上游调控因子IbERF1及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用的制作方法

上游调控因子iberf1及其在调控紫心甘薯ibmyb1表达中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因育种技术领域，具体涉及上游调控因子iberf1及其在调控紫心甘薯ibmyb1表达中的应用。


背景技术：

2.紫心甘薯的块根生长于土壤中，处于完全黑暗状态，但其根或块根内部却能大量积累花色素苷，其花色素苷积累部位具有一定的特殊性。紫心甘薯因其块根中的薯肉富含花青素呈紫色而得名，是一种特用型甘薯品种类型。以紫心甘薯作为试验材料，研究植物地下器官花色素苷生物合成调控机制具有明显的特色和优势：1)紫色甘薯块根中的花青素含量很高，而茎和叶中的含量较低，有的株系甚至仅在块根专一性地积累花青素。2)紫心甘薯的根或块根生长于土壤中，处于完全遮光状态，但其根或块根内部却能大量积累花青素，其花青素积累部位具有一定的特殊性。3)在紫心甘薯中已发现块根色素含量和分布不同的多个品系，资源颇为丰富。4)虽然不同品种紫色甘薯块根中的花青素含量主要是由其基因型所决定，但研究发现栽培条件对其也有一定影响。
3.在植物体内，特定花色素苷是否合成、合成多少及合成部位主要是由其合成途径中多个结构基因的表达水平所决定的，而这一系列结构基因的表达水平又是受转录因子的调控。这些转录因子通过单独或共同作用，激活或者抑制花色素苷生物合成途径中一个或多个基因的表达，从而控制植物体内花色素苷的合成，使植物的花、果或叶呈现不同的颜色。因此，转录因子对合成酶基因的表达调控是植物花色素苷生物合成最为重要的调控环节。在对植物花色素苷的生物合成中，myb蛋白通常与bhlh及wd40蛋白相互作用并形成三元复合体mbw产生协同作用进行调控。
4.花色素是类黄酮家族最大的一个分支，是普遍存在的植物次生代谢产物。根据黄烷骨架上烃基和甲氧基的数目和位置，花色素可以分为六类：花葵素、花青素、花翠素、甲基花青素、牵牛花色素和锦葵色素。研究表明，植物花色素苷是原位合成的，并由一系列的酶催化完成。其中包括：苯基苯乙烯酮合成酶、苯基苯乙烯酮
‑
黄烷酮异构酶、黄烷酮
‑3‑
羟化酶、类黄酮
‑3’‑
羟化酶、类黄酮
‑3’
,5
’‑
羟化酶、二氢黄酮醇还原酶、花色素苷合成酶和udp
‑
葡萄糖类黄酮
‑3‑
氧
‑
葡糖基转移酶。随后，由谷胱甘肽
‑
s
‑
转移酶将花色素苷由细胞质转移至液泡，并储藏于液泡中。
5.在紫心甘薯中，转录因子ibmyb1可以通过与花色素苷合成途径酶基因启动子的直接结合来激活其表达，从而促进花色素苷的合成。myb是含有myb结构域的一类蛋白的统称，是最大的植物转录因子家族。研究发现，myb蛋白含有一段保守的myb结构域，该结构域由1～3个不完全重复序列(r1～r3)构成，能特异性地结合靶基因的启动子。根据r的个数可以将植物的myb蛋白分为4类，分别为只含有一个r(r1/2)蛋白，2个r(r2r3)蛋白，3个r(r1r2r3)蛋白和4个r(4r)蛋白。myb家族中，最常见的是含有两个r基序的r2r3
‑
myb蛋白。此类myb蛋白具有模块化的结构，在其n端分布着高度保守的myb结构域，而其c端变异很大，没
有明显的序列相似性，通常为直接参与增强或抑制调控的结构域。r2r3
‑
myb型转录因子直接与花色素苷生物合成酶基因的启动子区域结合，从而激活其转录表达。r2r3
‑
myb型转录因子在其中扮演着十分重要的角色，是调控植物花色素苷生物合成的核心和关键。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯ibmyb1转录因子表达的上游调控因子。
7.为了解决上述技术问题，本发明首先用trizol法从甘薯块根提取rna，用smart技术逆转录合成双链的cdna，构建紫心甘薯酵母单杂交cdna文库。
8.进一步的，以紫心甘薯块根dna为模板，用takara高保真酶max dna polymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的ibmyb1的启动子dna片段，并将启动子ibmyb1构建到pabai载体中，扩增ibmyb1的启动子dna片段的pcr引物对的具体序列如下所示：
9.pibmyb1
‑
f：5'
‑
ttattacatcaagctaaataaatacgatttg
‑
3'和
10.pibmyb1
‑
r：5'
‑
tatatatattgaagggtgtcggaaattc
‑
3'。
11.构建的pabai
‑
pibmyb1诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活aba最低抑制浓度为400ng/ml。
12.本发明其次将诱饵菌株制成y1hgold感受态细胞，把文库质粒转入pabai
‑
pibmyb1诱感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯ibmyb1基因表达的上游调控因子为iberf1。
