纺织品染色工艺的制作方法

1.本发明涉及纺织品染色工艺，特别是使用酶对纺织品进行染色。本发明还涉及用于生产隐色靛蓝和/或靛蓝和/或其衍生物的方法。


背景技术：

2.瓮染料是不溶性染料，需要还原剂才能溶解在水中。通常，用瓮染料染色包括将染料以其可溶的还原形式施加到纺织品上，随后将染料氧化回不溶的形式，从而赋予纺织品颜色。
3.靛蓝是一种式i的瓮染料：
[0004][0005]
用诸如卤素、烷基、烷氧基、氨基、芳基、芳氧基和羰基的基团在靛蓝芳环上取代，可提供除蓝色以外的多种颜色的化合物，并且其是所谓的靛蓝衍生物。
[0006]
靛蓝及其衍生物通常被还原为其隐色(leuco)形式(即，隐色靛蓝)，它是水溶性的，以便应用于待染色的纺织品。因此，隐色靛蓝(也称为白靛蓝)是靛蓝的还原的、水溶性形式。
[0007]
在目前可用的工业染色工艺中，靛蓝用还原剂处理以获得包含隐色靛蓝的水溶液，随后将其施加到纺织品。然后通过将隐色靛蓝在纺织品上氧化来获得靛蓝。将隐色靛蓝氧化成靛蓝可以例如通过将用隐色靛蓝处理的织物暴露于空气中，使得隐色靛蓝通过与空气中的氧气反应而被氧化。
[0008]
目前可用的染色工艺有几个缺点。
[0009]
如上所述，为了获得隐色靛蓝，靛蓝用还原化学试剂处理。目前可用的还原化学试剂通常是刺激性化学品，即对使用者和/或环境有害的化学品，诸如氢氧化钠和连二亚硫酸钠。
[0010]
另外，织物和纺织品通常可能因长时间和/或反复暴露于强碱性条件而损坏。
[0011]
此外，在传统的染色工艺中使用了大量的还原盐和氢氧化物，因此产生大量废水，其必须在废弃之前进行处理，从而增加了染色工艺的成本。


技术实现要素：

[0012]
本发明的一个目的是解决上述问题并提供一种安全、成本效益高且环境友好的纺织品染色工艺。
[0013]
本发明的另一个目的是提供一种快速、有效且易于实施的纺织品染色工艺。
[0014]
本发明的又一个目的是提供一种相对于传统工艺而言可持续的纺织品染色工艺。
[0015]
上述目的以及其他目的通过本发明而实现，本发明提供权利要求1的工艺，即一种对纺织品进行染色的工艺，该工艺包含至少两个酶促反应以酶促产生隐色靛蓝和/或靛蓝衍生物的隐色形式。
[0016]
本发明还涉及权利要求16的染色纺织制品，即根据本发明的工艺可获得的染色纺织品；涉及权利要求17的通过酶促合成产生隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的方法；涉及权利要求21的装置；以及涉及权利要求23的单加氧酶。
[0017]
本发明的优选实施方案是从属权利要求2至14、18至20和22的目标。
附图说明
[0018]
图1是本发明工艺的一个实施方案的示意图；
[0019]
图2是本发明工艺的另一个实施方案的示意图。
具体实施方式
[0020]
本发明涉及一种纺织品染色工艺，包含以下步骤：
[0021]
a)在至少一种氧化酶的存在下羟基化吲哚或吲哚衍生物，以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物；
[0022]
b)在至少一种还原酶的存在下将所述吲哚酚或所述吲哚酚衍生物转化为隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式；
[0023]
c)将至少所述隐色靛蓝或所述靛蓝衍生物的所述隐色形式提供至纺织品的至少一部分；以及
[0024]
d)氧化所述隐色靛蓝或所述靛蓝衍生物的所述隐色形式的至少一部分，从而在所述纺织品上产生靛蓝或靛蓝衍生物，以对所述纺织品的至少一部分进行染色。
[0025]
令人惊讶地发现，通过本发明的工艺，可以对纺织品进行染色并避免或基本上避免刺激性化学品的使用。
[0026]
此外，已经令人惊讶地发现，通过本发明的工艺，可以在纺织品上产生诸如靛蓝的不溶性染料，同时避免或基本上避免不溶性染料在反应混合物中的沉淀，该反应混合物即含有酶的混合物。
[0027]
特别地，已经观察到，从吲哚或吲哚衍生物开始，使用至少一种氧化酶和至少一种还原酶，可以以快速且有效的方式获得隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式，并基本上避免或避免不溶性染料在反应混合物中的沉淀。不受特定科学解释的束缚，该工艺可能涉及吲哚酚二聚化成靛蓝，并通过还原酶立即将靛蓝还原为其隐色形式。除了野生型还原酶之外，适当地遗传修饰的还原酶可以被工程化以使靛蓝在反应器中沉淀之前将其还原。
[0028]
有利地，不受特定科学解释的束缚，已经观察到，从吲哚或其衍生物开始，通过本发明的工艺，可以产生几种不同的染料及其隐色形式，从而避免刺激性化学品的使用，例如连二亚硫酸钠、氢氧化钠和溶剂。
[0029]
根据一个方面，本发明的工艺允许生产染色纺织品。
[0030]
通过本发明的工艺获得的染色纺织品可以具有多种颜色。事实上，有利的是，通过改变本发明工艺中的试剂(例如，吲哚或其衍生物)，可以通过酶促反应获得不同的染料及其隐色形式，从而可以将不同的最终颜色赋予纺织品。
[0031]
同样有利的是，适用于本发明工艺的试剂成本低，因此相对于目前可用的染色工艺而言，本发明的工艺特别具有成本效益。
