物，所述细胞表达：
[0334]
异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)；
[0335]
nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(cpr)；
[0336]
细胞色素b5(cyb5)；
[0337]
缝籽木嗪合成酶(gs)；
[0338]
缝籽木嗪氧化酶(go)；
[0339]
redox1；
[0340]
redox2；
[0341]
花冠木碱o-乙酰转移酶(sat)；
[0342]
o-乙酰基花冠木碱氧化酶(pas)；
[0343]
脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶(dpas)；
[0344]
水甘草碱合成酶(ts)；和/或
[0345]
长春质碱合成酶(cs)，
[0346]
ii)在包含异胡豆苷或可被所述微生物转化为异胡豆苷的底物的培养基中，培养所述微生物；
[0347]
iii)任选地，回收mia；
[0348]
iv)任选地，将mia加工成药物化合物，
[0349]
其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
[0350]
和/或；
[0351]
其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
[0352]d1-d
2-d
3-d4[0353]
其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
[0354]
其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
[0355]
其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
[0356]
其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
[0357]
其中所述第一sgd、第二sgd和第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、第二sgd和第四sgd不都是rsesgd。
[0358]
微生物可任选地进一步表达异胡豆苷合成酶(str)。
[0359]
能够产生单萜吲哚生物碱(mia)的微生物可以是如本文“具体实施方式”部分中所述的任何微生物。
[0360]
滴度(titer)
[0361]
本文所公开的微生物和方法可用于生产高滴度的不同植物衍生的化合物。因此可以获得总滴度为至少0.1μm，例如至少0.5μm、例如至少1μm、例如至少2μm、例如至少3μm、例如至少4μm、例如至少5μm、例如至少6μm、例如至少7μm、例如至少8μm、例如至少9μm、例如至少10μm、例如至少11μm、例如至少12μm、例如至少13μm、例如至少14μm、例如至少15μm、例如至少20μm、例如至少25μm、例如至少30μm、例如至少35μm、例如至少40μm、例如至少50μm或更多的异胡豆苷苷元，其中总滴度是细胞内异胡豆苷苷元滴度和细胞外异胡豆苷苷元的总和。事实上，产生的异胡豆苷苷元可以从细胞中分泌-细胞外异胡豆苷苷元-或者它可以保留在细胞中-细胞内异胡豆苷苷元。
[0362]
微生物可以能够产生滴度为至少0.1μm，例如至少0.5μm、例如至少1μm、例如至少2μm、例如至少3μm、例如至少4μm、例如至少5μm、例如至少6μm、例如至少7μm、例如至少8μm、例如至少9μm、例如至少10μm、例如至少11μm、例如至少12μm、例如至少13μm、例如至少14μm、例如至少15μm、例如至少20μm、例如至少25μm、例如至少30μm、例如至少35μm、例如至少40μm、例如至少50μm或更多的细胞外异胡豆苷苷元。
[0363]
微生物可以能够产生滴度为至少0.1μm，例如至少0.5μm、例如至少1μm、例如至少2μm、例如至少3μm、例如至少4μm、例如至少5μm、例如至少6μm、例如至少7μm、例如至少8μm、例如至少9μm、例如至少10μm、例如至少11μm、例如至少12μm、例如至少13μm、例如至少14μm、例如至少15μm、例如至少20μm、例如至少25μm、例如至少30μm、例如至少35μm、例如至少40μm、例如至少50μm或更多的细胞内异胡豆苷苷元。
[0364]
确定异胡豆苷苷元滴度的方法是本领域已知的。例如，可以将细胞裂解并通过orbitrap fusion tribid ms(参见实施例5)测定滴度，以确定细胞内或分泌的异胡豆苷苷元滴度。滴度也可以通过orbitrap fusion tribid ms在已去除细胞的上清液级分中测定。
[0365]
微生物可以能够产生滴度为至少1μm，例如至少2μm、例如至少4μm、例如至少6μm、例如至少8μm、例如至少10μm或更多的四氢鸭脚木碱。
[0366]
微生物可以能够产生滴度为至少0.1μm，例如至少0.5μm、例如至少1μm、例如至少2μm、例如至少3μm、例如至少4μm、例如至少5μm、例如至少6μm、例如至少7μm、例如至少8μm、例如至少9μm、例如至少10μm、例如至少11μm、例如至少12μm、例如至少13μm、例如至少14μm、例如至少15μm、例如至少20μm或更多的鸭脚木碱。
[0367]
微生物可以能够产生滴度为至少0.01μm，例如至少0.02μm、例如至少0.5μm、例如至少1μm、例如至少2μm、例如至少3μm、例如至少4μm、例如至少5μm、例如至少6μm、例如至少7μm、例如至少8μm、例如至少9μm、例如至少10μm、例如至少11μm、例如至少12μm、例如至少13μm、例如至少14μm、例如至少15μm、例如至少20μm或更多的水甘草碱。
[0368]
微生物可以能够产生滴度为至少0.01μm，例如至少0.02μm、例如至少0.5μm、例如至少1μm、例如至少2μm、例如至少3μm、例如至少4μm、例如至少5μm、例如至少6μm、例如至少7μm、例如至少8μm、例如至少9μm、例如至少10μm、例如至少11μm、例如至少12μm、例如至少13μm、例如至少14μm、例如至少15μm、例如至少20μm或更多的长春质碱。
[0369]
核酸、载体和宿主细胞
[0370]
本文还公开了用于构建如上所述的微生物或通常可用于本文所述的方法中的有用的核酸构建体。此类核酸构建体编码可用于构建本发明的微生物的异源酶。
[0371]
应当理解，术语“核酸构建体”可以指包含相关核酸序列的一个核酸分子或多个核酸分子。因此，核酸构建体可以是一个核酸分子，其可以编码多种酶，或者它可以是多个核酸分子，每个均包含一个编码酶的序列。相关核酸序列因此可以包含在一个载体或多个载体上。它们也可以整合在基因组中，在一条染色体上，或甚至一起在一个位置上，或者它们可整合在不同的染色体上。也可能在一个或多个载体上有一些序列，并且有一些整合到基因组中。
[0372]
本文还提供了核酸构建体，其包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106或seq id no:107相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的核酸序列。因此，本发明的微生物或用于本发明的方法中的微生物优选包含至少一个与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106或seq id no:107相同或具有至少90％同一性的核酸序列。优选地，核酸与seq id no:1相同或具有至少90％的同一性。
[0373]
如本领域已知的，在嵌合sgd中使用的xxxsgd的第一结构域不是甲硫氨酸的情况下，技术人员将能够容易地在编码嵌合sgd的核酸序列中引入起始密码子，以确保嵌合sgd的正确翻译。技术人员还将知道如何引入对应于分离嵌合sgd中不同结构域的接头的短核酸序列。
[0374]
核酸构建体可进一步包含与seq id no:7相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的核酸序列。
[0375]