13.因此，本发明的第一个目的是提供一种紫心甘薯ibmyb1转录因子的上游调控因子iberf1，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
14.本发明的第二个目的是提供一种上述的上游调控因子iberf1的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
16.本发明的第四个目的是提供一种含有上述的编码基因的转基因细胞系或表达盒。
17.本发明的第五个目的是提供一种上述的上游调控因子iberf1的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：
18.iberf1
‑
f：5'
‑
atgaattcaggattctcctccga
‑
3'和
19.iberf1
‑
r：5'
‑
ttaaaccaagggattaggagtaattg
‑
3'。
20.本发明的第六个目的是提供上述的上游调控因子iberf1在促进紫心甘薯ibmyb1转录因子表达中的应用。
21.本发明的第七个目的是提供上述的上游调控因子iberf1在促进植物花色素苷生物合成中的应用。
22.本发明的第八个目的是提供上述的上游调控因子iberf1在植物高花色素苷品种选育中的应用。
23.进一步的，所述的植物为紫心甘薯。
24.进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子iberf1与启动子ibmyb1结合，将iberf1构建到pgadt7酵母重组表达载体，将pgadt7
‑
iberf1酵母重组表达载体质粒与
pabai
‑
pibmyb1诱饵载体共同转化y1hgold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53abai ad53转化的菌株在sd/
‑
leu/aba培养基上能够生长，而阴性对照pabai
‑
pibmyb1 pgadt7空载转化的菌株不能在sd/
‑
leu/aba培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而pabai
‑
pibmyb1 pgadt7
‑
iberf1在sd/
‑
leu/aba培养基上能够生长(图1)，说明iberf1蛋白能结合在启动子ibmyb1上。
25.本发明再次检测了上游调控因子iberf1是否具有自激活活性，构建pgbkt7
‑
iberf1融合表达载体，构建成功后将融合表达载体转入酵母y2hgold，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养基上生长，挑取阳性单克隆点在组氨酸缺陷培养基上培养，结果显示pgbkt7
‑
iberf1转化的酵母菌株能在组氨酸缺陷培养基上生长，并能使x
‑
α
‑
gal显现蓝色(图2)。说明iberf1蛋白具有自激活活性。
26.进一步的，为了验证启动子ibmyb1与其上游转录因子iberf1的相互作用，本发明将这iberf1构建到过表达载体pgreenii 0029 62
‑
sk上，将测序成功的重组菌液提取质粒后与pibmyb1 pgreenii0800luc重组质粒共同转入拟南芥原生质体中。结果显示iberf1都能够提高ibmyb1启动子的活性(图3)，说明iberf1都能够促进ibmyb1的表达。
27.进一步的，为了明确上游调控因子iberf1的功能，本发明构建了iberf1与绿色荧光蛋白(gfp)的融合蛋白，对iberf1的作用场所进行定位。通过构建亚细胞定位表达载体，瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，pcambia1300
‑
gfp作为阳性对照。空载中的gfp蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，iberf1蛋白在细胞核中表达(图4)，表明iberf1是一个典型的转录因子。
28.本发明的有益效果在于：通过酵母单杂交文库筛选实验，对启动子ibmyb1的上游调控因子的筛选中成功获得了其上游调控因子iberf1。此发明结果在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
附图说明
29.图1为ibmyb1启动子与其上游调控因子iberf1回转验证结果。阳性对照为p53abai ad
‑
53，阴性对照为pibmyb1
‑
pabai ad，阳性菌落(pibmyb1
‑
pabai iberf1
‑
ad)说明相应上游调控因子蛋白(iberf1)能结合在ibmyb1启动子上，ad：pgadt7。
30.图2为ibmyb1启动子上游调控因子iberf1的自激活活性检测。
31.图3为ibmyb1启动子与其上游调控因子iberf1的相互作用。标准差标注于柱状图上，通过单因素方差分析方法检验显著差异，用字母标注在柱状图上面，不同的字母代表差异显著(p＜0.05)。
32.图4为ibmyb1启动子上游调控因子iberf1在拟南芥原生质体的亚细胞定位(标尺20μm)。a：绿色荧光图；b：叶绿体自发荧光；c：明场图；d：叠加图。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化