[0032]
根据一个方面，如上所述，本发明的工艺包括在至少一种氧化酶的存在下羟基化吲哚或吲哚衍生物以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物的步骤。随后，将吲哚酚和吲哚酚衍生物分别转化为隐色靛蓝和靛蓝衍生物的隐色形式。如上所述，不受特定科学解释的束缚，该工艺可能涉及吲哚酚二聚化成靛蓝，并通过还原酶立即将靛蓝还原为其隐色形式。
[0033]
如本文中所使用，术语“隐色靛蓝”指代靛蓝的还原形式。根据本说明书，术语“隐色靛蓝”涵盖存在于反应混合物中的形式的隐色靛蓝以及存在于包括用于纺织品染色的隐色靛蓝的水溶液中的隐色靛蓝。这样的反应混合物和水溶液可以包括任何合适浓度的隐色靛蓝；特别地，在待储存的反应混合物和溶液中隐色靛蓝的浓度很高，并且通常高于在适合于对纺织品进行染色的反应混合物和水溶液中的隐色靛蓝的浓度。
[0034]
如本文中所使用，术语“吲哚衍生物”、“吲哚酚衍生物”、“靛蓝衍生物”、“靛蓝衍生物”和“靛蓝衍生物的隐色形式”分别指代被一个以上取代基取代的吲哚、吲哚酚、靛蓝和靛蓝的隐色形式，例如被以下取代：在选自吲哚或吲哚酚的4、5、6和7位以及靛蓝的4、4'、5、5'、6、6'、7和7'位的任何位置的一个以上碳上的一个以上基团，和/或吲哚、吲哚酚或靛蓝的氮原子上的基团。取代一个以上碳的一个以上基团可以是以下基团：诸如但不限于卤素基团、烷基基团、烷氧基基团、芳基基团、芳氧基基团、氨基基团、硝基基团和羰基基团。取代氮原子的基团可以是以下基团：诸如但不限于烷基基团、芳基基团和酰基基团。因此，吲哚衍生物可以是例如4-氯吲哚、5-氯吲哚、6-氯吲哚、7-氯吲哚、5-溴吲哚、6-溴吲哚、5-硝基吲哚、5-羟基吲哚、5-甲基吲哚、5-甲氧基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5-氨基吲哚、1-甲基吲哚、吲哚-6-甲醛；并且吲哚酚衍生物可以是例如4-氯吲哚酚、5-氯吲哚酚、6-氯吲哚酚、7-氯吲哚酚、5-溴吲哚酚、6-溴吲哚酚、5-硝基吲哚酚、5-羟基吲哚酚、5-甲基吲哚酚、5-甲氧基吲哚酚、6-甲基吲哚酚、7-甲基吲哚酚、5-氨基吲哚酚、1-甲基吲哚酚、吲哚酚-6-甲醛。任何其他的吲哚和吲哚衍生物可以用于本发明的工艺，只要这些吲哚衍生物可以通过酶促氧化反应并转化为相应的吲哚衍生物即可。这些吲哚酚衍生物在二聚时提供相应的靛蓝衍生物，它们各自具有不同的颜色。如本文中所使用，术语“靛蓝衍生物”还指代不对称靛蓝，即源自两种不同的吲哚酚衍生物的二聚化的靛蓝或源自吲哚酚与吲哚酚衍生物的二聚化的靛蓝。根据本发明的工艺，当使用了两种以上不同的吲哚衍生物或吲哚与一种以上吲哚衍生物时，可以实现利用不对称靛蓝对纺织品的染色。例如，当使用两种不同的吲哚衍生物或吲哚与吲哚衍生物时，获得两种不同的吲哚酚衍生物或吲哚酚与吲哚酚衍生物。有利地，当使用这两种不同的吲哚酚衍生物或吲哚酚与吲哚酚衍生物时，获得三种不同的靛蓝衍生物(即两种不同的对称靛蓝衍生物和一种不对称靛蓝衍生物)，从而可以利用多于一种染料对纺织品进行染色，特别是通过将这些靛蓝衍生物的隐色形式提供至纺织品，并氧化所述衍生物以在纺织品上产生染料。
[0035]
根据实施方案，吲哚衍生物为6-溴吲哚，并且所述靛蓝衍生物为泰尔紫。
[0036]
如本文中所使用，术语“氧化酶”指代能够催化其底物的氧化的任何酶。适用于本发明工艺的氧化酶是本领域已知的。合适的酶是单加氧酶，优选为含黄素单加氧酶(fmo)，更优选为微生物含黄素单加氧酶(mfmo)。例如，合适的单加氧酶是aminisulfidivorans噬甲基菌(methylophaga aminisulfidivorans)的mfmo。另一种合适的单加氧酶是
nitrincola lacisaponensis的fmo(nifmo)。或者，单加氧酶可以是baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)。单加氧酶，特别是fmo和mfmo，提供良好的吲哚及其衍生物的转化率，因此适用于本发明的工艺。baeyer-villiger单加氧酶(bvmo)与fmo具有密切的同源性，因此也适用于本发明的工艺。如本文中所使用，术语“氧化酶”还涵盖基因修饰的氧化酶，例如经基因修饰以改善酶特性的氧化酶，酶特性诸如氧化酶的底物的氧化效率。
[0037]
不受特定科学解释的束缚，已观察到适用于本发明工艺的氧化酶催化吲哚和/或吲哚衍生物的羟基化，以提供吲哚酚和/或相应的吲哚酚衍生物。
[0038]
吲哚酚和吲哚酚衍生物分别二聚成靛蓝和靛蓝衍生物。换言之，吲哚酚(或吲哚酚衍生物)向靛蓝(或靛蓝衍生物)的转化通过二聚化自发发生。
[0039]
如上所述，根据本发明的工艺，吲哚酚和/或吲哚酚衍生物在至少一种还原酶的存在下被转化以获得隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式。不受特定科学解释的束缚，该工艺可能涉及吲哚酚二聚化成靛蓝，并通过还原酶立即将靛蓝还原为其隐色形式。
[0040]