核酸构建体可进一步包含与seq id no:5和/或seq id no:23相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的序列。
[0376]
核酸构建体可进一步包含与seq id no:6相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的核酸序列。
[0377]
核酸构建体可进一步包含与seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和/或seq id no:18相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至
少99％、例如100％的同一性的核酸序列。
[0378]
如本领域已知的，所有核酸序列可能已经针对在微生物中的表达进行了密码子优化。
[0379]
利用诱导型启动子可以是感兴趣的。因此，在一些实施方案中，核酸构建体包含在诱导型启动子控制下的一个或多个上述核酸序列。这允许更多地控制由所述序列编码的酶在何时实际表达，并且在例如如果植物化合物的其中一种的产生对细胞生长产生负面影响时可以是有利的。技术人员在鉴定合适的诱导型启动子方面将没有困难。
[0380]
在一些实施方案中，核酸构建体是一种或多种载体，例如整合型(integrative)或复制型(replicative)载体。合适的载体是本领域已知的并且技术人员容易获得。
[0381]
本文还提供了包含一种或多种上述核酸序列，尤其是seq id no:1或与其具有至少90％同一性的序列的载体。载体可以进一步包含任意以下：seq id no:7、seq id no:5、seq id no:23、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和/或seq id no:18或与其具有至少90％同一性的序列。
[0382]
本文还提供了包含以下的宿主细胞：一种或多种如上文所定义的核酸序列或载体，尤其是seq id no:1或与其具有至少90％同一性的序列，或包含seq id no:1或与其具有至少90％同一性的序列，以及seq id no:7、seq id no:5、seq id no:23、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和/或seq id no:18或与其具有至少90％同一性的序列中的一个或多个。
[0383]
宿主细胞可以是任何宿主细胞，例如原代细胞或来自细胞系的细胞。在优选的实施方案中，宿主细胞来自哺乳动物或人细胞系。宿主细胞可以是原核生物或真核生物。在一个优选的实施方案中，细胞是真核生物。
[0384]
本发明的宿主细胞可以包含在宿主生物体，例如动物中。
[0385]
本文还提供了本文所述的核酸构建体、微生物、载体或宿主细胞用于在微生物中生产异胡豆苷苷元和/或四氢鸭脚木碱、鸭脚木碱、水甘草碱和/或长春质碱的用途。在一些实施方案中，本文所述的核酸构建体、微生物、载体或宿主细胞用于在本文所述的微生物中生产异胡豆苷苷元和/或四氢鸭脚木碱、鸭脚木碱、水甘草碱和/或长春质碱的方法中。
[0386]
药物化合物
[0387]
通过本方法可获得的植物化合物可用于制造药物化合物。因此，所述方法可以进一步包括从由本发明的微生物产生的任何化合物，尤其是单萜吲哚生物碱，来产生药物化合物的步骤。
[0388]
因此，还提供了治疗例如癌症、心律失常、疟疾、精神病、高血压、抑郁症、阿尔茨海默病、成瘾和/或神经元疾病等病症的方法，包括施用治疗足量的通过本文所述的方法获得的mia或药物化合物。
[0389]
序列
[0390]
表1
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
[0395]
[0396]
[0397]
[0398]
[0399]
[0400]
[0401]
[0402]
[0403]
[0404]
[0405]
[0406]
[0407]
[0408]
[0409][0410]
实施例
[0411]
菌株
[0412]
开发了不同的菌株来验证rsesgd在异胡豆苷苷元和所选mia的生产中的功能化。
[0413]
表2
[0414]
[0415]
[0416]
[0417]
[0418]
[0419]
[0420]
[0421]
[0422]
[0423]
[0424]
[0425]
[0426]
[0427]
[0428][0429]
实施例1
[0430]
user骨架的构建
[0431]
所有user载体均基于pcfb2315(prs413-his)来构建，通过限制性内切酶xhoi和saci(thermo-fisher fastdigest
tm
)来线性化。所有终止子均是使用侧翼是xhoi和saci限制性位点的引物从cen.pk113-7d基因组扩增的。将包含ccdb反选择标记的dna盒(steyaert j.et al.1993)插入所有user载体中，以确保高克隆效率。
[0432]
质粒的user组装
[0433]
所有质粒均使用user方法(jensen nb et al.2013)构建。植物基因的生物砖(biobrick)从合成gblock(integrated dna technologies and twist biosciences)扩增，经密码子优化以在酵母宿主中表达。启动子的生物砖从酵母cen.pk113-7d基因组扩增。
[0434]
菌株的构建
[0435]
所有菌株均使用t.et al.2015中描述的crispr-cas9方法来构建。
[0436]
实施例2
[0437]
表明crosgd在酵母中不起作用
[0438]
geerlings et al.(geerlings,a.,2000和wo 00/42200)最初从长春花cdna文库中分离出一个全长cdna克隆，其在体外试验中产生sgd活性。
[0439]
为了确认crosgd是否可以在酵母中得到验证和功能化，根据geerlings et al.分别通过使用强糖分解的组成型活性启动子tdh3和tef1来表达crosgd。
[0440]
产生了以下酵母菌株，其含有均来自长春花的sgd和四氢鸭脚木碱(tha)合成酶，即crosgd和crothas。
[0441]
菌株mia-bj(ez-swap，完全crostr)表达以下：
[0442]
·
p1-tdh3-crosgd_nls-p2_tef1-crothas_nls
[0443]
·
p1-tdh3-crosgd_cyt-p2_tef1-crothas_cyt
[0444]
·
p2-tef1-crosgd-5xgs-crothas_nls
[0445]
·
p2-tef1-crothas-5xgs-crosgd_nls
[0446]
·
p2-tef1-crosgd-5xgs-crothas_cyt
[0447]
·
p2-tef1-crothas-5xgs-crosgd_cyt
[0448]
·
p1-tef1-crosgd_nls-p2_pgk1-crothas_nls
[0449]
·
p1-tef1-crosgd_cyt-p2_pgk1-crothas_cyt
[0450]
·
p1-tef1-crosgd_nls-p2_pgk1-crothas_cyt
[0451]
·
p1-tef1-crosgd_cyt-p2_pgk1-crothas_nls
[0452]
从表达crosgd单独和多个带标记且crosgd融合形式的lc-ms分析获得的高分辨率分析结果反驳了geerlings et al.提出的结果是无效的。
[0453]
图1显示了四氢鸭脚木碱(tha)的lc-ms分析。从图1可以看出，表达crosgd的菌株均没有产生可检测量的四氢鸭脚木碱。
[0454]
作为阳性对照，创建了以下菌株，菌株mia-bj(ez-swap,完全crostr)表达：
[0455]
·
p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_nls
[0456]
·
p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_cyt
[0457]
令人惊讶的且与表达crosgd的菌株相反，表达rsesgd的酵母菌株(p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_nls)能够产生四氢鸭脚木碱，从而表明rsesgd在酵母中起作用(图1)。在来自上清液(过滤培养基)和细胞沉淀的样品中均检测到四氢鸭脚木碱。
