基于表面增强拉曼光谱技术快速鉴定土壤中木霉菌的方法与流程

1.本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱技术快速鉴定土壤中木霉菌的方法。


背景技术：

2.木霉菌广泛分布于自然界，为一类次级定殖真菌，常见于土壤特别是富含有机质的土壤中，是土壤微生物的重要群落之一，对土壤生态系统的功能起着至关重要的作用。
3.近年来，我国的研究人员对土壤中木霉菌的种类进行了大量的调查和鉴定，到目前为止，我国在土壤中发现的木霉种类已达到了22种，包括棘孢木霉(t.asperellum)、深绿木霉(t.atroviride)、黄绿木霉(t.aureoviride)、绒毛木霉(t.tomentosum)、毛簇木霉(t.velutinum)、绿木霉(t.virens)和绿色木霉(t.viride)等。
4.木霉菌的类型和数量分布，因植被的不同而表现出显著的差异。土壤是一个高度异质性的环境，在植物的病原真菌入侵土壤后，会通过植物间接或直接地与细菌作用。在土壤中的真菌菌丝生长时，植物根系会产生草酸和苯乙酸，产生氧化压力，激活ppgpp信号通路，进而导致细菌运动性改变、次级代谢物的产生等，继而进一步对土壤中植物的生长产生有害的影响。
5.木霉菌的个体较小，为纳米级或者微米级，肉眼难以对其进行识别，待其累积到一定的量形成菌落才可对其进行识别，但此时土壤已发生了变质，甚至可能已经在其内部产生了真菌毒素，对植物生产造成有害的影响。所以，开发一种能够快速、高效检测土壤中木霉菌的技术，能在早期对土壤的霉变污染进行辨别检测，起到预警作用，及时采取措施，具有非常重大的意义。目前，霉菌的测定方法主要有用平板菌落计数法，3m petrifilmtm快速测定法，液相色谱-质谱法等。
6.平板菌落计数法是检测霉菌的经典方法。但是该方法操作较为复杂，且培养过程耗时较长，不能满足现场、实时、实地的需要。3m petrifilmtm快速测定法是采用测试纸片，同样需要菌种的培养，培养(48
±
2)h的时间，然后计数。液相色谱-质谱联用仪等大型仪器设备的方法可以用于霉菌的检测，准确率高，但是这些大型仪器在检测过程中对环境和专业检测人员的素质等都要求较高，并且不便于移动到现场进行检测。
7.近年来，表面增强拉曼散射技术(sers)在微生物检测方面取得了巨大的进步。sers技术通过提高附着在粗糙金属的表面上的待测物样品的拉曼信号，做到对样品的快速、无损检测而被广泛应用。因此，这种以纳米金溶胶为增强基底的微生物检测手段，就具备了检测时长短，灵敏度高、操作简便、对待测物的形态要求低等优势。目前，利用表面增强拉曼散射技术对微生物的检测，主要集中在食品样品或者生物样品中的大肠杆菌、沙门氏菌等，应用范围较窄。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种基于表面增强拉曼光谱技术快速鉴
定土壤中木霉菌的方法。
9.本发明的技术方案为：一种基于表面增强拉曼光谱技术快速鉴定土壤中木霉菌的方法，包括以下步骤：
10.(1)制备纳米金溶胶：将0.01％的氯金酸溶液置于容器中，以700-900r/min加热搅拌，待溶液沸腾后，立即加入1％柠檬酸三钠溶液，加热反应20-40min，冷却至室温，即为粒径为50-100nm的纳米金溶胶。
11.(2)木霉菌标准图谱的测定：将不同的木霉菌孢子悬液接种到灭菌好的培养基上，置于恒温培养箱中进行培养1-3h，并使湿度维持饱和状态；培养结束后，取菌块置于无菌管中进行漩涡震荡，震荡速度为2500-4000r/min，震荡时长2-4分钟，制备成标准木霉菌的悬液；取该悬液20ul与400ul的步骤(1)的纳米金溶胶混合，立即用便携式拉曼光谱仪进行测定；便携式拉曼光谱仪的激发波长和激光功率分别为785nm和200-300mw，采集过程中积分时间设为10-30s，分辨率为4cm-1
，扫描光谱范围为500-1800cm-1
；对采集到的拉曼光谱进行图谱处理。
12.(3)土壤中样品中木霉菌图谱的测定：取1.0g土壤样品，加入10ml无菌纯水，置于无菌管中进行漩涡震荡，震荡速度为2500-4000r/min，震荡时长2-4分钟，制备成土壤样品的木霉菌悬液；取该悬液20ul与400ul的步骤(1)的纳米金溶胶混合，立即用便携式拉曼光谱仪进行测定；便携式拉曼光谱仪的激发波长和激光功率分别为785nm和200-300mw，采集过程中积分时间设为10-30s，分辨率为4cm-1
，扫描光谱范围为500-1800cm-1
；对采集到的拉曼光谱进行图谱处理。
13.(4)木霉菌的鉴别和分类：将步骤(3)得到的土壤中样品中木霉菌图谱与步骤(2)得到的木霉菌标准图谱进行比对，从而确定木霉菌的种类。
14.进一步地，步骤(1)中，制备纳米金溶胶：将规格为1g的氯金酸粉末倒入100ml容量瓶中，超纯水定容，配制成质量分数为1％的氯金酸溶液作为储备液，每次使用时再稀释，本方法所用的氯金酸浓度为0.01％，低温避光保存；将规格为1g的柠檬酸三钠粉末倒入100ml容量瓶中，超纯水定容，配制成质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液，现配现用；将50.00ml、0.01％的氯金酸溶液置于圆底烧瓶中，以700-900r/min加热搅拌，待溶液沸腾后，立即加入1％柠檬酸三钠溶液0.2-0.5ml，加热反应20-40min，冷却至室温，即为粒径为50-100nm的纳米金溶胶。
