一种用于检测ALL相关基因SNP的SNaPshot多重分析试剂盒及其应用的制作方法

一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重分析试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重分析试剂盒及其应用。


背景技术：

2.随着众多基因的snp位点的发现，急性淋巴细胞白血病(all)儿童患儿的用药个体化与基因多态性的关系正日益得到关注，影响all患儿化疗药物代谢的基因多态性已被作为all化疗不良反应与预后的预测因素。
3.测序技术是分子生物学最重要的检测手段，是基因多态性和基因突变检测的金标准，也是其他众多技术方法的参考标准。测序技术的优势在于，直接测定样本的基因序列，得到基因变异的精确情况，并且能够对某一段dna序列进行多位点突变检测，或未知突变检测，广泛应用在肿瘤靶向药物个体化治疗检测、遗传疾病基因突变检测、血液病基因突变检测、hla分型与配型、病原微生物耐药性检测等等诸多领域。第一代dna测序技术用的是1975年由sanger和coulson开创的链终止法或maxam和gilbert发明的化学法(链降解)。其中常用的sanger测序(双脱氧末端终止法)的原理是将被荧光标记的ddntp掺入到dntp中，由于ddntp随机掺入，pcr产物从引物之后的第一个碱基开始，每一个位置都有可能是ddntp。由于ddntp缺乏链延伸所需要的3'-oh，链的延伸就选择性地在g、a、t或c处终止。这样的pcr产物与普通pcr不一样，不能形成一条电泳带，而是一组长度相差一个碱基的成百上千种片段。它们具有共同的起始点，终止在不同的的核苷酸上，每一个碱基都有相同的概率被终止。将得到的不同大小的片段进行毛细管电泳，通过对荧光信号的采集和拼接，最终获得目的片段的序列。其特点是高读长；检测通量中的；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序，广泛应用于临床检测和科研研究。
4.snapshot多重分析系统又称为小测序技术，是一种基于引物单碱基延伸的方法，在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddntp，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和pcr产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经abi测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。通过针对不同的snp位点设计不同长度的延伸引物来做到多个snp在一个反应体系中进行分型。snapshot既拥有sanger测序中ddntp单碱基延伸就终止的特点，又具有片段分析通量较高的属性。