[0458]
实施例3
[0459]
sgd同源性搜索
[0460]
为了进一步研究并最终实现酵母中关键sgd节点(node)的功能化，针使用crosgd蛋白序列作为查询针对ncbi数据库进行了sgd的同源性搜索。从这次搜索中，选择了来自长春花(crosgd)、蛇根木(rsesgd)、萝芙木(rvesgd)、常绿钩吻(gsesgd)、喜树(cacsgd)、尖端赛多孢子菌(sapsgd)、绒毛钩藤(utosgd)和野生大豆(gsosgd)的八种不同sgd同源物。
[0461]
利用t-coffee web服务器将八个蛋白序列进行比对(图2)。
[0462]
在针对这个测试选择的八种sgd中，已知两种(长春花和蛇根木)在体外具有sgd活性，四种是来自产mia植物(萝芙木、常绿钩吻、喜树和绒毛钩藤)的推定sgd。尖端赛多孢子菌是一种已知会产生其他生物碱的真菌。选择不太可能具有sgd活性的野生大豆作为阴性
对照。见下表3。
[0463]
表3
[0464][0465][0466]
将八种sgd中的每一种与crohys(能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱)基因一同整合到表达crog8h crocyb5 crocpr cro8hgo crois croio crostr crosls cro7dlgt cro7dlh crolamt croadh2的mia-bj菌株中，产生mia-ca-1至mia-ca-8菌株。
[0467]
mia-ca-1:mia-bj菌株 crosgd crohys
[0468]
mia-ca-2:mia-bj菌株 rsesgd crohys
[0469]
mia-ca-3:mia-bj菌株 rvesgd crohys
[0470]
mia-ca-4:mia-bj菌株 gsesgd crohys
[0471]
mia-ca-5:mia-bj菌株 cacsgd crohys
[0472]
mia-ca-6:mia-bj菌株 sapsgd crohys
[0473]
mia-ca-7:mia-bj菌株 utosgd crohys
[0474]
mia-ca-8:mia-bj菌株 gsosgd crohys
[0475]
首先，使所有菌株在150μl ypd中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的合成完全(sc)培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将20μl 250mg/l咖啡因(caffeine)添加至每个样品中作为内标。
[0476]
将样品咖啡因混合物在lc-ms上进行分析，以测量断马钱子苷、异胡豆苷和四氢鸭脚木碱的浓度。
[0477]
表达gsesgd、sapsgd、rvesgd和rsesgd的酵母菌株能够产生四氢鸭脚木碱(图3)。然而，cacsgd、crosgd和utosgd以及它们的对照gssgd不能产生四氢鸭脚木碱。p值表示阴性对照(gsosgd)与cacsgd、crosgd和utosgd中的每一个之间的比较。
[0478]
表达rsesgd的酵母菌株能够产生至少10μm四氢鸭脚木碱。
[0479]
实施例4
[0480]
细胞定位和表达
[0481]
为了了解酵母中crosgd和rsesgd之间的功能差异，对这两种酶进行gfp标记并研究它们的亚细胞定位。对于crosgd和rsesgd，观察到表达水平和定位两者的明显差异。
[0482]
表达gfp-接头-crosgd的酵母细胞表现出crosgd的弱表达，以及crosgd的核定位，而表达gfp-接头-rsesgd的酵母细胞表现出更高的rsesgd表达和与crosgd在植物中的定位相似的超分子定位模式(图4)。
[0483]
实施例5
[0484]
异胡豆苷苷元和异育亨宾碱的生产
[0485]
异胡豆苷苷元和四氢鸭脚木碱
[0486]
将crosgd或rsesgd单独或与crothas组合插入mia-bj菌株(crog8h crocyb5 crocpr cro8hgo crois croio crostr crosls cro7dlgt cro7dlh crolamt croadh2)中，产生mia-bz-1至mia-bz-4菌株：
[0487]
·
mia-bz-1:mia-bj菌株 ptef1-》crosgd-tadh1
[0488]
·
mia-bz-2:mia-bj菌株 ptef1-》rsesgd-tadh1
[0489]
·
mia-bz-3:mia-bj菌株 tcyc1-crothas《-ppgk1-ptef1-》crosgd-tadh1
[0490]
·
mia-bz-4:mia-bj菌株 tcyc1-crothas《-ppgk1-ptef1-》rsesgd-tadh1
[0491]
将酵母菌株mia-bz-1至mia-bz-4以及它们的对照(mia-bj菌株)如下所示地使用96孔深培养板进行分批发酵测试。
[0492]
首先，使所有菌株在150μl ypd中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的合成完全(sc)培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/
水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将20μl 250mg/l咖啡因添加至每个样品中作为内标。
[0493]
通过orbitrap fusion
tm
tribrid
tm
ms测量异胡豆苷苷元。
[0494]
在orbitrap fusion
tm
tribrid
tm
ms(正模式，质量351.1703da)上对异胡豆苷苷元的峰的分析如表4所示。
[0495]
表4
[0496][0497][0498]
这些结果表明，表达rsesgd的酵母菌株能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷苷元。而表达crosgd单独或与crothas组合的酵母菌株则不产生异胡豆苷苷元。这表明rsesgd在酵母中有功能，而crosgd在酵母中没有功能。
[0499]
鸭脚木碱
[0500]
为了进一步探索酵母是否可用作mia生物合成的微生物平台，将rsesgd和crothas与来自常绿钩吻(gsesbe)、长春花(crosbe)或蛇根木(rsesbe)的sapargan桥酶(sbe)共表达，从而能够产生第二异育亨宾碱，即鸭脚木碱。
[0501]
mia-bj(ez-swap，全crostr)菌株表达：
[0502]
·
p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_空载体
[0503]
·
p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_p1-fet1-crosbe
[0504]
·
p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_p1-fet1-rsesbe
[0505]
·
p1-tef1-rsesgd-p2_pgk1-crothas_p1-fet1-gsesbe
[0506]
首先，使所有菌株在150μl ypd中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的合成完全(sc)培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将
20μl 250mg/l咖啡因添加至每个样品中作为内标。
[0507]
将样品咖啡因混合物在lc-ms上进行分析，以测量断马钱子苷、异胡豆苷和四氢鸭脚木碱的浓度。
[0508]
图5中一式三份地显示了酵母细胞工厂中异育亨宾碱鸭脚木碱的生物合成。通过orbitrap fusion
tm
tribrid
tm
ms测量鸭脚木碱。
[0509]