如本文中所使用，术语“还原酶”指代能够催化其底物的还原的任何酶。适用于本发明工艺的还原酶是本领域已知的。合适的酶是还原酶，优选为偶氮还原酶，更优选为黄素依赖性偶氮还原酶。例如，适用于本发明工艺的nadh和黄素依赖性偶氮还原酶是来自芽孢杆菌属的azoa，它本身是一种已知的酶，参见suzuki等人“来自嗜碱芽孢杆菌属的偶氮还原酶ao1催化靛蓝还原(azoreductase from alkaliphilic bacillus sp.ao1 catalyzes indigo reduction)”，applied microbiology and biotechnology(2018)102:9171-9181。例如，合适的还原酶是和光芽孢杆菌(bacillus wakoensis)的azoa还原酶，其具有序列mtkvlyitahphddtqsfsmavgkafidtykevnpdhevetidlyiediphidvdvfsgwgklrsgqgfdqlssdekakvgrlselceqfvsadkyifvsplwnfsfppvlkayidsvavagktfkyteqgpvglltdkkalhiqarggiysegpaaqmemghrylsiimqffgvpsfdglfveghnampdkaqeikekavarakdlahtf(seq.id no.4)。根据实施方案，合适的还原酶可以具有相对于seq.id no.4具有至少80％的序列同一性的序列。如本文中所使用，术语“还原酶”还涵盖基因修饰的还原酶，例如经基因修饰以改善酶特性的还原酶，酶特性诸如还原酶的底物的还原效率。
[0041]
如上所述，已经观察到，从吲哚酚和/或吲哚酚衍生物开始，在至少一种还原酶的存在下，可以获得隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式。
[0042]
根据一个方面，本发明的工艺包括向纺织品的至少一部分提供至少隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的步骤，其中隐色靛蓝和靛蓝衍生物的隐色形式是酶促获得的，即通过酶促反应获得的。在将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)提供至纺织品的至少一部分之后，氧化隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)，从而在织物上产生靛蓝或靛蓝衍生物。纺织品，以获得至少部分染色的纺织品。
[0043]
可根据已知方法进行隐色靛蓝和/或隐色靛蓝衍生物的氧化。例如，纺织品可以用包括隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的溶液浸渍，然后暴露于空气。这种暴露于空气允许隐色靛蓝向靛蓝的氧化。这种氧化在纺织品上发生，从而导致纺织品的染色。
[0044]
如本文中所使用，术语“纺织品”、“纺织品”和“纺织制品”指代能够被例如靛蓝和/或其衍生物染色的任何纤维、纱线、绳、织物和/或服装。在实施方案中，纺织品材料可以包括天然纤维，诸如源自动物或植物的纤维，例如棉、亚麻、丝绸、羊毛纤维及其混合物。在实施方案中，纺织品材料可以包括合成纤维，例如聚酯、人造丝、尼龙、莱卡及其混合物。在实
施方案中，纺织品可以包括天然和合成纤维的混合物。例如，合适的纺织品可以是弹性棉织物或服装。在实施方案中，纺织品中可以包括再生纤维或纱线，作为天然和/或合成纤维和纱线的补充或替代。在本说明书中，再生纱线是包括再生纤维的纱线。再生纤维或人造纤维是可商购的。例如，合适的再生纤维可以选自人造丝、莱赛尔纤维、莫代尔纤维、粘胶纤维、竹纤维以及其混合物。此外，所述纱线可以通过任何已知方法制造，并且所述织物也可以通过任何已知方法制造，诸如机织、针织、钩编、打结和毡化。此外，所述服装可以是任何服装，诸如牛仔裤、衬衫、休闲服装等。
[0045]
根据实施方案，本发明的工艺还包含在至少一种色氨酸酶的存在下转化色氨酸或色氨酸衍生物以获得吲哚或吲哚衍生物的步骤。换言之，色氨酸和/或色氨酸衍生物可以用作本发明工艺中的起始材料(即起始底物)，以酶促生产吲哚或吲哚衍生物。因此，色氨酸和/或色氨酸衍生物可以用作起始材料(即起始底物)以通过多个酶促反应获得隐色靛蓝和/或靛蓝衍生物的隐色形式。
[0046]
色氨酸酶(系统名称：l-色氨酸吲哚裂解酶(脱氨基；形成丙酮酸))本身是已知的酶，其切割色氨酸的碳-碳键，释放吲哚。它们可以使用磷酸吡哆醛(plp)作为辅因子。根据本发明的实施方案，plp可以可选择地用于提高色氨酸或其衍生物由色氨酸酶催化的酶促转化的产率。适用于本发明工艺的色氨酸酶是本领域已知的。例如，适用于本发明方法的色氨酸酶是大肠杆菌的色氨酸酶。
[0047]
如本文中所使用，术语“色氨酸衍生物”指代被如上文公开的一个以上取代基取代的色氨酸，参照吲哚、吲哚酚、靛蓝和隐色-靛蓝衍生物并加以必要的变通。例如，色氨酸衍生物可以是色氨酸的卤代衍生物，即卤代色氨酸(例如，6-溴色氨酸)。
[0048]
根据实施方案，色氨酸衍生物为卤代色氨酸，并且本发明的工艺进一步包含在至少一种色氨酸卤化酶和卤素源的存在下卤化色氨酸以获得所述卤代色氨酸的步骤。
[0049]