试剂公司。
34.实施例1：构建紫心甘薯酵母单杂交cdna文库
35.(1)用trizol法从紫心甘薯(品系a5)块根提取rna，用smart技术逆转录合成双链的cdna。
36.(2)扩增得到的cdna要用takara minibest dna fragment purification kit进行纯化处理，使dh2o溶出。
37.(3)对用限制性内切酶sfii酶切后cdna进行过柱处理，再经过pci/ci净化处理，最终使ddh2o溶出。
38.(4)将pgadt7
‑
sfii vector(clontech,货号630490)与适量过柱后cdna用dna ligation kit连接。纯化精制连接液，得到初级cdna文库。
39.(5)通过电转化的方法将少量初级文库连接液转入感受态细胞e.coli hst08；鉴定正确后，取适量的菌液涂布在含amp抗性的lb平板上，37℃培养12h；通过平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。
40.(6)将扩增菌落进行过夜培养，然后进行质粒提取，得到文库质粒。
41.实施例2：构建pabai
‑
pibmyb1诱饵载体
42.(1)以紫心甘薯块根dna为模板，用takara高保真酶max dna polymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的ibmyb1的启动子dna片段，扩增ibmyb1的启动子dna片段的pcr引物对的序列为pibmyb1
‑
f：5'
‑
ttattacatcaagctaaata aatacgatttg
‑
3'和pibmyb1
‑
r：5'
‑
tatatatattgaagggtgtcggaaattc
‑
3'。反应体系(20μl)如下：
[0043][0044]
pcr反应条件为：
[0045][0046]
[0047]
(2)将启动子ibmyb1(序列如seq id no.3所示)构建到pabai载体(柯蕾生物科技有限公司，货号kl
‑
zl
‑
0879)，步骤为：使用takara限制性内切酶quickcut
tm hind iii和quickcut
tm smaⅰ对pabai质粒进行双酶切，合成引物序列见表2中的pm1
‑
f/pm1
‑
r，反应条件为37℃，酶切3h以上，反应体系如下：
[0048][0049]
经电泳检测正确的酶切产物进行切胶回收。
[0050]
使用clon express ii one step cloning kit试剂盒(vazyme)将目的片段和表达载体进行连接，反应条件为37℃，连接30min。反应体系如下：
[0051][0052]
(3)连接产物用于后续转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。
[0053]
大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备(cacl2法)：
[0054]
(1)接种大肠杆菌dh5α到5ml的lb液体培养基中，在37℃下220rpm振荡培养过夜。
[0055]
(2)转移过夜培养的2ml菌液到100ml的lb液体培养基中，继续振荡培养至od
600
到0.5左右，冰上放置30min。
[0056]
(3)取1ml菌液到到新的1.5ml离心管中，4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液。
[0057]
(4)用移液枪吸取1ml预冷的0.1m cacl2悬浮沉淀，轻吹混匀，冰上放置30min。
[0058]
(5)4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液，用移液枪吸取0.2ml预冷的0.1m cacl2悬浮沉淀，冰上放置5h即可用于转化。
[0059]
连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞：
[0060]
(1)取上述制备的大肠杆菌dh5α感受态细胞100μl到新的1.5ml离心管，于超净工作台中加入10μl的dna连接产物，轻弹混匀后在冰上放置30min。
[0061]
(2)将转化产物于42℃水浴锅中热激90s，取出立刻至于冰上5min。
[0062]
(3)加入1ml不含抗性的lb液体培养基，37℃下180rpm振荡培养60～90min。
[0063]
(4)室温5000rpm离心4min，在无菌条件下用移液枪吸走900μl上清液，轻吹重悬剩余200μl液体。
[0064]
(5)将菌液均匀涂布于含有amp的lb固体培养基中，放置30min晾干。
[0065]
(6)37℃培养箱倒置培养12～16h。
[0066]
阳性克隆的筛选与测序鉴定：
[0067]
从培养皿上用无菌小枪头挑取抗性单菌落于含抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养4h，取2μl上述菌液作为模板进行菌落pcr检测。取pcr反应中扩增得到与目的片段大小一致的阳性菌种的菌液200μl，送至上海生工生物有限公司进行测序。测序正确的菌液中加入20％的灭菌甘油于1.5ml离心管中，于
