一种诱导饲用甜菜胚性愈伤组织的方法与流程

1.本发明涉及一种诱导饲用甜菜胚性愈伤组织的方法，属于愈伤组织诱导技术领域。
技术背景
2.甜菜是世界上重要的糖料作物之一，也是我国第二大糖料作物，在中国东北、西北以及华北地区有较大面积的种植，是中国北方重要的经济作物和糖料作物。不同类型的甜菜也具有不同的价值，饲用甜菜是秋、冬、春三季很有价值的多汁饲料，它含有较高的糖分、矿物盐类以及维生素等营养物质，其粗纤维含量低，易消化，是猪、鸡、奶牛的优良多汁饲料。然而，由于甜菜的栽培驯化时间较短，遗传背景狭窄，资源贫乏，自交高度不亲和性，往往使得优良单株基因型很容易丢失，给优良品种选育材料的繁殖和保存带来了不少的困难。且随着分子生物学和植物转基因技术的快速发展，当前利用基因工程技术提高作物品质，培育新品种是作物育种研究的热点之一，而基因工程技术又需要依托组织培养技术的支持，通过诱导植物胚性愈伤组织，将带有目的基因的质粒导入胚性愈伤组织中，利用胚性愈伤组织的再分化能力分化形成完整植株，建立完整的再生体系，形成转基因植株。因此，甜菜胚性愈伤组织的培养及其再生体系的建立就为甜菜基因工程以及培育新的优良品种提供了新途径。
3.根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等，可将愈伤组织分成两大类：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。一般胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学角度来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强，内容物丰富，具有鱼雷胚、心型胚的典型特征，而分化能力差的非胚性愈伤则相反，组织结构疏松，细胞相对巨大，内含一大液泡，几乎无细胞器，呈水浸褐化状。为了获得分化能力更强的愈伤组织，应选择诱导胚性愈伤组织。然而存在诸多因素会影响胚性愈伤组织的形成，因此，亟需寻求一种饲用甜菜胚性愈伤组织的诱导方法。


