一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基的制作方法

1.本发明涉及培养基技术领域，具体涉及一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基。


背景技术：

2.蝴蝶兰(phalaenopsisb1.spp.)属热带气生兰，其花大，花期长，花色艳丽，色泽丰富，花形美丽别致，如蝴蝶翩翩起舞，因而得名。在热带兰中有“兰花皇后”之美称，是近年来最受欢迎的洋兰之一。
3.目前蝴蝶兰工厂化组织培育快速繁殖方式中均采用添加有琼脂粉的固体培养基进行植物组织培养。具体方法是：在配制好的营养液中添加适量的琼脂粉，加热混合均匀后定容分装到培养瓶中，经高温高压灭菌冷却后形成固体状(类似果冻)培养基，然后将蝴蝶兰继代材料接种于固体培养基上进行增殖培养，当培养到一定时间(一般为30-35天)营养液基本耗尽或褐化较严重时，将材料夹出分切成单芽重新转接到新鲜的固体培养基中继续培养，此后不断重复以上步骤进行增殖培养，当增殖材料达到所需的量时即可将材料转接到生根培养基中培养成完整的植株。
4.由于固体培养基中分子或离子运动较慢，培养物释放出来的醌类物质扩散较慢，大部分都积累在材料基部，褐化严重，影响培养物对养分的吸收，因此降低了材料的增殖率。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，在ms基础培养基基体的配比中加入高浓度的蔗糖，能够提高蝴蝶兰原球茎的转化效率，同时通过添加生长调节基质，能够快速调控蝴蝶兰组织培育组织的分化、育性、种子萌发。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下步骤:
8.步骤一：向ms基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸，混合均匀，得到ms基础培养基基体，备用；
9.步骤二：配制生长调节基质：将甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇，混合均匀，灭菌冷却至室温，制备得到生长调节基质，备用；
10.步骤三：待高温灭菌后的ms基础培养基基体与生长调节基质混合，搅拌均匀，得到该液体培养基。
11.作为本发明进一步的方案：步骤一中，6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭、α-萘乙酸的用量比为5-7g/l:20-25g/l：12-15g/l：1:2g/l:1:2g/l。
12.作为本发明进一步的方案：液体培养基中还包括有机添加物，有机添加物为红葡萄汁与番茄汁的混合物，二者的比例50:1。
13.作为本发明进一步的方案：所述液体培养基的ph值为5.6-6.0。
14.作为本发明进一步的方案：所述ms基础培养基基体需通过120-125℃高温灭菌，灭
菌25-27分钟。
15.作为本发明进一步的方案：步骤三中生长调节基质与ms基础培养基基体混合前需通过无水乙醇进行稀释，且生长调节基质稀释后的浓度为0.5-0.7mg/l。
16.作为本发明进一步的方案：步骤三中，ms基础培养基基体与生长调节基质按照重量比300-600g：200-400mg。
17.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基,包括以下重量份原料：ms基础培养基基体和生长调节基质300-600份和0.2-0.4份；
18.其中生长调节基质包括以下重量份：甲霜灵4-6份、外源tdz1-3份、氯吡苯脲20-30份和油菜素甾醇20-25份。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明通过在ms基础培养基基体的配比中按重量份加入20-25份的遮挡，从而提高ms基础培养基基体中的蔗糖浓度，通过高浓度的蔗糖能够提高蝴蝶兰原球茎的转化效率；
21.本发明中通过在ms基础培养基基体中加入生长调节基质，通过生长调节基质来打破植物组织内在激素的动态平衡，进而引起细胞份强烈分裂，导致细胞体积急剧缩小，使蝴蝶兰原球茎组织再分化，根状茎节间最大程度的缩短，产生大量类似于丛生芽的“芽从”。
具体实施方式
22.对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1
24.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下重量份原料：ms基础培养基基体300份和生长调节基质0.2份；
25.其中，ms基础培养基机体包括以下重量份原料：6-苄氨基嘌呤5份、蔗糖20份、琼脂12份、活性炭1份和α-萘乙酸1份；
26.生长调节基质包括以下重量份原料甲霜灵4份、外源tdz1份、氯吡苯脲20份和油菜素甾醇20份；
27.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下步骤:
28.步骤一：向ms基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸，混合均匀，得到ms基础培养基基体，备用；
29.其中，6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸的重量比为5:20:12:1:1；
30.其中，ms基础培养基基体120℃高温灭菌，灭菌25分钟；
31.其中，ms基础培养基基体的有机添加物中红葡萄汁与番茄汁的重量比为50：1；
32.步骤二：配制生长调节基质：将甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇，混合均匀，灭菌冷却至室温，制备得到生长调节基质，备用；
33.其中，甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇的重量比为4:1:20:20；
34.其中，生长调节基质经无水乙醇稀释后的浓度为0.5mg/l；
35.步骤三：待高温灭菌后的ms基础培养基基体与生长调节基质混合，搅拌均匀，得到
该液体培养基；
36.其中，ms基础培养基基体和生长调节基质按照重量比为300g:200mg。
