Salubrinal在制备治疗骨髓间充质干细胞衰老的药物中的新用途的制作方法

salubrinal在制备治疗骨髓间充质干细胞衰老的药物中的新用途
技术领域
1.本发明涉及salubrinal的新用途，具体为salubrinal在制备治疗骨髓间充质干细胞衰老的药物中的新用途。


背景技术：

2.衰老是许多主要慢性病的公认危险因素之一，例如骨质疏松症。在过去的几十年里，人们发现了许多衰老机制，其中，细胞衰老被认为是衰老的基本机制。一些特征被用来表征衰老细胞，如凋亡抵抗、细胞周期阻滞和过度产生的衰老相关分泌表型(sasp)。细胞衰老可由多种刺激引起，如dna损伤反应(ddr)、致癌基因诱导和氧化应激。了解细胞衰老的维持机制有助于制定包括senolytics和senomorphics等在内的senotherapeutic治疗策略，通过消除衰老细胞或其作用来改善组织损伤，促进修复和再生。
3.senolytic这个概念最早是kirkland jl等人在2015年提出的，目的是通过药物或小分子靶向调控衰老细胞中与衰老相关的抗凋亡通路(scaps)来消除衰老细胞。这种基于相关药物机制的发现促成了达沙替尼(d)和槲皮素(q)联合治疗的进展，达沙替尼是fda批准的酪氨酸激酶抑制剂，而槲皮素是在许多水果和蔬菜中发现的一种黄烷醇。这种治疗方法可以降低衰老细胞的丰度，并被进一步证明有利于改善年龄相关的病理特征。在这些突破性研究的推动下，一些其他策略已被用于发展潜在的senolytic疗法，如通过靶向肾型谷氨酰胺酶(kga)依赖性谷氨酰胺解来抑制相关衰老。
4.相关技术中，通过测量衰老小鼠骨微环境中的衰老和与衰老相关的分泌表型(sasp)标记物，相关实验发现细胞衰老存在于不同谱系的一个亚群，如前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞。与对照组相比，d q的senolytic疗法已被发现能改善老龄小鼠的骨脆性。此外，在颅骨缺损模型中，最近发现d q疗法还能提高老年小鼠骨髓间充质干细胞的成骨潜能。然而，消除衰老细胞并不能逆转ovx诱导的骨丢失或改变衰老生物标志物。因此，在骨微环境中寻找其他可用于去除衰老细胞的补充策略是很有意义的。
5.考虑到其应激反应表型，衰老细胞需要蛋白质量控制系统来满足其在衰老状态中大量分泌体的需求。在哺乳动物细胞中，这一过程主要是通过激活内质网应激(er stress)的未折叠蛋白反应(upr)来保证的。当未折叠蛋白的负荷超过内质网的能力时，内质网应激被诱发，内质网的未折叠蛋白反应被激活，以恢复内质网的稳定状态。内质网应激主要由atf6、perk和ire1三种跨膜蛋白感知和调控。近年来，越来越多的证据证实内质网应激在细胞衰老中的存在。例如，复制和致癌基因诱导的衰老黑素细胞显示内质网应激和三个upr通路的激活。此外，在衰老的淋巴瘤细胞中也发现内质网应激状态的激活，包括upr的ire1α/xbp1和perk/atf4分支。近年来的相关研究表明，内质网应激和upr在一些衰老细胞中普遍存在，并可能发挥一些微妙的作用。然而，细胞衰老与内质网应激在骨细胞中的作用之间的关系尚不清楚。


技术实现要素：

6.假设在衰老细胞中，内质网应激可以被严格调控以避免细胞凋亡，保持内质网应激状态的持续性可能诱发细胞凋亡程序启动，从而清除衰老细胞。基于这些假设，在当前的研究中本发明首先测量了氧化应激诱导的衰老骨髓间充质干细胞中的内质网应激状态，然后在体内外通过salubrinal激活并延长perk-eif2α通路，以发现延长内质网应激信号是否能缓解老年小鼠骨髓间充质干细胞的细胞衰老并改善骨完整性。
7.salubrinal目前已被用于研究应激保护基因和途径对生物体发育和寿命的影响。它也被用于研究在甲基苯丙胺诱导的血脑屏障破坏中的治疗潜力。salubrinal分子式是c
21h17
cl3n4os，分子量为479.81结构式如下：
[0008][0009]
salubrinal作为一种eif2α去磷酸化抑制剂，可以有效促进内质网应激通路的持续激活，从而达到清除衰老细胞的预期。
[0010]
salubrinal目前在衰老相关的骨骼形状改变中的研究尚且不足，针对此类药物在相关疾病中的研究是本发明所关注的重点。针对以上背景技术存在的问题，本发明提供salubrinal在治疗衰老相关骨质疏松中的应用。