根据实施方案，色氨酸衍生物是6-溴色氨酸(即，卤代色氨酸)并且靛蓝衍生物是泰尔紫。
[0050]
色氨酸卤化酶本身是已知的能够催化色氨酸在不同位置的卤化的酶。色氨酸卤化酶通常是黄素依赖性卤化酶，即它们通常使用fad或fadh2作为辅因子。适用于本发明工艺的色氨酸卤化酶是本领域已知的。例如，适用于本发明工艺的色氨酸卤化酶是色氨酸卤化酶，例如紫黑链霉菌(streptomyces violaceusniger)的色氨酸卤化酶。
[0051]
根据实施方案，色氨酸卤化酶是紫黑链霉菌的菌株spc6的色氨酸卤化酶。
[0052]
例如，色氨酸卤化酶可以具有以下序列：lnnvvivgggtagwmtasylkaafgdriditlvesghigavgvgeatfsdirhffeflglkekdwmpacnatyklavrfenwrekghyfyhpfeqmrsvngfpltdwwlkqgptdrfdkdcfvmasvidaglsprhqdgtlidqpfdegademqgltmsehqgktqfpyayqfeaallakyltkysvergvkhivddvrevslddrgwitgvrtgehgdltgdlfidctgfrglllnqaleepfisyqdtlpndsavalqvpmdmerrgilpcttataqdagwiwtipltgrvgtgyvyakdylspeeaertlrefvgpaaadveanhirmrigrsrnswvkncvaiglssgfveplestgiffihhaieqlvknfpaadwnsmhrdlynsavshvmdgvreflvlhyvaakrndtqywrdtktrkipdslaeriekwkvqlpdsetvypyyhglppysymcillgmggielkpspalaladggaaqrefeqirnktqrltevlpkaydyftq(seq.id no.1)。
[0053]
这种类型的色氨酸卤化酶优选地催化色氨酸的6位的碳的卤化，由此它适合于根据本发明的方法产生泰尔紫(6,6'-二溴靛蓝)。
[0054]
根据实施方案，合适的色氨酸卤化酶可以具有相对于seq.id no.1具有至少80％的序列同一性的序列。
[0055]
适合于本发明方法的另一种色氨酸卤化酶是色氨酸卤化酶prna，优选为荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的prna，其优选地在色氨酸的5或7位的碳上催化色氨酸的卤化。
[0056]
例如，色氨酸卤化酶(prna)可以具有以下序列：mnkpiknivivgggtagwmaasylvralqqqvnitliesaaiprigvgeatipslqkvffdflgiperewmpqvngafkaaikfvnwrkppdhsrddyfyhlfgsvpncdgvplthywlrkreqgfqqpmeyacypqpgaldgklapclldgtrqmshawhfdahlvadflkrwavergvnrvvdevvevrlndrgyistlltkegrtlegdlfidcsgmrgllinqalkepfidmsdyllcdsavasavpnddvregvepytsaiamnsgwtwkipmlgrfgsgyvfsskftsrdqatadflnlwglsdnqslnqikfrvgrnkrawvnncvsiglsscfleplestgiyfiyaalyqlvkhfpdtsfdprlsdafnaeivymfddcrdfvqahyfttsredtpfwlanrhelrlsdaikekvqrykaglpltttsfddstyyetfdyefknfwlngnyycifaglgmlpdrslpllqhrpesiekaeamfasirreaerlrtslptnydylrslrngdagqsrnqrgptlaakegl(seq.id.no.2)。
[0057]
根据实施方案，合适的色氨酸卤化酶可以具有相对于seq.id no.2具有至少80％的序列同一性的序列。
[0058]
根据实施方案，色氨酸卤化酶可以是基因修饰的酶；换言之，色氨酸卤化酶可以是突变形式。例如，色氨酸卤化酶可以是紫黑链霉菌的菌株spc6的色氨酸卤化酶的突变形式，或色氨酸卤化酶prna的突变形式。
[0059]
如本文中所使用，术语“卤代衍生物”指代在5、6、7和8位(以及靛蓝的5'、6'、7'和8'位)的一个以上碳原子上被卤素原子，特别是氟、氯、溴或碘原子取代的任何色氨酸、吲哚、吲哚酚和靛蓝。例如，色氨酸的卤代衍生物可以是6-溴色氨酸和7-氯色氨酸，吲哚的卤代衍生物可以是6-溴吲哚和7-氯吲哚，吲哚酚的卤代衍生物可以是6-溴吲哚酚和7-氯吲哚酚，靛蓝的卤代衍生物可以是泰尔紫(即6,6'-二溴靛蓝)和7,7'-二氯靛蓝。
[0060]
色氨酸卤化酶在卤素源存在下将色氨酸转化为色氨酸的卤代衍生物，即卤代色氨酸。适用于本发明工艺的卤素源是例如卤素盐，即其中阴离子为卤素离子的盐。合适的卤素盐是例如镁、银、钠、钾、锂和钙的卤素盐，例如nacl、kcl、ki、licl、cucl2、cubr2、agcl、cacl2、cabr2、clf、mgcl2、mgbr2、kbr等。
[0061]
根据实施方案，隐色靛蓝和/或靛蓝衍生物的隐色形式的酶促生产作为一锅法在单个反应器中进行。