37.实施例2
38.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下重量份原料：ms基础培养基基体450份和生长调节基质0.3份；
39.其中，ms基础培养基机体包括以下重量份原料：6-苄氨基嘌呤7.5份、蔗糖30份、琼脂18份、活性炭1.5份和α-萘乙酸1.5份；
40.生长调节基质包括以下重量份原料甲霜灵6份、外源tdz1.5份、氯吡苯脲30份和油菜素甾醇30份；
41.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下步骤:
42.步骤一：向ms基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸，混合均匀，得到ms基础培养基基体，备用；
43.其中，6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸的重量比为7.5:30:18:1.5:1.5；
44.其中，ms基础培养基基体123℃高温灭菌，灭菌26分钟；
45.其中，ms基础培养基基体的有机添加物中红葡萄汁与番茄汁的重量比为50：1；
46.步骤二：配制生长调节基质：将甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇，混合均匀，灭菌冷却至室温，制备得到生长调节基质，备用；
47.其中，甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇的重量比为6:1.5:30:30；
48.其中，生长调节基质经无水乙醇稀释后的浓度为0.6mg/l；
49.步骤三：待高温灭菌后的ms基础培养基基体与生长调节基质混合，搅拌均匀，得到该液体培养基；
50.其中，ms基础培养基基体和生长调节基质按照重量比为450g:300mg。
51.实施例3
52.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下重量份原料：ms基础培养基基体600份和生长调节基质0.4份；
53.其中，ms基础培养基机体包括以下重量份原料：6-苄氨基嘌呤10份、蔗糖40份、琼脂24份、活性炭2份和α-萘乙酸2份；
54.生长调节基质包括以下重量份原料甲霜灵8份、外源tdz2份、氯吡苯脲40份和油菜素甾醇40份；
55.一种蝴蝶兰组织培育用液体培养基，包括以下步骤:
56.步骤一：向ms基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸，混合均匀，得到ms基础培养基基体，备用；
57.其中，6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂、活性炭和α-萘乙酸的重量比为10:40:24:2:2；
58.其中，ms基础培养基基体125℃高温灭菌，灭菌27分钟；
59.其中，ms基础培养基基体的有机添加物中红葡萄汁与番茄汁的重量比为50：1；
60.步骤二：配制生长调节基质：将甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇，混合均匀，灭菌冷却至室温，制备得到生长调节基质，备用；
61.其中，甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇的重量比为8:2:40:40；
62.其中，生长调节基质经无水乙醇稀释后的浓度为0.5mg/l；
63.步骤三：待高温灭菌后的ms基础培养基基体与生长调节基质混合，搅拌均匀，得到该液体培养基；
64.其中，ms基础培养基基体和生长调节基质按照重量比为600g:400mg。
65.对比例1
66.本对比例未加入任何和生长调节基质，为空白对照组；
67.对比例2
68.本对比例与实施例1相比，生长调节基质中甲霜灵、外源tdz、氯吡苯脲和油菜素甾醇的用量比为6mg/l:3mg/l：30mg/l:25mg/l；
69.蝴蝶兰原球茎诱导试验方法：
70.s1:切下蝴蝶兰带芽茎段，长约2-3cm，用自来水清洗干净，在饱和漂白粉上清液中浸泡15min；
71.s2：浸泡时不断搅动，浸泡后的茎段用流水冲洗干净，置于超净工作台上，先用75％的酒精消毒30s，无菌水清洗1次，再用0.1％的升汞浸泡10min；
72.s3：经无菌水冲洗数次，将带芽茎段接种到培养基上，调ph为5.8，在光暗交替的情形下进行培养，光照采用白炽灯和蓝光灯同时存在下进行，光暗交替条件为：光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，光照强度为2000-2100lux，培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60％；
73.于30天后，对每一组培养基中的生根情况进行统计，见其表1；
74.表1
[0075][0076][0077]
从上表中，可以看出在ms基础培养基基体添加生长调节基质，对蝴蝶兰组织的分化具有很好的促进作用，使得蝴蝶兰组织的不定芽分化率91.56％-93.68％，而未添加生长调节基质，使蝴蝶兰组织的不定芽分化率35.65％；
[0078]
实施例1和对比比2中的可以看出，高浓度的氯吡苯脲与油菜素甾醇容易引起生物大分子的氧化损伤，导致不定芽分化率降低；
[0079]
具体的：氯吡苯脲与油菜素甾醇相互作用，保证氯吡苯脲在有油菜素甾醇的情况下充分发挥其作用，油菜素甾醇能够调蝴蝶兰组织的分化、育性、种子萌发，而氯吡苯脲的分裂活性强，能够促进蝴蝶兰组织的发育、加速细胞有丝分裂、促进细胞增大和分化；
[0080]
外源tdz能够打破蝴蝶兰组织的休眠期，促进蝴蝶兰组织萌发，促进蝴蝶兰组织的再生和繁殖，同时促进愈伤组织的生长；
[0081]
通过甲霜灵和活性炭的复配添加，能够有效的抑制病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀死病菌，随着水的吸收流动到种子细胞内，能够保证其性能发挥时间长，保证蝴蝶兰组织在组织培养液中拥有健康的培养环境，提高蝴蝶兰的成活率。
[0082]
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。