一种基于高通量测序技术的芽孢杆菌种水平鉴别方法与流程

1.本发明涉及一种基于高通量测序技术的芽孢杆菌种水平鉴别方法，属于分子生物学技术领域。


背景技术：

2.芽孢杆菌能够在大多数自然环境中生存，常常造成食品在获取、加工、处理过程中的污染。常见的种主要包括地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)和解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)。芽孢杆菌具有一层厚的肽聚糖层，提升了对温度、湿度等环境的适应能力；能够在属内或属间形成生物膜以增强其耐药性并大量增殖；通过形成孢子，耐受热加工等常规的杀菌手段。在所有的食品微生物污染中，最难以消除，并造成持续性的影响，导致产品质量的下降和企业的损失。另外，部分种如苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等还能产生肠毒素，造成诸如腹泻、呕吐等食源性疾病。
3.在生鲜乳中，芽孢杆菌造成的污染也时有发生，作为革兰氏阳性菌中的主要嗜冷菌成员，成为低温储存过程中的优势菌。同时其产生的孢子能够在巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌后存活萌发。代谢水解酶是其直接损害手段，该属具有广泛而在种间有差异的蛋白、脂肪水解能力。有研究白表明，其污染能够缩短25％的储存时间。并且其酶活受储存温度、种类影响明显。现有的手段对芽孢杆菌感染显得力不从心，基于对食品工厂实际情况的考量，为防止受污染的原料引入造成更大批量的污染，对芽孢杆菌的快速预前成为防控其造成污染的主流思路。
4.芽孢杆菌对于营养条件的要求不高，因此基于培养的平板菌落计数手段能够很好的评价样品中的芽孢杆菌的数量，但基于培养的方法并不能满足样品检测通量、速度、时效性、灵敏度的要求，同时基于表型进行菌种鉴别
··
准确性也非常低。除此之外，还有对于芽孢所产毒素进行标记物检测的，这种检测虽然准确可靠，但无法实现预警。随着分子生物学的发展，更多分子手段的检测方法被用于该属的检测。有研究者通过一种定量实时pcr来评估牛奶中的孢子浓度，但该方法检测限不够，需要进行二氧化硅磁珠的富集操作，并且这种检测手段存在种间差异性，对蜡状芽孢杆菌的检测极限到达103cfu/ml，但对其他孢子形成菌检测能力则达不到该数量级。另一种等温环介导扩增技术(lamp)能够实现在60分钟内孢子形成菌的识别，但其检测限和特异性过强仅可对吧少数种进行鉴别。有研究者通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(maldi-tof ms)的方法采用生物标记物的方法进行孢子形成芽孢杆菌的鉴定，这种方法检测准确性高，但检测成本和通量无法满足要求。
5.因为芽孢杆菌的广泛危害，过往也有不少对于芽孢杆菌的专利研究。国外的研究中，一项生物试纸条的方法，利用芽孢特异性适配的聚二乙炔脂质体对样品中产芽孢杆菌进行属水平鉴别(kr1020200119737a)。一项韩国的研究，通过mlsa的方法串联4个扩增序列，实现蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的准确检测，这种检测方法虽然能够满足检测限、准确度、灵敏度的要求，但基于mlsa在菌株快速鉴别中分析繁琐、效率低等缺点不能满足快
速检测的需要，且仅能够对两个种进行鉴别限制了检测范围(kr1020120131784a)。另外一项研究则能够将枯草芽孢杆菌及其亚种筛选出来(kr1020170145878)。一项印度的专利使用核糖体dna限制性分析(arda)发现蜡状芽孢杆菌与其他种间存在一条切割位点的差异，从而将其从属内鉴别出来(in2656del2008a)。法国一项研究通过检测以pc-plc为底物的水解反应时间和ph的变化来识别食品中的蜡样芽孢杆菌(fr2950363b1)。
6.国内的一项研究基于抗原-抗体的特异性识别，通过免疫磁分离-elisa的方法实现了果汁中脂环酸芽孢杆菌的鉴别，方法的检测灵敏度高、时效性强。(cn201310254147.9)一项聚焦在蜡状芽孢杆菌，特异性识别的寡核苷酸适配子sp15、sp16实现了高亲和性和特异性、性质稳定、低成本的快速检测(cn104694646b)。尤其值得注意的是，近期的一项研究通过探针法实现了芽孢杆菌属的绝对定量，能够快速对食品、肠道、土壤环境中的芽孢杆菌数量进行确定(cn112501326a)。在这种方法的基础上，如果能够开发一种手段确定属内种间的组成比例，就能够清楚的解析每种芽孢杆菌的绝对量，为芽孢杆菌的分子学检测带来突破。