[0062]
换言之，根据实施方案，至少在至少一种氧化酶的存在下羟基化吲哚或吲哚衍生物以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物的步骤，以及所述在至少一种还原酶的存在下将所述吲哚酚或所述吲哚酚衍生物转化为隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的步骤，作为一锅法进行。
[0063]
如本文中所使用，术语“一锅法”指代其中对一种以上反应物在同一反应器中进行连续的酶促和/或非酶促反应的工艺。有利地，一锅法允许基本上避免或避免中间化合物的分离和纯化过程，由此节省时间和资源，同时提高工艺的总产率。
[0064]
根据实施方案，本发明的工艺可以通过在同一反应器中提供混合物作为一锅法进行，该混合物特别是水性混合物，包括例如吲哚(或吲哚衍生物)、氧化酶、还原酶和合适的辅因子，如果需要的话。在此情形中，吲哚(或吲哚衍生物)被氧化酶羟基化，由此获得吲哚
酚(或吲哚酚衍生物)，其在还原酶的存在下被转化为隐色靛蓝(或衍生自吲哚酚衍生物的靛蓝衍生物的隐色形式)。
[0065]
根据实施方案，可将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)提供至纺织品，例如，通过将纺织品浸入含有隐色靛蓝的反应器中，即，浸入其中发生吲哚向隐色靛蓝的酶促转化的反应器中。
[0066]
有利地，本发明的纺织品染色工艺可以在水性介质中进行。可以将纺织品浸入含有隐色靛蓝以及用于产生所述隐色靛蓝的酶的反应器中，以利用隐色靛蓝溶液浸渍。
[0067]
根据一个方面，本发明的工艺涉及多个酶促反应，其优选在水性介质中作为一锅法进行。有利地，可以根据所使用的酶和试剂调整工艺条件，例如温度、ph、持续时间。
[0068]
根据实施方案，本发明的工艺可以通过在同一反应器中提供例如色氨酸、色氨酸酶、氧化酶、还原酶和合适的辅因子(如果需要)作为一锅法进行。在此情形中，色氨酸被色氨酸酶酶促转化为吲哚。如上所述发生从吲哚通向隐色靛蓝的酶促反应。
[0069]
根据实施方案，本发明的工艺可以通过在同一反应器中提供例如色氨酸、色氨酸卤化酶、卤素源、色氨酸酶、氧化酶、还原酶和合适的辅因子，如果需要的话，作为一锅法进行。在此情形中，色氨酸被色氨酸卤化酶酶促卤化以获得卤代色氨酸。所述卤代色氨酸通过色氨酸酶转化为相应的吲哚衍生物。吲哚的卤代衍生物被氧化酶羟基化以获得相应的吲哚酚衍生物，其在还原酶的存在下被转化为相应的靛蓝卤代衍生物的隐色形式。
[0070]
根据一个方面，本发明涉及一种用于实施本发明工艺的装置，其包含至少一个含有酶的反应器，其中所述酶包括氧化酶和还原酶，所述氧化酶优选为单加氧酶，所述还原酶优选为偶氮还原酶，还优选为色氨酸酶，并且可选择地还包括色氨酸卤化酶。
[0071]
有利地，本发明的装置允许从吲哚(或吲哚衍生物)开始，或优选地从色氨酸或色氨酸衍生物开始，生产隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式。
[0072]
靛蓝或靛蓝衍生物可根据标准技术从隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)获得，标准技术例如标准暴露于空气。有利地，当纺织品被提供有隐色靛蓝并暴露于空气时，空气中的氧气在纺织品表面上将这种隐色靛蓝氧化成靛蓝。
[0073]
根据本发明的实施方案，反应混合物，例如包括酶的水性混合物，可以包含其他功能性溶质，诸如盐、缓冲剂和氧气和/或过氧化物清除剂(例如过氧化氢酶)。过氧化氢酶可以被包括在反应混合物中以将可能形成的h2o2转化为o2和h2o。
[0074]
例如，示例性反应混合物可以包括合适的缓冲液、吲哚、单加氧酶、还原酶、一种以上辅因子、一种以上辅因子再生酶和可选择的过氧化氢酶。优选地，单加氧酶和还原酶作为融合酶提供，即作为与辅因子再生酶融合的酶，例如ptdh-mfmo和ptdh-azoa。
[0075]
根据实施方案，本发明的工艺中使用的酶是分离的酶。换言之，根据实施方案，本发明的工艺中使用的氧化酶和/或还原酶和/或色氨酸酶和/或色氨酸卤化酶是从其中产生酶的宿主细胞(例如细菌细胞，诸如大肠杆菌(e.coli))分离的。酶可以根据本领域已知的技术从宿主细胞和生物体中分离和/或纯化。
[0076]
根据实施方案，本发明的工艺中使用的一种以上酶是固定化酶。换言之，根据实施方案，本发明的工艺中使用的氧化酶和/或还原酶和/或色氨酸酶和/或色氨酸卤化酶是固定化酶。
[0077]
如本文中所使用，术语“固定化酶”指代与载体结合、优选共价结合的酶，载体例如
环氧活化树脂(诸如甲基丙烯酸酯共聚物，例如relizyme
tm
、)、纤维素、琼脂糖、聚苯乙烯离子交换树脂、氨基丙烯酸酯树脂、水凝胶(通过封闭固定；例如琼脂糖、藻酸盐、卡拉胶或明胶)、螯合载体(例如ida-琼脂糖及其衍生物)等。用于固定酶的载体类型可能取决于酶的暴露基团。例如，如果表面氨基暴露在酶上，则可以使用环氧活化树脂作为载体：由于氨基共价连接到环氧活化树脂的环氧基团上，酶被固定在环氧活化树脂上.