‑
80℃冰箱保存，提取pabai
‑
pibmyb1诱饵质粒。
[0068]
实施例3：pabai
‑
pibmyb1诱饵菌株自激活检测
[0069]
将pabai
‑
pibmyb1诱饵质粒转化y1h酵母菌，得到诱饵菌株。采用自激活试验测试抑制诱饵菌株的最低aba浓度，观察它们在sd/
‑
ura固体培养基上的生长情况，诱饵菌株自激活检测及最低aba浓度的确定方法如下：
[0070]
(1)aba母液的配制：1ml无水乙醇溶解1mg aba，配制成1mg/ml的aba母液，于4℃下避光保存。
[0071]
(2)从y1h[pabai
‑
prey]和y1h[p53abai]的培养皿中挑取较大的单克隆菌落，用10μl的0.9％nacl溶液重悬菌液，将重悬溶液稀释成10
‑1、10
‑2和10
‑3浓度梯度。
[0072]
(3)吸取10μl重悬菌液点在sd/
‑
ura，sd/
‑
ura/aba(100ng/ml～1000ng/ml)培养基上。
[0073]
(4)若在某一浓度下菌落y1h[pabai
‑
prey]不生长，而对照组y1h[p53abai]正常生长，则此浓度为抑制该重组酵母菌株的最低aba浓度，可用于后续实验。
[0074]
注：pabai
‑
prey即为pabai
‑
pibmyb1。
[0075]
经检测，确定pabai
‑
pibmyb1诱饵菌株的自激活aba最低抑制浓度为400ng/ml。
[0076]
实施例4：酵母单杂交文库筛选
[0077]
酵母单杂交文库筛选方法按照clontech公司matchmaker gold yeast one
‑
hybrid library screening system说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
[0078]
(1)取25μl yeastmaker carrier dna于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
[0079]
(2)在已经预冷的10ml离心管中依次加入：2.5ml peg/liac，25μl变性的yeastmaker carrier dna，15μg文库质粒(实施例1得到)，600μl y1hgold感受态细胞(含诱饵表达载体pabai
‑
pibmyb1)，涡旋混匀。
[0080]
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
[0081]
(4)加入160μl dmso，轻柔混匀。
[0082]
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
[0083]
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8ml 0.9％nacl溶液，重悬菌体。
[0084]
(7)吸取200μl转化后的酵母菌液，均匀涂布于sd/
‑
leu、sd/
‑
leu/aba培养皿上，
aba浓度为抑制自激活最低浓度(即400ng/ml)。
[0085]
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
[0086]
挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，鉴定方法参考实施例2，选用通用引物pgadt7f/r对菌液进行pcr检测，pgadt7f/r引物序列见表1，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在ncbi数据库进行blast，对测序结果进行分析。
[0087]
表1主要载体通用引物
[0088][0089]
通过酵母单杂交的方法筛选得到了紫心甘薯ibmyb1基因表达的上游调控因子为iberf1，该上游调控因子iberf1的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。并设计了上游调控因子iberf1的扩增引物为iberf1
‑
f：5'
‑
atgaattcagg attctcctccga
‑
3'和iberf1
‑
r：5'
‑
ttaaaccaagggattaggagtaattg
‑
3'。
[0090]
实施例5：上游调控因子iberf1与启动子ibmyb1结合的验证
[0091]
将iberf1构建到pgadt7酵母重组表达载体(上海联迈生物工程有限公司，货号lm
‑
1639)，选择载体中ecorⅰ和bamhⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的iberf1
‑
adf/iberf1
‑
adr，构建方法参考实施例2。将pgadt7
‑
iberf1酵母重组表达载体质粒与pabai
‑
pibmyb1诱饵载体共同转化y1hgold单杂交酵母菌株中进行酵母单杂交实验。
[0092]
酵母单杂交文库筛选方法按照clontech公司matchmaker gold yeast one