表达rsesgd、crothas和gsesbe的酵母细胞能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷苷元，并且进一步能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱，并且进一步能够将四氢鸭脚木碱转化为鸭脚木碱。这个实施例证实了rsesgd在酵母中有功能。
[0510]
实施例6
[0511]
水甘草碱和长春质碱的产生
[0512]
为了进一步证明酵母中功能化的rsesgd，工程化了从异胡豆苷苷元到水甘草碱和长春质碱(mia-dc)的生物合成途径步骤。
[0513]
菌株mia-dc：
[0514]
crocpr crocyb5 crocpr crocyb5 crostr crogs rsesgd crogo croredoc1 croredox2 crosat cropas crocpas crots crocs
[0515]
将mia-dc和mia-da(对照)菌株如下所示地使用96孔深培养板进行分批发酵测试。
[0516]
首先，使所有菌株在150μl ypd中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的合成完全(sc)培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将20μl 250mg/l咖啡因添加至每个样品中作为内标。
[0517]
通过lc-ms测量了水甘草碱和长春质碱的产生。
[0518]
基于菌株mia-dc中在rsesgd上游的0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的前体饲养(precursor feeding)，检测基于酵母的水甘草碱和长春质碱的产生(图6a-d和7)。
[0519]
实施例7
[0520]
扩展的sgd同源性搜索
[0521]
为了进一步研究并最终实现酵母中关键sgd节点的功能化，使用rsesgd和sapsgd蛋白序列作为查询，针对ncbi数据库和phytometasyn数据库对sgd进行了同源性搜索。从这次搜索中，28种不同的sgd同源物选自以下：蛇根木(rsesgd2)、小蔓长春花(vmisgd1和vmisgd3)、蟾蜍树(telsgd)、胡氏水甘草(ahusgd)、短小蛇根草(opusgd)、蓝果树(nsisgd1和nsisgd2)、阿拉比卡咖啡(carsgd)、吐根(ipesgd)、紫花风铃木(himsgd2和himsgd1)、芝麻(sinsgd)、油橄榄(oeusgd)、中华猕猴桃(achsgd1、achsgd2和achsgd3)、向日葵(hansgd)、莴苣(lsesgd)、牵牛(inisgd)、白屈菜(cmasgd)、豇豆(vunsgd)、木蹄层孔菌(hsusgd)、稻瘟病菌(pgrsgd)、多育孢子虫(lprsgd)、hydnomerulius pinastri md-312(hpisgd)、足马杜拉分枝菌(mmysgd)和moniliophthora roreri mca 2997(mrosgd)。
[0522]
使用t-coffee服务器对28个蛋白序列连同rsesgd、rvesgd、crosgd、gsesgd、cacsgd、utosgd、gsosgd和sapsgd进行比对(图12)。使用clc main workbench 8.0从这个比对中计算成对序列同一性。(图13)
[0523]
在这个测试的28个所选序列中，已知2个(rsesgd2和ipesgd)在体外具有低sgd活
性，7个是推定的β-葡萄糖苷酶或来自产mia植物(小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树)的假定蛋白，1个(oeusgd)是来自油橄榄的橄榄苦苷(oleuropein)β-葡萄糖苷酶，12个是具有来自不产生mia但产生一系列不同糖基化天然产物的植物(阿拉比卡咖啡、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、白屈菜和豇豆)的不同推定活性的推定的β-葡萄糖苷酶。所选序列中的6个是推定的β-葡萄糖苷酶和来自真菌(木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312、足马杜拉分枝菌和moniliophthora roreri mca 2997)的假定蛋白。没有关于任何这些真菌产生的糖基化天然产物的报道。
[0524]
表5
[0525]
[0526]
[0527]
[0528][0529]
将28个sgd和crosgd中的每一个与crohys(能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱)基因整合到表达crog8h vmi8hgo-a ncmlp ncisy crocyb5 crocpr croio crostr crosls cro7dlgt cro7dlh crolamt croadh2 crohys的mia-fa菌株中，产生mia-fc-1至mia-fc-29菌株。包括crosgd作为阴性对照，因为它在实施例2中已显示不能在酵母中将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元。
[0530]
mia-fc-1:mia-fa crosgd
[0531]
mia-fc-2:mia-fa vmisgd1
[0532]
mia-fc-3:mia-fa ahusgd
[0533]
mia-fc-4:mia-fa himsgd2
[0534]
mia-fc-5:mia-fa sinsgd
[0535]
mia-fc-6:mia-fa telsgd
[0536]
mia-fc-7:mia-fa vunsgd
[0537]
mia-fc-8:mia-fa nsisgd1
[0538]
mia-fc-9:mia-fa lprsgd
[0539]
mia-fc-10:mia-fa achsgd1
[0540]
mia-fc-11:mia-fa hsusgd
[0541]
mia-fc-12:mia-fa mrosgd
[0542]
mia-fc-13:mia-fa rsesgd2
[0543]
mia-fc-14:mia-fa pgrsgd
[0544]
mia-fc-15:mia-fa opusgd
[0545]
mia-fc-16:mia-fa hpisgd
[0546]
mia-fc-17:mia-fa hansgd1
[0547]
mia-fc-18:mia-fa achsgd2
[0548]
mia-fc-19:mia-fa himsgd1
[0549]
mia-fc-20:mia-fa ipesgd
[0550]
mia-fc-21:mia-fa lsasgd1
[0551]
mia-fc-22:mia-fa carsgd
[0552]
mia-fc-23:mia-fa oeusgd
[0553]
mia-fc-24:mia-fa achsgd3
[0554]
mia-fc-25:mia-fa cmasgd
[0555]
mia-fc-26:mia-fa mmysgd
[0556]
mia-fc-27:mia-fa vmisgd3
[0557]
mia-fc-28:mia-fa inisgd
[0558]
mia-fc-29:mia-fa nsisgd2
[0559]
首先，使所有菌株在150μl ypd中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的合成完全(sc)培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将20μl 250mg/l咖啡因添加至每个样品中作为内标。
[0560]
将样品咖啡因混合物在lc-ms上进行分析，以测量断马钱子苷和四氢鸭脚木碱的浓度。
[0561]
表达vmisgd1、ahusgd、himsgd2、sinsgd、telsgd、vunsgd、nsisgd1、lprsgd、achsgd1、hsusgd、mrosgd、rsesgd2、pgrsgd、opusgd、hpisgd、hansgd1、achsgd2、himsgd1、ipesgd、lsasgd1和carsgd的酵母菌株能够产生四氢鸭脚木碱，且由此也产生异胡豆苷苷元(图8)，而表达oeusgd、achsgd3、cmasgd、mmysgd、vmisgd3、inisgd和nsisgd2的酵母菌株以及阴性对照crosgd不能产生四氢鸭脚木碱。p值表示阴性对照(crosgd)与oeusgd、achsgd3、cmasgd、mmysgd、vmisgd3、inisgd和nsisgd2中的每一个之间的比较。测试了来自产生mia和不产生mia的植物的更多同源物，但没有一个能够产生四氢鸭脚木碱。