[0078]
酶的固定化可以根据本领域已知的技术进行。
[0079]
已经观察到，有利地，当酶被固定时，即使在重复的催化循环之后，即在本发明的工艺中长时间使用之后，仍保持高催化效率。
[0080]
根据实施方案，当酶被固定时，酶可以根据顺序排列在例如反应罐(即反应器)内，使得酶的反应产物成为后续酶的底物。在此情形中，有利地，可以在反应器中产生流动，从而将选定的起始材料(例如吲哚)随着从一种酶流向另一种酶而转化为隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)。
[0081]
根据实施方案，氧化酶是加氧酶，优选为单加氧酶，更优选为含黄素单加氧酶(fmo)，还更优选为微生物含黄素单加氧酶(mfmo)。
[0082]
根据实施方案，还原酶是还原酶，优选为偶氮还原酶，更优选为黄素依赖性偶氮还原酶。
[0083]
本发明的工艺中使用的一种以上酶可以需要一种以上辅因子。
[0084]
如本文中所使用，术语“辅因子”指代对于作为催化剂的酶的活性所需的非蛋白质化合物。辅因子可以分为两种类型，一种是无机离子，另一种是称为辅酶的复杂有机分子。为清楚起见，在本说明书中，术语“辅因子”用于表示对于根据本发明的蛋白质的酶活性所需的任何非蛋白质化合物，而不限于特定化学类别的分子，即包括有机分子和无机分子两者。
[0085]
根据实施方案，辅因子再生酶可以用于再生本发明工艺中使用的酶可能需要的辅因子。
[0086]
在此情形中，有利地，昂贵的辅因子(例如nadph)通过消耗廉价的辅因子(诸如葡萄糖、亚磷酸盐或甲酸盐)来再生。
[0087]
根据实施方案，在至少一种氧化酶存在下羟基化吲哚(或吲哚衍生物)以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物的步骤可以在至少一种适用于再生所述氧化酶所需要的辅因子的酶的存在下进行。例如，当氧化酶是单加氧酶时，nadph可以用作辅因子。
[0088]
根据实施方案，在至少一种还原酶的存在下将吲哚酚(或吲哚酚衍生物)转化为隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的步骤可以在至少一种适用于再生所述还原酶所需要的辅因子的酶的存在下进行。例如，当还原酶是偶氮还原酶时，nadh可以用作辅因子。
[0089]
根据实施方案，氧化酶和/或还原酶与辅因子再生酶偶联，优选为与辅因子再生酶融合。
[0090]
换言之，根据实施方案，氧化酶可以是融合酶，其中氧化酶与辅因子再生酶融合，和/或还原酶可以是融合酶，其中还原酶与辅因子再生酶融合。
[0091]
根据实施方案，辅因子再生酶选自由葡萄糖脱氢酶(gdh)、亚磷酸盐脱氢酶(ptdh)和甲酸脱氢酶(fdh)所组成的组，优选为ptdh。在实施方案中，辅因子再生酶适合于再生nadph和/或nadh辅因子。
[0092]
根据实施方案，当例如氧化酶是mfmo并且辅因子再生酶是ptdh时，羟基化吲哚或吲哚衍生物以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物的步骤可以使用融合酶ptdh-mfmo进行。
[0093]
根据实施方案，当例如还原酶是azoa并且辅因子再生酶是ptdh时，可以使用融合酶进行将吲哚酚或吲哚酚衍生物转化为隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的步骤ptdh-azoa。
[0094]
例如，ptdh-azoa融合酶可以具有以下序列：
[0095]
mgsshhhhhhssglvprgshmlpklvithrvheeilqllaphcelitnqtdstltreeilrrcrdaqammafmpdrvdadflqacpelrvigcalkgfdnfdvdactargvwltfvpdlltvptaelaiglavglgrhlraadafvrsgkfrgwqprfygtgldnatvgflgmgaiglamadrlqgwgatlqyharkaldtqteqrlglrqvacselfassdfillalplnadtlhlvnaellalvrpgallvnpcrgsvvdeaavlaalergqlggyaadvfemedwaradrpqqidpallahpntlftphigsavravrleiercaaqnilqalagerpinavnrlpkanpaadsrsaagmtkvlyitahphddtqsfsmavgkafidtykevnpdhevetidlyiediphidvdvfsgwgklrsgqgfdqlssdekakvgrlselceqfvsadkyifvsplwnfsfppvlkayidsvavagktfkyteqgpvglltdkkalhiqarggiysegpaaqmemghrylsiimqffgvpsfdglfveghnampdkaqeikekavarakdlahtf(seq.id no.10)。
[0096]
适用于本发明工艺的融合酶可以根据本领域已知的技术生产。
[0097]
根据实施方案，合适的融合酶可以具有相对于seq.id no.10具有至少80％的序列同一性的序列。
[0098]
有利地，根据本发明的实施方案，选自由所述氧化酶、所述还原酶、所述色氨酸酶和所述色氨酸卤化酶所组成的组的至少两种酶可以偶联在一起，优选为融合在一起。
[0099]
有利地，当氧化酶与辅因子再生酶偶联时，可以使用包括色氨酸酶、氧化酶和辅因子再生酶的酶复合物。例如，包含融合在一起的色氨酸酶、氧化酶和辅因子再生酶的融合酶可以在本发明的工艺中使用。在此情形中，根据本发明的实施例，有利地，色氨酸可以以特别快速和有效的方式转化为隐色靛蓝。
[0100]
例如，包括融合在一起的色氨酸酶、氧化酶和辅因子再生酶的合适的融合酶可以是色氨酸酶-ptdh-mfmo。
[0101]
如上所述，根据本发明工艺的实施方案，吲哚或吲哚衍生物可通过在色氨酸酶的存在下转化色氨酸或色氨酸衍生物而获得，并且plp可以用作由色氨酸酶催化的反应中的辅因子。
[0102]
根据本发明工艺的实施方案，吲哚衍生物是吲哚的卤代衍生物，其可以通过色氨酸的卤代衍生物的色氨酸酶催化转化获得。色氨酸的卤代衍生物可以通过色氨酸的酶促卤化、经由卤化酶催化的反应获得。
[0103]