‑
hybrid library screening system说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
[0093]
(1)取25μl yeastmaker carrier dna于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
[0094]
(2)在已经预冷的10ml离心管中依次加入：2.5ml peg/liac，25μl变性的yeastmaker carrier dna，15μg文库质粒，600μl y1hgold感受态细胞，涡旋混匀。
[0095]
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
[0096]
(4)加入160μl dmso，轻柔混匀。
[0097]
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
[0098]
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8ml 0.9％nacl溶液，重悬菌体。
[0099]
(7)吸取200μl转化后的酵母菌液，均匀涂布于sd/
‑
leu、sd/
‑
leu/aba培养皿上，aba浓度为抑制自激活最低浓度(即400ng/ml)。
[0100]
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
[0101]
挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，选用通用引物pgadt7f/r(序列见表1)，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在ncbi数据库进行blast，对测序结果进行分析。
[0102]
结果发现：阳性对照p53abai ad
‑
53(即在pabai载体插入阳性对照53基因序列得到p53abai，在pgadt7载体插入阳性对照53基因序列得到ad
‑
53，构建方法参考实施例2)转化的菌株能够在sd/
‑
leu/aba培养基上生长；而阴性对照pabai
‑
pibmyb1 pgadt7空载转化的菌株不能在sd/
‑
leu/aba培养基上生长；说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。pabai
‑
pibmyb1 pgadt7
‑
iberf1能够在sd/
‑
leu/aba培养基上生长(图1)，说明iberf1蛋白能结合在启动子ibmyb1上。
[0103]
实施例6：检测上游调控因子iberf1的自激活活性
[0104]
将iberf1导入pgbkt7质粒(上海联迈生物工程有限公司，货号lm
‑
8123)中，构建pgbkt7
‑
iberf1融合表达载体，选择载体中ecorⅰ和bamhⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的iberf1
‑
bdf/iberf1
‑
bdr，构建方法参考实施例2。构建成功后将融合表达载体转入y2hgold酵母菌株，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养基(takara cat#630413)上生长，挑取阳性单克隆点在组氨酸缺陷培养基(即sd/
‑
his/aba/x
‑
α
‑
gal plus培养基，takara cat#630415)上培养，结果显示pgbkt7
‑
iberf1转化的酵母菌株能在组氨酸缺陷培养基上生长，并能使x
‑
α
‑
gal显现蓝色(图2)。以上结果说明iberf1蛋白具有自激活活性。
[0105]
实施例7：双荧光素酶报告系统载体的构建
[0106]
将上游调控因子iberf1的基因序列构建到过表达载体pgreenii 0029 62
‑
sk(上海钦城生物科技有限公司，货号qcp0465)上，称之为效应质粒，将pibmyb1插入到载体pgreenii0800
‑
luc(柯蕾生物科技有限公司，货号kl
‑
zl
‑
0808)荧光素酶的前端作为报告质粒。选择pgreenii 0029 62
‑
sk载体中sac i和xho i及pgreenii 0800
‑
luc载体中的kpn i和nco i作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2中的ibpm1
‑
0800f/ibpm1
‑
0800r以及iberf1
‑
62
‑
skf/iberf1
‑
62
‑
skr，构建方法参考实施例2。
[0107]
实施例8：拟南芥原生质体的制备及转化
[0108]
1、拟南芥原生质体的制备步骤如下：
[0109]
(1)配制酶解液于55℃水浴锅中预热。
[0110]
(2)选择四周后抽苔前的野生型拟南芥叶片，将叶片下表皮撕掉后迅速放入酶解液中。
[0111]
(3)25℃，50rpm避光振荡酶解50min，至叶肉细胞酶解完全，可在显微镜下观察原生质体的形态，当细胞较圆、透亮时状态比较好。