[0011]
为了证明salubrinal的新用途，本发明通过以下实验完成：
[0012]
在体外实验中，本发明取2-3月龄icr小鼠的骨髓间充质干细胞，将细胞离心后悬浮于含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的基本培养基α-mem中，以1.0
×
106/cm2的密度在细胞培养皿中培养72小时。去除含有悬浮细胞的细胞培养液，使用贴壁的骨髓间充质干细胞进一步分析。将细胞置于12孔板中，用25μm h2o2处理3.5天建立细胞衰老模型。用10mmβ-磷酸甘油和50μg/ml抗坏血酸诱导成骨细胞分化天数，在这其中介入salubrinal(0/10/20/50/100μm)处理并研究细胞衰老状况的改变。在此基础之上，本发明利用β半乳糖苷酶染色检测骨髓间充质干细胞的衰老状况，利用cck-8细胞活性检测细胞活力，利用rt-qpcr、wes tern blot以及免疫荧光等技术检测衰老相关各项指标。
[0013]
在体内实验中，本发明选取5月龄的samp6和samr1小鼠进行试验。快速老化模型小鼠(sam)是由日本学者通过选择akr/j系小鼠近交繁殖培育的系列快速老化小鼠模型，包括14种快速老化的p品系和4种正常老化的品系，其中p品系的samp6小鼠为自发老年性骨质疏松模型，具有低峰值骨密度，低峰值骨量，全身广泛性骨量减少，骨组织微结构破坏，骨脆性增加等特点。对两种目标小鼠分别进行为期4周的salubrinal(1mg/kg/天)或生理盐水腹腔注射，随后进行处死。对samr1和samp6小鼠进行远端股骨和椎体显微结构参数的检测：骨体积分数(bv/tv)、小梁厚度(tb.th)、小梁数量(tb.n)、小梁分离度(tb.sp)、皮质面积分数(ct.ar/tt.ar)、平均皮质厚度(ct.th)。elisa检测包括ctx、p1np浓度检测。
[0014]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0015]
(1)salubrinal可延长衰老骨髓间充质干细胞中eif2α信号通路，有效缓解衰老骨髓间充质干细胞的细胞衰老表型。
[0016]
(2)salubrinal促进了衰老骨髓间充质干细胞的凋亡。salubrinal可改善衰老加
速、成骨细胞生成/成骨细胞生成缺陷的小鼠骨骼微结构。
[0017]
(3)salubrinal具有较为良好的对抗骨髓间充质干细胞衰老以及抗衰老型骨质疏松的作用，是一类较好的senolytic类抗衰老药物。
附图说明
[0018]
图1：perk通路在衰老的骨髓间充质干细胞中被显著激活。
[0019]
(a)h2o2(25μm)处理骨髓间充质干细胞诱导细胞衰老。
[0020]
(b)β半乳糖苷酶染色检测骨髓间充质干细胞。标尺规格：50μm。β半乳糖苷酶染色统计。
[0021]
(c)western blot(蛋白质免疫印迹)检测不同剂量h2o2处理3.5天的骨髓间充质干细胞中atf6α、ire1、p-ire1、、xbp1的水平，毒胡萝卜素(tg，1μm))作为阳性对照。
[0022]
(d)h2o2处理3.5天后骨髓间充质干细胞perk、p-eif2α、atf4、chop、gadd34蛋白水平。
[0023]
(e-j)h2o2处理(25μm)3.5天后，实时定量pcr检测内质网应激标志物perk、atf4、g-add34、grp94、chop和atf6在bmscs中的mrna表达水平。数据代表sd平均值。*p《0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001；ns代表没有统计学差异。
[0024]
图2：用salubrinal激活eif2α信号通路显著降低骨髓间充质干细胞细胞衰老水平。
[0025]
(a)用h2o2(25μm)处理骨髓间充质干细胞3.5天，然后用salubrinal(50μm)处理24小时。
[0026]
(b)β半乳糖苷酶染色检测衰老的骨髓间充质干细胞。标尺规格：50μm。
[0027]
(c)实时定量pcr检测cdkn1α和cdkn2α的mrna水平。
[0028]