根据实施方案，可以在黄素还原酶和nad(p)h再生酶的存在下进行色氨酸的卤化以获得其卤代衍生物，即卤代色氨酸，所述nad(p)h再生酶优选地选自由葡萄糖脱氢酶(gdh)、亚磷酸酯脱氢酶(ptdh)和甲酸脱氢酶(fdh)所组成的组。优选地，nad(p)h再生酶是ptdh。
[0104]
黄素还原酶(ec 1.5.1.30)是已知的酶，其催化以下反应：
[0105]
黄素 nadph h

→
还原黄素 nadp h

[0106]
而nad(p)h再生酶是产生nadh或nadph的酶，诸如gdh、ptdh和fdh。例如，色氨酸卤化酶可以使用fad作为辅因子，其可以由可以使用nadh或nadph作为辅因子的黄素还原酶产生。所述nadh或nadph辅因子转而通过nad(p)h再生酶经由涉及诸如葡萄糖、亚磷酸盐和甲酸盐的廉价辅因子的反应产生。
[0107]
适用于本发明工艺的黄素还原酶可以是枯草芽孢杆菌的黄素还原酶(bsufre)，特别是枯草芽孢杆菌的菌株wu-s2b的黄素还原酶。
[0108]
例如，黄素还原酶可以具有以下序列：
[0109]
mkvlvlafhpnmeqsvvnrafadtlkdapgitlrdlyqeypdeaidvekeqklceehdrivfqfplywyssppllkkwldhvllygwaygtngtalrgkefmvavsagapeeayqaggsnhyaisellrpfqatsnfigttylppyvfyqagtagkselaegatqyrehvlksf(seq.id no.3)。
[0110]
根据实施方案，合适的黄素还原酶可以具有相对于seq.id no.3具有至少80％的序列同一性的序列。
[0111]
根据实施方案，黄素还原酶和nad(p)h再生酶可以被偶联，优选为融合在一起，以获得包括黄素还原酶和nad(p)h再生酶的融合酶。例如，如果黄素还原酶是bsufre并且nad(p)h再生酶是ptdh，则可以获得融合酶ptdh-bsufre并将其用于本发明的工艺中。
[0112]
根据实施方案，在卤化酶(例如色氨酸卤化酶)、卤素源、fad和nadh辅因子、亚磷酸盐、黄素还原酶和nad(p)h再生酶(可选择地融合在一起，例如融合酶ptdh-bsufre)的存在下，色氨酸可以被转化为卤代色氨酸。
[0113]
根据实施方案，本发明的工艺可以进一步包含至少在至少氧化酶的存在下羟基化吲哚或吲哚衍生物以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物的步骤期间提供氧气的步骤。
[0114]
氧化酶在反应混合物中需要氧气，即o2，以催化吲哚或其衍生物的羟基化。进行吲哚(或吲哚衍生物)的羟基化所需的o2可以是正常溶解在含水反应混合物中的氧气。在实施方案中，可以将氧气提供至反应混合物，例如，提供至其中进行从吲哚(或色氨酸或其衍生物)到隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的一锅法转化的反应器。
[0115]
根据实施方案，通过在本发明的工艺期间改变氧气浓度，可以获得不同量的吲哚酚(或其衍生物)。
[0116]
有利地，可以在本发明的工艺期间监测和控制氧气浓度，以便在需要时可以添加氧气，从而根据需要调节反应混合物中的氧气浓度。
[0117]
根据实施方案，隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式可通过浸入停留、起泡、排气或喷涂提供至纺织品的至少一部分。在实施方案中，所述浸入、停留、起泡、排气或喷涂可以在惰性或基本上惰性的气氛中(例如，在氮气或臭氧下)或在空气的存在下(例如，露天)进行。浸入停留、起泡、排气和喷涂及技术本身是本领域中已知的。例如，在实施方案中，可以将纺织品或纺织品的一部分浸入反应器中，其中进行吲哚(或色氨酸或其衍生物)到隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的转化过程。
[0118]
换言之，可以通过将织物浸入反应器中，其中作为一锅法进行吲哚到隐色靛蓝的转化过程，来将隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式提供至纺织品的至少一部分。
[0119]
根据一个方面，本发明的工艺包括氧化提供至纺织品的隐色靛蓝或所述靛蓝衍生物的隐色形式的至少一部分的步骤，从而在所述纺织品上产生靛蓝或靛蓝衍生物，以对纺
织品的至少一部分进行染色。
[0120]
根据实施方案，将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)氧化成靛蓝(或靛蓝衍生物)的步骤可以通过空气氧化进行。换言之，已经提供了隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的纺织品可以暴露于空气，使得空气中的氧气将这些隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)氧化为靛蓝(或靛蓝衍生物)，从而对纺织品进行染色。
[0121]
在实施方案中，氧化隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的步骤可以通过化学氧化或通过干燥来进行。例如，根据实施方案，已经提供了隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的纺织品可以暴露于空气、暴露于化学氧化和/或被干燥，使得隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)被转化为靛蓝(或靛蓝衍生物)，从而对纺织品进行染色。
[0122]
有利地，通过本发明的工艺，可以获得具有不同强度和/或不同颜色深浅的纺织品。例如，根据实施方案，隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式可以多于一次地提供至纺织品，例如，通过将纺织品多于一次地浸入在含有隐色靛蓝(或隐色靛蓝衍生物)的反应器中。例如，纺织品可以用隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的溶液浸渍，暴露于空气，从而将隐色靛蓝氧化成靛蓝，并再次用隐色靛蓝的溶液浸渍并暴露于空气，以增加纺织品上的靛蓝的量。例如，在实施方案中，纺织品或纺织品的一部分可以在同一反应器中浸入多于一次，例如，在其中作为一锅法进行吲哚(或色氨酸或其衍生物)到隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的转化的反应器中。