[0112]
(4)用等体积的w5溶液稀释酶液，轻轻混匀，用清水洗干净75μm的尼龙网布，然后将其用w5溶液浸湿后过滤原生质体。
[0113]
w5溶液的配制(100ml)：
[0114][0115]
(5)800rpm离心2min，尽量吸去上清，用1ml w5溶液重悬原生质体(重复此步骤三次)。
[0116]
(6)将原生质体重悬于1ml w5溶液中，然后冰上放置30min备用。
[0117]
2、拟南芥原生质体的转化步骤如下：
[0118]
(1)2ml ep管中加入10～20μg的目的质粒(实施例7构建的iberf1
‑
pgreenii 002962
‑
sk重组质粒和pibmyb1
‑
pgreenii 0800
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luc重组质粒)，加入100μl的拟南芥原生质体，轻轻混匀，加完后立即放冰上。
[0119]
(2)加入110μl peg/cacl2，轻弹离心管使之混匀，室温孵育10min。
[0120]
(3)在冰上加入220μl w5溶液，颠倒离心管使其混匀，冰上放置1min。
[0121]
(4)再次向离心管加440μl w5溶液，轻轻颠倒，冰上放置1min。
[0122]
(5)最后向离心管加880μl w5溶液，颠倒混匀，冰上放置1min。
[0123]
(6)4℃800rpm离心3min，吸去上清。
[0124]
(7)原生质体用500μl w5溶液重悬，22℃黑暗条件下培养16～20h。
[0125]
实施例9：双荧光素酶报告系统的检测
[0126]
使用reporter assay(promega)检测luc和ren两种荧光素酶活性，具体步骤如下：
[0127]
(1)100μl 1
×
plb裂解液的制备：20μl 5
×
passive lysis buffer加水至100μl。10ml lar ii的制备：吸取10ml冰上融化的luciferase assay buffer ii加入到luciferase assay substrate中，轻轻摇晃使之溶解(
‑
20℃可放置一个月，
–
70℃可放置一
年)。100μl stop&reagent的制备：吸取100μl stop&buffer，加入2μl 50
×
stop&substrate，可稍微涡旋使其混匀(在
‑
20℃可放置15d)。
[0128]
(2)取实施例8转化后的拟南芥原生质体溶液，4℃，13200rpm离心90s，除去w5溶液。
[0129]
(3)加入100μl1
×
plb裂解液，轻轻吹打混匀后转移至24孔板中，置于水平摇床，室温低速晃动15min。
[0130]
(4)收集裂解液，转移至1.5ml离心管中，4℃13200rpm离心10min，取上清液60μl置冰上待测荧光素酶。
[0131]
(5)避光条件下，在黑色的96孔酶标板中加入100μl lar ii，然后加入20μl细胞裂解液，用枪头轻轻混匀2～3次，避免产生气泡。
[0132]
(6)放入酶标仪中检测luc的酶活性，并记录数据。
[0133]
(7)取出96孔板，在同一孔中加入100μlstop&reagent，用枪头轻轻混匀2～3次，整个操作过程要避免强光照射。
[0134]
(8)放入酶标仪中检测ren的酶活性并记录数据。
[0135]
(9)实验重复3次，取平均值，通过对比不同样品的luc/ren的比值，检测转录因子对启动子的激活作用。
[0136]
结果显示：iberf1能够提高ibmyb1启动子的活性(图3)，说明iberf1能够促进ibmyb1的表达。
[0137]
实施例10：明确上游调控因子iberf1的功能
[0138]
构建了iberf1与绿色荧光蛋白(gfp)的融合蛋白，对iberf1的作用场所进行定位。将上游调控因子iberf1的基因序列构建到亚细胞定位表达载体pcambia1300(上海联迈生物工程有限公司，货号lm1375)上，选择pcambia1300载体中bamhⅰ和hindⅱ作为目的片段插入的酶切位点，设计包含起始密码子不包含终止密码子的特定引物，合成引物序列见表2中的iberf1
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1300f/iberf1
‑
1300r，构建方法参考实施例2。然后将iberf1
‑
pcambia1300瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，以pcambia1300
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gfp作为阳性对照。空载中的gfp蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，iberf1蛋白在细胞核中表达(图4)，表明iberf1是一个典型的转录因子。
[0139]
表2构建载体使用引物序列(下划线为酶切位点)
[0140][0141]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。