15.进一步地，步骤(4)中，比对的方法为：采用拉曼谱图的相邻峰位置的峰强比进行处理对比，在i
690
、i
732
、i
1010
、i
1054
、i
1273
、i
1310
、i
1551
、i
1617
处存在的拉曼峰的相邻峰位置的峰强比，得到不同的峰强比值，通过图谱处理软件得到不同木霉菌的相邻特征峰峰强比的比对图，可以实现对不同的木霉真菌进行区分识别，进而可以判断土壤中是否已经有木霉菌和哪一种类型的木霉菌。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.1、本发明把表面表面增强拉曼技术和便携拉曼光谱仪相结合，对土壤容易霉变的木霉菌进行早期的检测和判别，便于及时采取措施，防止大面积的污染，可以大大减少经济损失。
18.2、本发明的方法是基于表面增强拉曼散射技术(sers)结合便携拉曼光谱仪进行检测。所用方法中的仪器设备便于携带，方法检测时间短，方便快捷，不需要进行生物培养，
也可以避免使用大型的仪器设备，检测成本低廉，准确率高。
附图说明
19.图1为本发明的技术路线示意图；
20.图2为绿木霉、黄绿木霉、深绿木霉、绿色木霉检测图谱；
21.图3为绿木霉、黄绿木霉、深绿木霉、绿色木霉的相邻特征峰峰强比的比对图。
具体实施方式
22.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
23.实施例1
24.(1)纳米金溶胶的合成：将规格为1g的氯金酸粉末倒入100ml容量瓶中，超纯水定容，配制成质量分数为1％的氯金酸溶液作为储备液，每次使用时再稀释，本方法所用的氯金酸浓度为0.01％，低温避光保存。将规格为1g的柠檬酸三钠粉末倒入100ml容量瓶中，超纯水定容，配制成质量分数为1％的柠檬酸三钠溶液，现配现用。将50.00ml、0.01％的氯金酸溶液置于圆底烧瓶中，以700-900r/min加热搅拌，待溶液沸腾后，立即加入1％柠檬酸三钠溶液0.2-0.5ml，加热反应20-40min，冷却至室温，即为粒径为50-100nm的纳米金溶胶，将液体转移到棕色试剂瓶中，贴上标签，放入4℃冰箱保存。
25.(2)木霉菌的检测
26.a.木霉菌标准图谱的测定：将不同的木霉菌孢子悬液接种到灭菌好的pda培养基上，置于30℃恒温培养箱中进行培养1-3h，并使湿度维持饱和状态。培养结束后，将培养基分为1
×
1cm的小方块，每次取3块小方块置于无菌管中进行漩涡震荡，震荡速度为2500-4000r/min，震荡时长2-4分钟，制备成标准木霉菌的悬液。用移液器取该悬液20ul与400ul的纳米金溶胶混合，立即用便携式拉曼光谱仪进行测定。便携式拉曼光谱仪的激发波长和激光功率分别为785nm和200-300mw，采集过程中积分时间设为10-30s，分辨率为4cm-1
，扫描光谱范围为500-1800cm-1
。对采集到的拉曼光谱采用基线校正、归一化、平滑处理和特征峰归属等方法进行图谱处理。
27.b.土壤中样品中木霉菌图谱的测定：取1.0g土壤样品，加入10ml无菌纯水，置于无菌管中进行漩涡震荡，震荡速度为2500-4000r/min，震荡时长2-4分钟，制备成土壤样品的木霉菌悬液。用移液器取该悬液20ul与400ul的纳米金溶胶混合，立即用便携式拉曼光谱仪进行测定。便携式拉曼光谱仪的激发波长和激光功率分别为785nm和200-300mw，采集过程中积分时间设为10-30s，分辨率为4cm-1
，扫描光谱范围为500-1800cm-1
。对采集到的拉曼光谱采用基线校正、归一化、平滑处理和特征峰归属等方法进行图谱处理。
28.c.木霉菌的鉴别和分类：将a得到的土壤中样品中木霉菌图谱与b得到的木霉菌标准图谱进行比对，从而确定木霉菌的种类。
29.图2为采用本发明的方法得到的绿木霉、黄绿木霉、深绿木霉、绿色木霉检测图谱，从木霉菌的拉曼谱图中可以看出，不同的木霉真菌在400-1800cm-1
处显示不同的sers指纹。特征峰主要在690cm-1
、732cm-1
、1010cm-1
、1054cm-1
、1273cm-1
、1310cm-1
、1551cm-1
、1617cm-1
处。从图谱上可以看出，绿木霉与黄绿木霉、深绿木霉、绿色木霉的特征峰有不同之处，可以
从图谱上区分出绿木霉，而黄绿木霉、深绿木霉、绿色木霉的特征峰位置几乎相同，单从特征峰位置很难区分，采用拉曼谱图的相邻峰位置的峰强比进行处理对比，如i
690
、i
732
、i
1010
、i
1054
、i
1273
、i
1310
、i
1551
、i
1617
等处存在的拉曼峰的相邻峰位置的峰强比，得到不同的峰强比值，通过图谱处理软件得到不同木霉菌的相邻特征峰峰强比的比对图(图3)，可以实现对不同的木霉真菌进行区分识别，进而可以判断土壤中是否已经有木霉菌和哪一种类型的木霉菌。