[0562]
实施例8
[0563]
8.1 sgd结构域的表征
[0564]
为了研究哪些序列结构域对酵母中的sgd功能化至关重要，将功能性sgd(rsesgd)
和非功能性sgd(crosgd)的蛋白序列进行比对并分成四个结构域，然后将其重新组装为所有16种可能的组合。在这个实施例中，将rsesgd的结构域称为r，并将crosgd的结构域称为c。两种组合(rrrr-sgd和cccc-sgd)对应于两个野生型蛋白序列(rsesgd和crosgd)。四个结构域的长度为76至203个氨基酸，具有不同的序列同一性(表6)。
[0565]
表6
[0566][0567][0568]
将16个改组的sgd中的每一个通过user融合(geu-flores f et al.2007)克隆到质粒上，并转化到能够表达crog8h vmi8hgo-a ncmlp ncisy crocyb5 crocpr croio crostr crosls cro7dlgt cro7dlh crolamt croadh2 crohys的mia-fa菌株中，产生mia-fd-1至mia-fd-16菌株(表7)。当被喂食色胺和断马钱子苷或断马钱子苷生物合成途径自香叶醇的其他前体时，mia-fa菌株能够合成异胡豆苷，并且当共表达能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的功能性sgd时，也能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱。
[0569]
表7
[0570]
[0571][0572]
首先，使所有菌株在150μl不含组氨酸的完全合成培养基(sc-his)中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的sc-his培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将20μl 250mg/l咖啡因添加至每个样品中作为内标。
[0573]
将样品咖啡因混合物在lc-ms上进行分析，以测量断马钱子苷四氢鸭脚木碱浓度。
[0574]
结果
[0575]
表达crrc-sgd、rrrc-sgd、rcrc-sgd、ccrc-sgd、crrr-sgd、ccrr-sgd、rcrr-sgd和rrrr-sgd的酵母菌株能够产生四氢鸭脚木碱(图9)。所有功能性sgd变体均具有rsesgd结构域3。所有具有crosgd结构域3的sgd变体均不能产生四氢鸭脚木碱。结构域1和结构域2的同一性影响很小或没有影响。在功能性sgd变体中，具有rsesgd结构域3和结构域4的四个序列(crrr-sgd、ccrr-sgd、rcrr-sgd和rrrr-sgd)能够产生最高量的四氢鸭脚木碱。ccrr-sgd是能够比野生型rsesgd(rrrr-sgd)产生更多四氢鸭脚木碱的最佳变体。
fd-22(表9)。当被喂食色胺和断马钱子苷或断马钱子苷生物合成途径自香叶醇的其他前体时，mia-fa菌株能够合成异胡豆苷，并且当共表达能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的功能性sgd时，也能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱。
[0590]
表9
[0591][0592]
首先，使所有六个菌株加上两个对照菌株(mia-fd-1和8)在150μl不含组氨酸的完全合成培养基(sc-his)中生长(一式三份)过夜至饱和。然后，将10μl预培养物转移至500μl的含有2％葡萄糖，并补充有0.1mm断马钱子苷和1mm色胺的sc-his培养基中。6天后，将200μl上清液过滤通过适用于水性溶液的0.2μm滤膜，例如用于培养基/水的acroprep
tm
advance，350μl，0.2微米膜。接下来，在lc-ms上进行分析之前，将20μl 250mg/l咖啡因添加至每个样品中作为内标。
[0593]
在lc-ms上分析样品咖啡因混合物以测量四氢鸭脚木碱浓度。
[0594]
如实施例9中所示，交换rsesgd结构域3和4挽救了非功能性crosgd的功能(图9)。野生型rvesgd能够产生四氢鸭脚木碱。交换rsesgd结构域3和4将四氢鸭脚木碱的产量提高了约七倍。gsesgd和utosgd与rsesgd的序列同一性(分别为53.9％和40.7％)低于crosgd和rvesgd(70.3％和89.9％)。gsesgd能够产生低浓度的四氢鸭脚木碱，而utosgd不能产生四氢鸭脚木碱。交换rsesgd结构域3和4至这两个sgd中并没有挽救utosgd的功能，且消除了gsesgd的低四氢鸭脚木碱产生。
[0595]
实施例10
[0596]
酵母中最少的异胡豆苷苷元产生
[0597]
异胡豆苷苷元在化学上不稳定，且不可能进行购买或纯化以用作定量标准。由所测试的sgd同源物产生的最少异胡豆苷苷元是从测量的由酵母菌株产生的四氢鸭脚木碱和测量的培养基中剩余的断马钱子苷来计算的。可能并非所有产生的异胡豆苷苷元均转化为四氢鸭脚木碱，因此在一些情况下，真实的异胡豆苷苷元滴度可能高于估计的最少产生。
[0598]
异胡豆苷苷元产生(μm)：
a.halkier 2007.user fusion:a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple pcr products.nucleic acids research,2007,vol.35,no.7e55.doi:10.1093/nar/gkm106
[0617]
guirimand g.,courdavault v.,lanoue a.,mahroug s.,guihur a.,blanc n.,giglioli-guivarc’h n.,st-pierre b.,burlat v.strictosidine activation in apocynaceae:towards a“nuclear time bomb”？bmc plant biology 2010,10:182
[0618]
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[0624]
项
[0625]
1.一种能够产生异胡豆苷苷元的微生物，所述微生物表达
[0626]
能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元的异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)，
[0627]
其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1
(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)或与其具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％同一性的其变体，
[0628]
和/或；
[0629]
其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
[0630]d1-d
2-d
3-d4[0631]
其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
[0632]
其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
[0633]
其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
[0634]
其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
[0635]