技术实现要素：

7.本发明通过分子生物学方法获取芽孢杆菌菌种的核心基因序列，在此基础上，对这些核心基因进行比对，筛选到一段具有高度分辨率的核心基因片段siga基因为筛选标记，并结合illumina miseq高通量二代测序检测技术的使用，首次开发了一种芽孢杆菌的种水平快速检测技术。为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明选取siga基因(诱导rna聚合酶附在特定位点上的σ因子)构建数据库。选取该基因上一段双端保守、内部变异度高的片段进行引物设计，并基于此进行高通量测序，测序结果与数据库中相似度最高的种即认为是对应物种，以此进行复杂样品中芽孢杆菌的检测和鉴定。该方法可用于快速、灵敏和特异地检测复杂样品中不同芽孢杆菌的组成。
8.本发明提供了一种鉴定芽孢杆菌种的方法，所述方法是以siga基因片段为标记物，以seq id no.1和seq id no.2所示序列为引物，扩增获得标记物基因片段的菌株为芽孢杆菌。
9.在一种实施方式中，所述标记物基因片段的大小为461～493bp。
10.在一种实施方式中，所述扩增是对含有微生物基因组的对象进行扩增。
11.在一种实施方式中，所述对象包括基因组dna提取物、菌悬液或单菌落。
12.在一种实施方式中，所述基因组dna包括但不限于从食品、空气、水、土壤、人体中提取获得。
13.在一种实施方式中，所述扩增是以含待测样品的基因组dna为模板进行扩增。
14.在一种实施方式中，所述扩增是以单菌落为模板进行扩增。
15.本发明提供了一种鉴定复杂样品中芽孢杆菌种水平组成的方法，所述方法包括：(1)构建芽孢杆菌siga基因标准文库；(2)以seq id no.1和seq id no.2所示序列为引物，对复杂样品基因组中siga基因序列进行扩增；(3)将步骤(2)扩增结果进行回收、建库、测序；(4)将测序结果与步骤(1)构建的芽孢杆菌siga基因标准文库比对，鉴定、分析复杂样品中芽孢杆菌种水平的组成特征。
16.在一种实施方式中，所述芽孢杆菌siga基因标准文库含有genbank数据库中可检
索到的siga基因序列。
17.在一种实施方式中，所述方法包含以下步骤：
18.(1)提取待测样品的基因组dna；
19.(2)设计引物，正向引物如seq id no.1所示，反向引物如seq id no.2所示：
20.正向引物(seq id no.1)：5
’‑
gayccngtycgyatgta-3’，
21.反向引物(seq id no.2)：5
’‑
achggytcytgcgcaat-3’，
22.简并碱基：y(ct)、h(atc)、n(atcg)。
23.本发明提供了一种鉴定芽孢杆菌种的试剂盒，所述试剂盒包含seq id no.1和seq id no.2所示的引物对。
24.在一种实施方式中，所述试剂盒中含有如seq id no.1所示的正向引物和如seq id no.2所示的反向引物。
25.本发明提供了一种筛选芽孢杆菌的方法，将待筛选的样品制成菌悬液，稀释、涂布于固体培养基上，培养至形成单菌落，再以seq id no.1和seq id no.2所示序列为引物，对siga基因的序列进行扩增，扩增获得大小为461～493bp基因片段的菌株为芽孢杆菌。
26.在一种实施方式中，所述固体培养基包括但不限于nb营养肉汁培养基、lb肉汤培养基。
27.本发明的有益效果：与现有方法比较，该方法可以检测到复杂样品中85种芽孢杆菌的鉴别，检测准确率达到100％。本发明的方法可实现高通量鉴定，批量处理菌株信息，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中的芽孢杆菌组成，并且可以鉴定至种水平，分辨能力高于现有方法。因此，基于本方法对于芽孢杆菌进行检测，结果较常规鉴定方法更精准。
28.传统的16s rrna条带为1500bp，要双向测序且需要拼接，而通过基于siga基因的特异性引物扩展目的条带461～493bp，满足illumina miseq的测序读长要求，经过单向鉴定即可完成芽孢杆菌的鉴定。所以，二代测序进行测序的时候，用siga基因作为引物针对复杂样品的鉴定可以节约50％以上的芽孢杆菌鉴定时间和鉴定成本，检测速度和效率更快，检测结果也更准确。
附图说明
29.图1是以siga基因为基础的芽孢杆菌系统发育树。
30.图2是以siga基因为基础设计引物的准确度评价；通过将具有代表性的不同种芽孢杆菌以设计好的不同比例进行混合，然后以所设计引物扩增后进行高通量测序，最后将测序得到的结果与预先混合的不同芽孢杆菌的比例进行对比得到方法的准确度。