技术实现要素：

5.基于上述背景技术，本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重分析试剂盒及其应用，以此提高all基因多态性的检测效率，降低了检测成本。
6.首先，本发明提供的snapshot多重分析试剂盒包括多重扩增引物组和多重测序引物组。
7.优选地，所述试剂盒包括2*vazyme mix、snapshot mix和ddh2o。
8.其次，本发明提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重扩增引物组，所述all相关基因snp以及引物序列如下表所示：
[0009][0010]
[0011][0012]
其次，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重扩增引物组的工作液，该工作液的具体配置如下表所示：其中，上下游引物各自浓度均为100μm，
[0013][0014]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重扩增pcr反应体系，该pcr反应体系具体如下表所示：
[0015]
ddh2o6μl多重pcr扩增引物工作液2μl样品dna(20-30ng/ul)2μl2*vazyme mix10ultotal20μl
[0016]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重扩增pcr反应程序，该pcr反应程序具体如下表所示：
[0017]
[0018][0019]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重测序引物，所述测序引物具体序列如下表所示：
[0020]
[0021][0022]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重测序引物组的工作液，所述工作液的具体配置如下表所示：其中，各测序引物浓度为100μm，
[0023][0024]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重测序pcr反应体系，所述pcr反应体系的具体配置如下表所示：
[0025]
ddh2o1μl多重pcr测序引物工作液1μl多重pcr纯化产物3μlsnapshot mix5ultotal10μl
[0026]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测all相关基因snp的snapshot多重测序pcr反应程序，所述pcr反应程序的具体配置如下表所示：
[0027][0028]
另一方面，本发明还提供了一种用于检测上述all相关基因snp的snapshot多重分析方法，所述方法包括以下步骤：
[0029]
1)释放待测样本的核酸；
[0030]
2)使用本发明的多重扩增引物组对步骤1)获得的核酸进行多重pcr扩增；扩增体系和扩增程序如上所述；
[0031]
3)纯化上述扩增产物，然后使用本发明的多重测序引物组对步骤2)获得的纯化扩增产物进行扩增，获得带有荧光标记的产物；pcr反应体系和反应程序如上所述；
[0032]
4)将纯化的荧光标记产物上机检测，并分析获得结果。
[0033]
优选地，在本发明中，用于检测的样本可以是全血、外周血、口腔拭子、咽拭子等，但不限于此；
[0034]
优选地，在本发明中，所述待测样本的核酸浓度至少是20ng/ul，纯度a260/a280至少1.5。
[0035]
另一方面，本发明还提供了所述多重扩增引物组或所述多重测序引物组在制备用于检测all相关基因snp的snapshot多重分析试剂盒或试剂中的应用。
[0036]
本发明的有益效果是：本发明开发的首次开发了针对多个all相关snp位点的snapshot多重分析试剂盒，以此提高all基因多态性的检测效率，降低了检测成本。
附图说明
[0037]
图1是单孔引物测试胶图(从左至右，依次是样本1、样本2、样本3)；
[0038]
图2是多重pcr引物扩增后胶图(从左至右依次是maker、样本1、样本2、样本3)；
[0039]
图3是多重测序后结果分析图(从上至下，依次是样本1、样本2、样本3)；
[0040]
图4是样本1的sanger测序结果图(从上至下，依次是slc01b1-tt、tpmt-10-aa、mthfr-1298-ac、nudt15-3-cc、cep72-cc、tpmt-7-gg、mthfr-677-cc、tpmt-5-gg)；
[0041]
图5是样本2的sanger测序结果图(从上至下，依次是slc01b1-tt、tpmt-10-aa、mthfr-1298-aa、nudt15-3-cc、cep72-cc、tpmt-7-gg、mthfr-677-tc、tpmt-5-gg)；
[0042]
图6是样本3的sanger测序结果图(从上至下，依次是slc01b1-cc、tpmt-10-ag、mthfr-1298-aa、nudt15-3-cc、cep72-cc、tpmt-7-gg、mthfr-677-tc、tpmt-5-gg)。
具体实施方式
[0043]
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0044]
实施例1.一种检测多个all相关snp位点的snapshot多重分析试剂盒
[0045]
一种检测多个all相关snp位点的snapshot多重分析试剂盒，所述snapshot多重分析试剂盒包括多重扩增引物组和多重测序引物组。
[0046]
其中，所述多重扩增引物组的序列如下表所示：
[0047]
表1. 5个基因8个snp位点多重扩增引物序列
[0048]
[0049][0050]
上述多重扩增引物组的工作液的具体配置如下表所示：其中，上下游引物各自浓度均为100μm。
[0051]
表2. 5个基因8个snp位点多重扩增引物配制
[0052]
[0053][0054]
其中，表中稀释方式166.8μl ddh2o (2.4 2 2 1.4 0.8 4 2 2)μl各自f代表，166.8μl ddh2o 2.4μlmthfr-677f 2μlmthfr-1298f 2μlcep72f 1.4μlnudt15f 0.8μlslco1b1f 4μltpmt-10f 2μltpmt-7f 2μltpmt-5f。
[0055]
上述多重扩增引物组的多重pcr反应体系如下表所示：
[0056]
表3. 5个基因8个snp位点多重pcr扩增体系
[0057]
ddh2o6μl多重pcr扩增引物工作液2μl样品dna(20-30ng/ul)2μl2*vazyme mix10ultotal20μl
[0058]
上述多重扩增引物组的多重pcr反应程序具体如下表所示：
[0059]
表4. 5个基因8个snp位点多重pcr扩增程序
[0060]
[0061][0062]
其中，所述多重测序引物具体序列如下表所示：
[0063]
表5. 5个基因8个snp位点多重测序引物序列
[0064]
[0065][0066]
上述多重测序引物组的工作液的具体配置如下表所示：其中，各测序引物浓度为100μm。
[0067]
表6. 5个基因8个snp位点多重测序引物配制
[0068][0069]
上述多重测序引物组的pcr反应体系的具体配置如下表所示：
[0070]
表7. 5个基因8个snp位点多重测序反应体系
[0071]
ddh2o1μl多重pcr测序引物工作液1μl多重pcr纯化产物3μlsnapshot mix5ultotal10μl
[0072]
上述多重测序引物组的pcr反应程序的具体配置如下表所示：
[0073]
表8. 5个基因8个snp位点多重测序反应程序
[0074]
[0075][0076]
实施例2.一种用于检测上述all相关基因snp的snapshot多重分析方法
[0077]
一种用于检测上述all相关基因snp的snapshot多重分析方法，所述方法包括以下步骤：
[0078]
1)释放待测样本的核酸；所述待测样本的核酸浓度至少是20ng/ul，纯度a260/a280至少1.5。
[0079]
2)使用多重扩增引物组(表1)对步骤1)获得的核酸进行多重pcr扩增；扩增体系和扩增程序分比如表2和表3所述；
[0080]
3)纯化上述扩增产物，然后使用多重测序引物组(表5)对步骤2)获得的纯化扩增产物进行扩增，获得带有荧光标记的产物；pcr反应体系和反应程序如表7和表8所述；
[0081]
4)将纯化的荧光标记产物上机检测，并分析获得结果。
[0082]
其中，所述检测样本分别是选自包含如下已知snp位点信息的样本1-3，具体snp位点信息如下表所示：
[0083]
表9.待测样本snp位点信息
[0084][0085][0086]
对比例1.利用sanger测序法检测样本1-3
[0087]
利用本领域公知的sanger测序法检测样本1-3中的all相关基因snp位点信息，以此验证本发明实验的可行性。
[0088]
实验结果：如图1-6所示，与对比例1相比，本发明的snapshot多重分析试剂盒检测结果和sanger测序法检测结果一致，可实现准确检测all的5种基因常见的snp位点。且相比于sanger测序法，本发明的snapshot多重分析试剂盒的结果分析和实验流程更加快捷高效。
[0089]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。