其中，所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd不都是rsesgd。
[0636]
2.如项1所述的微生物，进一步表达
[0637]
异胡豆苷合成酶(str)，其能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷，所述微生物由此能够合成异胡豆苷，
[0638]
其中所述str优选是crostr或与seq id no:30具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0639]
3.如前述项中任一项所述的微生物，其中d1包含对应于seq id no:24的氨基酸m1至r115的氨基酸序列或由其组成。
[0640]
4.如前述项中任一项所述的微生物，其中d2包含对应于seq id no:24的氨基酸f116至g266的氨基酸序列或由其组成。
[0641]
5.如前述项中任一项所述的微生物，其中d4包含seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸，或由所述氨基酸组成。
[0642]
6.如前述项中任一项所述的微生物，其中d1、d2或d4中的至少一个来自对第一生物体天然的sgd，所述第一生物体选自常绿钩吻、尖端赛多孢子菌或萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。
[0643]
7.如前述项中任一项所述的微生物，其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd相同或不同。
[0644]
8.如前述项中任一项所述的微生物，其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd中的两个相同，或其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd不同，或其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd相同。
[0645]
9.如前述项中任一项所述的微生物，其中所述嵌合sgd包含以下的氨基酸序列或
由以下的氨基酸序列组成：seq id no:93、seq id no:94、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99或seq id no:108，或与其具有至少90％的同一性或同源性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同一性或同源性的其变体。
[0646]
10.如前述项中任一项所述的微生物，其进一步表达：
[0647]
四氢鸭脚木碱合成酶(thas)和/或异育亨宾碱合成酶(hys)，其能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱，由此微生物能够合成四氢鸭脚木碱，
[0648]
其中所述thas优选是crothas和/或hys是crohys，或与seq id no:28和/或seq id no:46具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
[0649]
11.如前述项中任一项所述的微生物，其进一步表达
[0650]
sarpargan桥酶(sbe)，其能够将四氢鸭脚木碱和阿吗碱转化为选自由鸭脚木碱和蛇根碱组成的组的异育亨宾碱，从而微生物能够合成鸭脚木碱和蛇根碱，
[0651]
其中所述sbe优选为gsesbe或与seq id no:29具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0652]
12.如前述项中任一项所述的微生物，其进一步表达
[0653]
nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(cpr)；
[0654]
细胞色素b5(cyb5)；
[0655]
缝籽木嗪合成酶(gs)；
[0656]
缝籽木嗪氧化酶(go)；
[0657]
redox1；
[0658]
redox2；
[0659]
花冠木碱o-乙酰转移酶(sat)；
[0660]
o-乙酰基花冠木碱氧化酶(pas)；
[0661]
脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶(dpas)；
[0662]
水甘草碱合成酶(ts)；和/或
[0663]
长春质碱合成酶(cs)，
[0664]
从而微生物能够合成水甘草碱和/或长春质碱，
[0665]
其中优选地，所述cpr是crocpr，所述cyb5是crocyb5，所述gs是crosg，所述go是crogo，所述redox1是croredox1，所述redox2是croredox2，所述sat是crosat，所述pas是cropas，所述dpas是crodpas，所述ts是crots和/或所述cs是crocs，或分别与seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40和/或seq id no:41具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0666]
13.如前述项中任一项所述的微生物，其能够产生滴度为至少1μm，例如至少2μm、
例如至少4μm、例如至少6μm、例如至少8μm、例如至少10μm或更高的异胡豆苷苷元。
[0667]
14.如项10所述的微生物，其能够产生滴度为至少1μm，例如至少2μm、例如至少4μm、例如至少6μm、例如至少8μm、例如至少10μm或更高的四氢鸭脚木碱。
[0668]
15.如项11所述的微生物，其能够产生滴度为至少1μm，例如至少2μm、例如至少4μm、例如至少6μm、例如至少8μm、例如至少10μm或更高的鸭脚木碱。
[0669]
16.如项12所述的微生物，其能够产生滴度为至少0.01μm，例如至少0.02μm的水甘草碱。
[0670]
17.如项12所述的微生物，其能够产生滴度为至少0.01μm，例如至少0.02μm的长春质碱。
[0671]
18.如前述项中任一项所述的微生物，其中微生物选自酵母、细菌、古细菌、真菌、原生动物、藻类和病毒，优选所述微生物是酵母或细菌。
[0672]
19.如前述项中任一项所述的微生物，其中所述微生物是细菌。
[0673]
20.如项19所述的微生物，其中所述细菌的属选自由埃希氏菌(escherichia)、棒状杆菌(corynebacterium)、假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(bacillus)、乳球菌(lactococcus)、乳杆菌(lactobacillus)、盐单胞菌(halomonas)、双歧杆菌(bifidobacterium)和肠球菌(enterococcus)组成的组。
[0674]
21.如项19至20中任一项所述的微生物，其中细菌选自由埃希氏大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、lactococcus bacillus、halomonas elongate、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)和粪肠球菌(enterococcus faecal)组成的组。
[0675]
22.如项19至21中任一项所述的微生物，其中细菌是埃希氏大肠杆菌。
[0676]
23.如前述项中任一项所述的微生物，其中微生物是酵母(yeast)。
[0677]
24.如项23所述的微生物，其中所述酵母细胞的属选自由酵母菌(saccharomyces)、毕赤酵母(pichia)、耶氏酵母(yarrowia)、克鲁维酵母(kluyveromyces)、假丝酵母(candida)、红酵母(rhodotorula)、红冬孢酵母(rhodosporidium)、隐球菌(cryptococcus)、毛孢子菌(trichosporon)和油脂酵母(lipomyces)组成的组。
[0678]