31.图3是所选18株芽孢杆菌和6株非芽孢杆菌pcr扩增产物电泳图；其中，使用100bp dna ladder marker，选取9种目标菌属的芽孢杆菌，每种选择2株，分别为1.地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)、2.蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、3.枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、4.苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)、5.解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、6.短小芽孢杆菌(b.pumilus)、7.巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、8.蕈状芽孢杆菌(b.mycoides)、9.炭疽杆菌(b.anthracis)。非目标菌属选取1.黄杆菌(microbacterium maritypicum)、2.大肠杆菌(escherichia coli)、3.发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)、4.粪肠球菌(enterococcus faecalis)、5.金黄葡萄球菌(staphylococcus aureus)、6.荧光芽孢杆菌
(pseudomonas fluorescens)。
32.图4是实施例中牛奶样品中芽孢杆菌种水平构成图。
33.图5是实施例中待测牛奶样品中的pcr扩增产物的电泳检测图，每个样本三个平行。
34.图6是qpcr扩增样品基因组的溶解曲线。
35.图7是基于16s rdna扩增芽孢杆菌及其近缘属分析图。
具体实施方式
36.实施例1：基于芽孢杆菌高分辨率核心基因构建芽孢杆菌特异性引物
37.1、收集并总结了在美国生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)和欧洲分子生物学实验室(european molecular biology laboratory，embl)数据库中有文献报导过、完成了全基因组测序的85种芽孢杆菌，并按其测序完整度每种选取多条、总共下载了总计202条全基因组序列(部分种种内仅包含一株菌，纳入用以后期作为进化树的外枝)采用prokka软件对这些基因组进行重注释，并通过roary软件进行泛基因组分析。通过mega7软件将注释后的基因分别进行系统发育树构建，筛选得到siga基因上一个具有区分不同种的能力的片段。如图1所示，由图可知，根据该基因构建的环形进化树中，各个种能够被分到不同的进化枝中。
38.2、构建siga基因数据库，从ncbi和embl等数据库下载已知芽孢杆菌的siga基因序列，利用所下载序列构建siga基因比对数据库。所构建siga基因序列数据库适用于目前已知的所有芽孢杆菌(表1)。
39.表1芽孢杆菌鉴定基因数据库
40.41.42.43.44.45.46.47.48.49.50.51.52.53.54.55.56.57.58.59.60.61.62.63.64.no.2测序到的芽孢杆菌物种的含量与预先混入的芽孢杆菌物种含量具有很好的一致性，并且能够检测到0.005ng/ml浓度的dna，具有很高的灵敏度。因此，本发明的高通量测序方法在种水平检测芽孢杆菌的能力很强。
87.由上可知，本发明提供的基于高通量测序检测不同种芽孢杆菌的方法适用于对复杂样品的siga基因序列信息与所构建数据库中已知物种的siga基因序列比对，从而得出复杂样品中不同种的芽孢杆菌。
88.实施例4：芽孢杆菌快速检测方法在原料乳样品中的应用
89.具体实施方式参见实施例2，样品为取自奶厂的原料乳中提取的基因组dna，提取时采用美国mp biomedicals公司的dna提取试剂盒进行，具体操作步骤以该试剂盒操作说明书为准。
90.对测序所得siga基因序列信息与所构建数据库(实施例1中构建)进行比对，检测结果如附图4所示，图4展示了样本中芽孢杆菌的组成结构。结果显示，枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、恶臭芽孢杆菌丰度依次降低，另有16种被检测到少量存在，与文献报导相符。
91.上述数据说明，所述方法可以快速、准确的检测原料乳内的芽孢杆菌组成。
92.对比例1
93.过往基于芽孢杆菌及其近缘属的16s rdna序列构建的进化分析将芽孢杆菌属主要分到三个进化簇(2、4、8)，检测精度不高；且这种基于一代测序的方法也无法实现对样本高通量的检测，对多样本的检测耗时、成本高(如图7所示)。
94.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。