(d)western blotting法检测p16、p21和p-eif2α蛋白水平。
[0029]
(e)cck8检测细胞活力。
[0030]
(f-h)免疫荧光检测h2o2处理的骨髓间充质干细胞中p16(f)、p21(g)和(-h2ax(h)阳性细胞。细胞核dapi染色(蓝色)。标尺规格：50μm。
[0031]
(i)p16、p21、γ-h2ax阳性细胞比例统计。数据代表sd平均值。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001；ns代表没有统计学差异。
[0032]
图3：salubrinal促进衰老骨髓间充质干细胞凋亡。
[0033]
(a)骨髓间充质干细胞先用h2o2(25μm)处理3.5天，然后用salubrinal(50μm)处理24h，然后进行细胞凋亡相关分析。
[0034]
(b)annexin v-fitc和pi染色检测凋亡的bmscs，q4象限为早衰比例。
[0035]
(c-e)实时定量pcr分析凋亡标记基因caspase3、bim和bcl211的表达。
[0036]
(f)免疫荧光分析检测p21(红色)和cleaved-caspase3(蓝色)双染色细胞。细胞核用dapi染色(蓝色)。数据代表sd平均值。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001；ns代表没有统计学差异。
[0037]
图4：salubrinal改善老龄samp6小鼠骨骼微结构。
[0038]
(a)5月龄的samp6和samr1小鼠分别给予salubrinal(1mg/kg/天)或生理盐水处理4周，然后进行示意图分析以评估骨完整性。
[0039]
(b-g)取samp6或samr1小鼠股骨和胫骨的骨髓间充质干细胞，采用实时定量pcr检测cdkn1α、cdkn2α、il1α、il6、chop和gadd34的mrna表达。
[0040]
(h-i)samp6和samr1的远端股骨(h)和胸椎(i)的代表性micro-ct重建图像。
[0041]
(j-p)samr1和samp6小鼠远端股骨和椎体显微结构参数：骨体积分数(bv/tv)、小梁厚度(tb.th)、小梁数量(tb.n)、小梁分离度(tb.sp)、皮质面积分数(ct.ar/tt.ar)、平均皮质厚度(ct.th)。
[0042]
(q-r)elisa检测ctx、p1np浓度。数据代表sd平均值。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001；ns代表没有统计学差异。
具体实施方式
[0043]
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044]
salubrinal是有效的选择性eif2α去磷酸化抑制剂。salubrinal作为双特异性磷酸酶2(dusp2)抑制剂，抑制抗胶原蛋白抗体诱导的关节炎。salubrinal具有抗hsv-1病毒的活性，并抑制由hsv-1蛋白icp34.5介导的eif2α的去磷酸化。
[0045]
实施例1：骨髓间充质干细胞的衰老对内质网应激表达的影响
[0046]
本实施例选择h2o2为骨髓间充质干细胞体外衰老的诱导剂，在此基础上观察细胞内质网应激相关指标的改变。旨在探究两者的联系变化。如图1a所示为h2o2(25μm)处理骨髓间充质干细胞诱导细胞衰老。
[0047]
材料与方法：
[0048]
药物及试剂：3％hydrogen peroxide(h2o2)(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)；抗体ire1，p-ire1来自novus biologicals，llc，littleton，co，usa；抗体atf6α，xbp-1来自santa cruz biotechnology，inc.，santa cruz，ca，usa；抗体perk，eif2α，p-eif2α，atf4，chop来自cell signaling technology，inc.，danvers，ma，usa；抗体gadd34来自prot eintech group，rosemont，il，usa；相关引物均来自上海生工生物有限公司；β半乳糖苷酶染色试剂盒来自上海碧云天科技有限公司。