25.如项23至24中任一项所述的微生物，其中酵母选自由酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、白色隐球菌(cryptococcus albidus)、lipomyces lipofera、斯达氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(rhodotorula glutinis)、trichosporon pullulan和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)组成的组。
[0679]
26.如项23至25中任一项所述的微生物，其中酵母是酿酒酵母。
[0680]
27.如前述项中任一项所述的微生物，其中微生物包含编码sgd的核酸，所述核酸与seq id no:1具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0681]
28.一种在微生物中生产异胡豆苷苷元的方法，所述方法包括以下步骤：
[0682]
a)提供微生物，所述细胞表达：
[0683]
异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)，其能够将异胡豆苷转化为异胡豆苷苷元；
[0684]
b)在包含异胡豆苷或可被所述微生物转化为异胡豆苷的底物的培养基中，培养所述微生物；
[0685]
c)任选地，回收异胡豆苷苷元；
[0686]
d)任选地，进一步将异胡豆苷苷元转化为单萜吲哚生物碱，
[0687]
其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
[0688]
和/或；
[0689]
其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
[0690]d1-d
2-d
3-d4[0691]
其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
[0692]
其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
[0693]
其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
[0694]
其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
[0695]
其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd不都是rsesgd。
[0696]
29.如项28所述的微生物，其中所述sgd、所述异源sgd和/或所述嵌合sgd如前述项中任一项所定义。
[0697]
30.如项28至29中任一项所述的微生物，其中d1包含对应于seq id no:24的氨基酸m1至r115的氨基酸序列或由其组成。
[0698]
31.如项28至30中任一项所述的微生物，其中d2包含对应于seq id no:24的氨基酸f116至g266的氨基酸序列或由其组成。
[0699]
32.如项28至31中任一项所述的微生物，其中d4包含seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成。
[0700]
33.如项28至32中任一项所述的微生物，其中d1、d2或d4中的至少一个来自对第一生物体天然的sgd，所述第一生物体选自常绿钩吻、尖端赛多孢子菌或萝芙木、小蔓长春花、蟾蜍树、胡氏水甘草、短小蛇根草、蓝果树、阿拉比卡咖啡、吐根、紫花风铃木、芝麻、中华猕
猴桃、向日葵、莴苣、牵牛、豇豆、木蹄层孔菌、稻瘟病菌、多育孢子虫、hydnomerulius pinastri md-312和moniliophthora roreri mca 2997。
[0701]
34.如项28至33中任一项所述的微生物，其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd相同或不同。
[0702]
35.如项28至34中任一项所述的微生物，其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd中的两个相同，或其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd不同，或其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd相同。
[0703]
36.如项28至35中任一项所述的微生物，其中所述嵌合sgd包含以下的氨基酸序列或由以下的氨基酸序列组成：seq id no:93、seq id no:94、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99或seq id no:108，或与其具有至少90％的同一性或同源性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％的同一性或同源性的其变体。
[0704]
37.如项28至36中任一项所述的方法，其中所述底物是断马钱子苷和/或色胺，并且其中所述微生物进一步表达
[0705]
异胡豆苷合成酶(str)，其能够将断马钱子苷和色胺转化为异胡豆苷；
[0706]
其中所述str优选是crostr或与seq id no:30具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0707]
38.如项28至37中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤d)且其中所述微生物进一步表达：
[0708]
四氢鸭脚木碱合成酶(thas)和/或异育亨宾碱合成酶(hys)，其能够将异胡豆苷苷元转化为四氢鸭脚木碱；
[0709]
其中优选地，所述thas与seq id no:28相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性，和/或hys与seq id no:46相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0710]
39.如项28至38中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括回收四氢鸭脚木碱的步骤。
[0711]
40.如项28至39中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤d)且其中所述微生物进一步表达：
[0712]
sarpargan桥酶(sbe)，其能够将四氢鸭脚木碱转化为鸭脚木碱；
[0713]
其中优选地，所述sbe与seq id no:29相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性。
[0714]
41.如项40所述的方法，其中所述方法进一步包括回收鸭脚木碱的步骤。
[0715]
42.如项28至41中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤d)且其中所述微生物进一步表达：
[0716]
nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(cpr)；
[0717]
细胞色素b5(cyb5)；
[0718]
缝籽木嗪合成酶(gs)；
[0719]
缝籽木嗪氧化酶(go)；
[0720]
redox1；
[0721]
redox2；
[0722]
花冠木碱o-乙酰转移酶(sat)；
[0723]
o-乙酰基花冠木碱氧化酶(pas)；
[0724]
脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶(dpas)；
[0725]
水甘草碱合成酶(ts)；和/或
[0726]
长春质碱合成酶(cs)，
[0727]