技术实现要素：

4.本发明为了获得饲用甜菜胚性愈伤组织并建立其再生体系，提供了一种诱导饲用甜菜胚性愈伤组织的方法，包括如下步骤：
5.s1、种子处理及无菌苗的获得：挑取饱满的饲用甜菜种子，去壳，消毒，用蒸馏水反复冲洗后接种于ms基础培养基上使种子萌发，18～22天后获得饲用甜菜无菌苗，采集饲用甜菜无菌苗外植体；
6.s2、愈伤组织的诱导：向ms基础培养基中添加0.5mg/l 6-ba和0.1mg/l naa，作为愈伤组织的诱导培养基，将s1所述无菌苗外植体接种于愈伤组织培养基，培养时间为7～8周。
7.进一步地限定，所述饲用甜菜的品种为利沃夫饲用甜菜。
naa上愈伤组织石蜡切片，外起源胚性细胞，me，multicellular embryos，多细胞原胚团。
具体实施方式：
20.以下具体实施方式中所述ms基础培养基的组成为蔗糖3％，琼脂0.8％，余量为水。
21.以下具体实施方式中所述的利沃夫饲用甜菜、96002-1饲用甜菜和96002-1饲用甜菜均来源于国家甜菜种质中期库。
22.本发明采用传统石蜡切片法对获得的愈伤组织进行石蜡切片的制作，具体包括对材料进行固定、染色、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、展片、脱蜡、封片观察。主要步骤如下：各组织材料用faa固定液固定后置于70％酒精中4℃保存；将固定好的组织材料在爱氏苏木精染液中浸泡染色，时间一般为7～15d。染色之后对材料进行流水冲洗，并在冲洗过程中用显微镜对染色程度进行观察；冲洗完毕后经不同浓度梯度酒精逐渐脱去组织中的水分(一般经过70％酒精、85％酒精、95％酒精脱水后再用100％酒精脱水2次)，每级每次间隔1～2h；后经1/2二甲苯 1/2纯酒精混合液1次；在纯二甲苯中透明两次，每次2h，最后浸蜡、包埋、切片，切片厚度为8μm。
23.实施例1：利沃夫饲用甜菜愈伤组织的诱导
24.(1)种子处理及无菌苗的获得
25.挑选饱满的利沃夫饲用甜菜种子，用研钵磨去外壳，先用75％的酒精消毒2min，再用12％的次氯酸钠消毒5min，之后用蒸馏水反复冲洗4～5次后接种于ms基础培养基上使其萌发，约20d后获得饲用甜菜无菌苗，分别采集饲用甜菜无菌苗的叶柄，叶片和生长点用于愈伤组织的诱导。
26.(2)愈伤组织的诱导
27.以ms基础培养基分别添加
①
0.25mg/l 6-ba；
②
0.5mg/l 6-ba；
③
0.75mg/l 6-ba；
④
0.25mg/l 6-ba 0.1mg/l naa；
⑤
0.5mg/l 6-ba 0.1mg/l naa；
⑥
0.75mg/l 6-ba 0.1mg/l naa作为愈伤组织的诱导培养基，分别对步骤(1)获得的饲用甜菜外植体进行诱导，24℃培养8周后统计愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织外植体数/接种外植体数)
×
100％。
28.实施例2：饲用甜菜96002-1愈伤组织的诱导
29.(1)种子处理及无菌苗的获得
30.挑选饱满的饲用甜菜96002-1种子，用研钵磨去外壳，先用75％的酒精消毒2min，再用12％的次氯酸钠消毒5min，之后用蒸馏水反复冲洗4～5次后接种于ms基础培养基上使其萌发，约20d后获得饲用甜菜无菌苗，分别采集饲用甜菜无菌苗的叶柄，叶片和生长点用于愈伤组织的诱导。
31.(2)愈伤组织的诱导
32.以ms基础培养基分别添加
①
0.25mg/l 6-ba；
②
0.5mg/l 6-ba；
③
0.75mg/l 6-ba；
④
0.25mg/l 6-ba 0.1mg/l naa；
⑤
0.5mg/l 6-ba 0.1mg/l naa；
⑥
0.75mg/l 6-ba 0.1mg/l naa作为愈伤组织的诱导培养基，分别对步骤(1)获得的饲用甜菜外植体进行诱导，24℃培养8周后统计愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织外植体数/接种外植体数)
×
100％。
33.实施例3：黄饲用甜菜愈伤组织的诱导
34.(1)种子处理及无菌苗的获得
35.挑选饱满的黄饲用甜菜种子，用研钵磨去外壳，先用75％的酒精消毒2min，再用12％的次氯酸钠消毒5min，之后用蒸馏水反复冲洗4～5次后接种于ms基础培养基上使其萌发，约20d后获得饲用甜菜无菌苗，分别采集饲用甜菜无菌苗的叶柄，叶片和生长点用于愈伤组织的诱导。
36.(2)愈伤组织的诱导
37.以ms基础培养基分别添加
①
0.25mg/l 6-ba；
②
0.5mg/l 6-ba；
③
0.75mg/l 6-ba；
④
0.25mg/l 6-ba 0.1mg/l naa；
⑤
0.5mg/l 6-ba 0.1mg/l naa；
⑥
0.75mg/l 6-ba 0.1mg/l naa作为愈伤组织的诱导培养基，分别对步骤(1)获得的饲用甜菜外植体进行诱导，24℃培养8周后统计愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(形成愈伤组织外植体数/接种外植体数)
×
100％。
38.对实施例1-3获得的愈伤组织进行评价：
39.(1)对实施例1-3中各处理方法的愈伤组织诱导率、获得的愈伤组织颜色和质地进行统计，结果如表1和图1所示，表中未展示的处理方法则为诱导失败的处理方法。
40.表1不同诱导方法对饲用甜菜愈伤组织诱导的影响
[0041][0042]
从表1结果可以看出，利沃夫甜菜的叶柄外植体在含有0.5mg/l 6-ba和0.1mg/l naa的ms培养基上诱导率最高，达到50％，而黄饲用甜菜和96002-1饲用甜菜均没有得到诱导出的愈伤组织或外植体逐渐褐化死亡，究其原因可能是与培养基的激素浓度以及甜菜的资源品种有关。因此，本研究将叶柄作为诱导愈伤组织的最佳外植体，ms 0.5mg/l 6-ba和0.1mg/l naa作为诱导愈伤组织的最佳培养基。
[0043]
(2)观察甜菜胚性细胞与非胚性细胞的差异与形成过程
[0044]
通过石蜡切片可以观察到利沃夫饲用甜菜叶柄在ms 0.5mg/l 6-ba 0.1mg/l naa上愈伤组织情况，愈伤组织中含有四种不同类型的细胞形态(如图2中的a)，第一类胚性细胞，细胞质浓厚，细胞核位于中间，淀粉粒含量较多，位于分化中心的边缘。第二类胚性细胞，细胞质浓厚，易被染色，细胞核位于边缘且淀粉粒含量较少，一般靠近分化中心，推测已经完成初步分化。第一类非胚性细胞，具有中央大液泡，淀粉粒含量少，几乎不含有细胞器，细胞核位于中央。第二类非胚性细胞，分布在第一类非胚性细胞外围，其内只含有少数细胞质，没有任何其他可供分化的细胞器存在，呈现空泡状。图2中的b为红甜菜资源357叶柄在ms 0.5mg/l 6-ba上愈伤组织情况，该愈伤组织为非胚性细胞(白色箭头代表第一类非胚性细胞，黑色箭头代表第二类非胚性细胞)，以图2中的b作为对比。
[0045]
(3)观察不同资源在不同植物生长调节剂物质处理下甜菜愈伤组织的细胞学形态
[0046]
图3为利沃夫饲用甜菜叶柄在ms 0.5mg/l 6-ba 0.1mg/l naa上愈伤组织的细胞学形态观察图，由该图可知，愈伤组织含有第一、二类胚性细胞，这种细胞体积较小(直径约
15～25μm)，细胞排列及形状较规则且细胞质丰富，细胞质染色深，细胞核较大，具有旺盛的细胞分裂能力。
[0047]
(4)饲用甜菜细胞胚的体发育过程及起源方式
[0048]
经切片观察发现，在利沃夫饲用甜菜胚性愈伤组中观察到甜菜体细胞胚发生方式有外起源和内起源两种方式。如图4中的b所示为外起源的胚性细胞，如图4中的a所示为内起源的胚性细胞，这些胚性细胞形成多细胞原胚团(me)，经切片观察发现，这些早期体细胞胚起初是由胚性愈伤组织的细胞分裂，进而产生多细胞原胚团。多细胞原胚团的细胞排列紧密，形小、胞质浓厚、核较大、具有旺盛的分裂能力，随后持续分裂的多细胞原胚团不断增大，逐渐形成早期体细胞胚。利沃夫饲用甜菜的细胞胚起源方式不同，但都会发展成为胚状体，从而进一步发展为再生的器官。