[0049]
实验方法：
[0050]
细胞分组与处理：骨髓间充质干细胞分为对照组以及h2o2(25μm)处理组，处理时间为1/3.5/5天。
[0051]
检测指标：
[0052]
各分组按照规定时间处理完成后进行β乳糖苷酶染色检测细胞衰老状态，利用rt-qpcr、western blot检测内质网应激相关改变的指标。
[0053]
实验结果：
[0054]
如图1b所示中β半乳糖苷酶染色结果中可以看到相对于对照组，h2o2处理之后的染色阳性率有明显的提升。在对非折叠蛋白的三条通路中，如图1c所示观察到atf6和ire1通路的改变不明显，而在如图1d所示中可以观察到perk通路的明显激活状态。相关引物的qpcr结果也提示着相同的趋势如图1(e-j)所示。这些都说明在骨髓间充质干细胞衰老状态下内质网应激的改变是明显的，且集中在perk通路。这也提示着衰老的骨髓间充质干细胞
中内质网应激状态改变的可研究性。
[0055]
实施例2：salubrinal通过持续激活内质网应激状态对细胞衰老状态的影响
[0056]
本实施例选择salubrinal作为内质网应激持续激活药，建立内质网应激持续激活模型，旨在通过持续激活诱导细胞凋亡从而达到清除衰老细胞的目的。如图2a所示为用h2o2(25μm)处理骨髓间充质干细胞3.5天，然后用salubrinal(50μm)处理24小时。
[0057]
材料与方法：
[0058]
实验分组为对照组，衰老模型组(h2o2)以及干预组(h2o2 salubrinal)。
[0059]
检测指标：
[0060]
本实施例利用被β乳糖苷酶染色试剂盒，rt-qpcr、western blot以及免疫荧光技术检测salubrinal介入后骨髓间充质干细胞的衰老状况的改变情况。
[0061]
实验结果：
[0062]
内质网应激持续激活对衰老骨髓间充质干细胞的衰老状态有明显逆转作用。
[0063]
本发明进一步研究了salubrinal其对骨髓间充质干细胞衰老状态的影响。sa-β-gal染色显示，在salubrinal处理后，衰老的骨髓间充质干细胞比例显著降低34.8％。如图2b所示。在salubrinal的作用下，衰老骨髓间充质干细胞中cdkn1α和cdkn2α的mrna水平也受到抑制，并随着sal-ubrinal浓度的增加而进一步降低如图2c所示。同样，在salubrinal处理后，衰老骨髓间充质干细胞中p16和p21的蛋白表达显著降低如图2d所示。同时，经过salubrinal处理后，衰老的骨髓间充质干细胞的增殖活性可有效缓解28.5％。如图2e所示。最后，通过免疫荧光分析检测，p16、p21或γ-h2ax阳性染色的细胞在salubrinal处理的衰老骨髓间充质干细胞中也显著减少如图2(f-i)。上述结果表明，salubrinal可延长衰老骨髓间充质干细胞中eif2信号通路，有效缓解衰老骨髓间充质干细胞的细胞衰老表型。
[0064]
实施例3：salubrinal对衰老骨髓间充质干细胞的凋亡影响
[0065]
本实施例利用salubrinal作为骨髓间充质干细胞的凋亡诱导剂，建立内质网应激持续激活后的凋亡模型，旨在通过salubrinal介入诱导衰老骨髓间充质干细胞的凋亡，从而减轻衰老状态。如图3a所示为骨髓间充质干细胞先用h2o2(25μm)处理3.5天，然后用salubrinal(50μm)处理24h，然后进行细胞凋亡相关分析。
[0066]
材料与方法：
[0067]
实验分组为对照组，衰老模型组(h2o2)以及干预组(h2o2 salubrinal)。
[0068]
检测指标：本实施例利用流式细胞术、rt-qpcr和免疫荧光技术检测衰老骨髓间充质干细胞的凋亡状况。
[0069]
实验结果：
[0070]