其中优选地，所述cpr是crocpr，所述cyb5是crocyb5，所述gs是crosg，所述go是crogo，所述redox1是croredox1，所述redox2是croredox2，所述sat是crosat，所述pas是cropas，所述dpas是crodpas，所述ts是crots和/或所述cs是crocs，或分别与seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40和/或seq id no:41具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体。
[0728]
其中所述微生物能够产生水甘草碱和/或长春质碱，任选地其中所述方法进一步包括回收水甘草碱和/或长春质碱的步骤。
[0729]
43.如项28至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少异胡豆苷，优选其浓度为至少0.05mm，例如至少0.1mm、例如至少0.5mm、例如至少1mm。
[0730]
44.如项28至43中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少色胺和断马钱子苷，优选其浓度为至少0.05mm，例如至少0.1mm、例如至少0.5mm、例如至少1mm。
[0731]
45.一种核酸构建体，其包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:68、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106和/或seq id no:107相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的序列。
[0732]
46.如项45所述的核酸构建体，其进一步包含与seq id no:7相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的序列。
[0733]
47.如项45至46中任一项所述的核酸构建体，其进一步包含与seq id no:5和/或seq id no:23相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如
100％的同一性的序列。
[0734]
48.如项45至47中任一项所述的核酸构建体，其进一步包含与seq id no:6相同或具有至少90％同一性，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的核酸序列。
[0735]
49.如项45至48中任一项所述的核酸构建体，其进一步包含与seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和/或seq id no:18相同或具有至少90％，例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的核酸序列。
[0736]
50.如项45至49中任一项所述的核酸构建体，其中所述一个或多个核酸序列中的至少一个在诱导型启动子的控制下。
[0737]
51.如项45至50中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是载体，例如整合型载体或复制型载体。
[0738]
52.包含如项45至50中任一项所定义的核酸序列的载体。
[0739]
53.包含如项45至50中任一项所定义的一个或多个核酸序列或如项52所述的载体的宿主细胞。
[0740]
54.包含如项1至36中任一项所述的微生物，和/或如项45至50中任一项所述的核酸构建体，和/或如项52所述的载体，以及使用说明的试剂盒。
[0741]
55.如项45至50中任一项所述的核酸构建体、如项1至36中任一项所述的微生物、如项52所述的载体或如项53所述的宿主细胞在微生物中生产异胡豆苷苷元和/或四氢鸭脚木碱、鸭脚木碱、水甘草碱和/或长春质碱中的用途。
[0742]
56.如项55所述的用途，其在如项37至44所述的方法中。
[0743]
57.通过如项37至44中任一项所述的方法获得的异胡豆苷苷元。
[0744]
58.通过如项39至44中任一项所述的方法获得的四氢鸭脚木碱。
[0745]
59.通过如项41至44中任一项所述的方法获得的异育亨宾碱。
[0746]
60.通过如项42至44中任一项所述的方法获得的水甘草碱和/或长春质碱。
[0747]
61.一种在微生物中生产单萜吲哚生物碱(mia)的方法，所述方法包括以下步骤：
[0748]
a)提供能够将异胡豆苷转化为水甘草碱和/或长春质碱的微生物，所述细胞表达：
[0749]
异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(sgd)；
[0750]
nadph
‑‑
细胞色素p450还原酶(cpr)；
[0751]
细胞色素b5(cyb5)；
[0752]
缝籽木嗪合成酶(gs)；
[0753]
缝籽木嗪氧化酶(go)；
[0754]
redox1；
[0755]
redox2；
[0756]
花冠木碱o-乙酰转移酶(sat)；
[0757]
o-乙酰基花冠木碱氧化酶(pas)；
[0758]
脱氢前骨节心蛤碱乙酸酯合成酶(dpas)；
[0759]
水甘草碱合成酶(ts)；和/或
[0760]
长春质碱合成酶(cs)；
[0761]
任选地，异胡豆苷合成酶(str)；
[0762]
b)在包含异胡豆苷或可被所述微生物转化为异胡豆苷的底物的培养基中，培养所述微生物；
[0763]
c)任选地，回收mia；
[0764]
d)任选地，将mia加工成药物化合物，
[0765]
其中所述sgd是选自以下的异源sgd：rsesgd(seq id no:24)、gsesgd(seq id no:25)、sapsgd(seq id no:26)、rvesgd(seq id no:27)、vmisgd1(seq id no:47)、ahusgd(seq id no:48)、himsgd2(seq id no:49)、sinsgd(seq id no:50)、telsgd(seq id no:51)、vunsgd(seq id no:52)、nsisgd1(seq id no:53)、lprsgd(seq id no:54)、achsgd1(seq id no:55)、hsusgd(seq id no:56)、mrosgd(seq id no:57)、rsesgd2(seq id no:58)、pgrsgd(seq id no:59)、opusgd(seq id no:60)、hpisgd(seq id no:61)、hansgd1(seq id no:62)、achsgd2(seq id no:63)、himsgd1(seq id no:64)、ipesgd(seq id no:65)、lsasgd1(seq id no:66)或carsgd(seq id no:67)，或与其具有至少70％，例如至少80％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％的同一性的其变体，
[0766]
和/或；
[0767]
其中所述sgd是嵌合sgd，其中所述嵌合sgd包含具有以下通式的氨基酸序列
[0768]d1-d
2-d
3-d4[0769]
其中d1是来自第一sgd的第一氨基酸序列，
[0770]
其中d2是来自第二sgd的第二氨基酸序列，
[0771]
其中d3是包含seq id no:91或与seq id no:91具有至少90％同一性的其变体的氨基酸或由所述氨基酸组成的第三氨基酸序列，
[0772]
其中d4是来自第四sgd或由seq id no:92或与seq id no:92具有至少90％同一性的其变体的氨基酸组成的氨基酸序列的第四氨基酸序列，
[0773]
其中所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd可以相同或不同，前提是所述第一sgd、所述第二sgd和所述第四sgd不都是rsesgd。
[0774]
62.如项61所述的方法，其中所述微生物如前述项中任一项所定义。
[0775]
63.一种治疗例如癌症、心律失常、疟疾、精神病、高血压、抑郁症、阿尔茨海默病、成瘾和/或神经元疾病的病症的方法，包括施用治疗足量的通过如项24至30、47或61至62中任一项所述的方法获得的mia或药物化合物。