chop是参与内质网应激介导的细胞凋亡的关键因子，在salubrinal处理后，骨髓间质干细胞的凋亡显著增加。因此，本发明假设salubrinal处理后，衰老细胞发生凋亡，最终促进了衰老细胞的清除。为了证明，本发明首先用pi-annexinv双染色流式细胞术分析总凋亡细胞。如图3b所示，salubrinal处理后，h2o2诱导的衰老bmscs表现出明显的凋亡趋势，尤其是早期凋亡组比例显著增加了6.2％。与此一致，随着salubrinal浓度的增加，衰老骨髓间充质干细胞中凋亡因子caspase3和bim的mrna水平逐渐升高，而抗凋亡因子bcl211的表达保持在较高水平如图3(c-e)所示。此外，免疫荧光显示，在对照组和衰老bmscs中，cleaved c-aspase3和p21阳性染色的细胞都较少，但在salubrinal处理后显著增加如图3f
所示。这些结果表明，salubrinal促进了衰老骨髓间充质干细胞的凋亡。
[0071]
实施例4：salubrinal介入对早衰小鼠samp6的骨骼状态影响图
[0072]
本实施例利用salubrinal通过腹腔注射介入samp6小鼠，探讨salubrinal介入对samp6小鼠骨骼状态改变的影响，旨在选择一种疗法确切、毒性小的抗衰老性骨质疏松药物。如图4a所示为月龄的samp6和samr1小鼠分别给予salubrinal(1mg/kg/天)或生理盐水处理4周，然后进行示意图分析以评估骨完整性。
[0073]
材料与方法：
[0074]
salubrinal(tocris bioscience，bio-techne china co.ltd.，shanghai，china)
[0075]
3月龄的samp6小鼠和samr1小鼠购于北京大学医学部实验动物学系。所有涉及到动物的程序都在江南大学医学院动物设施中进行。该动物协议经江南大学动物保护与伦理委员会(中国江苏无锡)审查和批准。
[0076]
检疫及适应性饲养8周后随机将动物平均分为四组：对照组(samr1，n＝5)，salubrinal处理对照组(samr1 sal，n＝5)，samp6组(samp6，n＝5)和salubrinal处理samp6组(samp6 sal，n＝5)。samp6小鼠在五月龄时进行药物处理，samr1 sal对照组和samp6 sal组每日皮下注射salubrinal，salubrinal给药浓度为1mg/kg，首先在dmso中溶解至100mg/kg，然后在盐生理水中溶解至最终浓度。samp6组和samr1组给予等体积的载体(生理盐水)。给药方式为腹腔注射，每天注射一次，注射周期为4周。
[0077]
检测指标：
[0078]
对samp6和samr1小鼠的骨骼状态检测包括micro-ct、rt-qpcr以及elisa试验。
[0079]
实验结果：
[0080]
为了进一步测量salubrinal对老龄小鼠骨微结构的体内作用，本发明采用了一种加速衰老的小鼠模型samp6，该模型可加速骨丢失，并伴随衰老相关的骨髓间充质干细胞成骨下降。s-alubrinal治疗可显著降低samp6小鼠骨髓间质干细胞中cdkn1α、cdkn2α、il1α和il6的m-rna的表达，而smar1小鼠的骨髓间质干细胞中则没有如图4(b-e)所示同样，chop和gadd34的mrna水平也在samp6小鼠的骨髓间充质干细胞中上调如图4(f-g)所示。与smar1小鼠相比，samp6小鼠的骨体积显著降低，这可以通过salubrinal给药得到改善如图4(h-i)所示。此外，与对照组相比，salubrinal处理1个月可显著改善脊柱和骨小梁的微结构，股骨骨小梁的改善情况类似如图4(j-n)所示。给药也导致smap6小鼠股骨皮质厚度增加如图4(o-p)所示。小鼠外周血进行骨形成标志物p1np和骨吸收标志物ctx的elisa检测。salubri-nal处理的samp6小鼠的p1np水平高于vehicle处理的samp6小鼠，ctx水平低于vehicle处理的samp6小鼠，而samr1组这两项指标均未发生显著变化如图4(q-r)所示。上述结果提示，salubrinal可改善衰老加速、成骨细胞生成/成骨细胞生成缺陷的samp6小鼠骨骼微结构。
[0081]
实验结论：
[0082]
根据实施例1-4的结果表明，perk-eif2α信号通路在衰老的骨髓间充质干细胞中被特异性激活和紧密调控，进一步揭示了salubrinal是一种潜在的对抗骨髓间充质干细胞衰老的se-nolytic类药物，以改善samp6小鼠的骨质量。因此，salubrinal具有较为良好的对抗骨髓间充质干细胞衰老以及抗衰老型骨质疏松的作用，是一类较好的senolytic类抗衰老药物。