[0123]
根据实施方案，可以在将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)提供至纺织品之前调节反应混合物或溶液中的隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的浓度。
[0124]
根据实施方案，适合实施本发明工艺的装置至少包含含有酶的反应器，其中所述酶包括氧化酶和还原酶。
[0125]
根据实施方案，酶还可以包括色氨酸酶和可选择的色氨酸卤化酶。
[0126]
图1示意性地示出用于实施本发明工艺的装置1，包含反应器2，反应器2含有反应混合物3，反应混合物3包括酶，即氧化酶4和还原酶5。氧化酶4优选为单加氧酶，并且还原酶5优选为偶氮还原酶。图1的装置用于执行后文讨论的实验室实施例。
[0127]
反应混合物3包括在本图中示意性地表示为三角形的吲哚6，其在氧化酶4和还原酶5的存在下转化为在本图中示意性地表示为双三角形的隐色靛蓝7。吲哚6在至少一种氧化酶4的存在下羟基化以获得吲哚酚。吲哚酚然后在至少一种还原酶5的存在下转化为隐色靛蓝。反应混合物3还可以进一步包括例如合适的缓冲液、一种以上的辅因子、一种以上的辅因子再生酶(例如ptdh)和可选择的过氧化氢酶。
[0128]
示例性反应混合物3可以在合适的缓冲液(例如磷酸钾缓冲液)中包括氧化酶4(例如mfmo)、nadph、亚磷酸盐、亚磷酸盐脱氢酶(ptdh)、nadh、还原酶5(例如azoa)以及可选择的过氧化氢酶。吲哚在例如氧化酶、nadph和o2存在下转化为吲哚酚，同时产生nadp

。亚磷酸盐脱氢酶(ptdh)可以用于在亚磷酸盐存在下将nadp

再循环为nadph。吲哚酚在还原酶的存在下转化为隐色靛蓝。吲哚酚向隐色靛蓝的转化可能涉及nadh向nad

的转化。
[0129]
根据实施方案，氧化酶4和还原酶5可以作为与辅因子再生酶融合的酶提供。这样的融合酶可以是例如ptdh-mfmo和ptdh-azoa。
[0130]
根据实施方案，反应混合物3可以包含色氨酸以代替吲哚的至少一部分，以及将色氨酸转化为吲哚的色氨酸酶。
[0131]
根据实施方案，当使用色氨酸时，反应混合物3可以进一步包括色氨酸卤化酶以获得卤代色氨酸，其被转化为相应的靛蓝的卤代衍生物的隐色形式。
[0132]
所获得的隐色靛蓝，例如在反应器2中产生的作为反应混合物含有的隐色靛蓝，可以被施加至纺织品或者可以从反应器2中移除并储存。
[0133]
在实施方案中，可以以不包括或基本上不包括酶的反应混合物的形式从反应器2移除含有所获得的隐色靛蓝的反应混合物，并放入腔室中，可选择地调节隐色靛蓝的浓度，例如降低混合物中隐色靛蓝的浓度。
[0134]
根据实施方案，可以通过使用如前文所定义的固定化酶获得不包括或基本上不包括酶的包含隐色靛蓝的反应混合物。
[0135]
根据实施方案，酶可以通过过滤技术从含有隐色靛蓝的反应混合物中去除，例如使用切向流过滤设备(tff)。切向流过滤设备(tff)本身是本领域已知的设备。这种设备包括一个过滤器，其允许小分子(例如隐色靛蓝)通过，但是酶不能通过。
[0136]
根据实施方案，可以在将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)提供至纺织品之前调节溶液中的隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的浓度。优选地，含有酶的反应器中的反应混合物具有高浓度的隐色靛蓝。在去除酶之后，将剩余的反应混合物送入腔室以供储存或稀释至所需浓度，例如用于染色的浓度。
[0137]
图1示意性地示出装置1，该装置1进一步包含设备8，其用于通过在反应器2内提供的反应混合物3中重复浸没(浸入)并移出纺织品9来对一块纺织品进行染色。根据图1的实施方案，设备8包括马达8'和两个辊8"。第一辊8"在反应器2外部连接到电机8'；第二辊8"放置在反应器2内。
[0138]
设备8的马达8'被配置为使得至少连接到马达8'的辊8"旋转，从而将纺织品9沿着图1的箭头a和a'所示的方向浸没于反应混合物3中并从反应混合物3中移出。当纺织品9浸没于反应混合物3中时，纺织品9被提供(例如浸渍)含有隐色靛蓝7的溶液。随后，当纺织品9从反应混合物3中移出时，它暴露于空气，从而发生隐色靛蓝的至少一部分到靛蓝的氧化，对纺织品9的至少一部分进行染色。纺织品9可以是例如织物、纱线或纱线束(绳)。
[0139]
根据图1中示意性表示的实施例，纺织品9可多于一次浸没于同一反应混合物3中并从其中移出，以增加纺织品9上的靛蓝的量。例如，可以将纺织品9浸没于同一反应混合物3中，以利用包含隐色靛蓝7的溶液浸渍，然后暴露于空气以使隐色靛蓝7在纺织品9上氧化成靛蓝。纺织品9可以数次浸没于同一反应混合物3中并从其中移出，从而在每次浸没时将新的隐色靛蓝7提供至纺织品9，然后转化为靛蓝，以增加纺织品9上的靛蓝的量。
[0140]
在其他实施例中，纺织品可以通过浸入其中进行吲哚(或色氨酸或其衍生物)到隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的转化的第一反应器中以利用隐色靛蓝溶液浸渍，并且在隐色靛蓝氧化之后，通过浸入其中进行吲哚(或色氨酸或其衍生物)到隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的转化的第二或另外的反应器中以利用例如包括隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)的溶液再次浸渍。
[0141]
根据实施方案，在本发明的工艺中，将纺织品连续浸入含有包括隐色靛蓝(或所述靛蓝衍生物的隐色形式)的反应混合物的多个反应器中，其中所述纺织品在每两个浸入步骤之间暴露于空气。
[0142]
图2示意性地示出用于实施本发明工艺的装置1，包含多个反应器2，各个反应器2
含有反应混合物3。特别地，图2示出三个反应器2，各个反应器2含有反应混合物3。反应混合物3含有酶，包括氧化酶4和还原酶5(图2中未示出)。
[0143]
参照图1对示例性反应混合物3的描述也适用于图2中示意性表示的反应混合物3。在实施方案中，不同的反应器可以含有相同的反应混合物3或不同的反应混合物3。
[0144]
在图2的实施例中，纺织品(例如纱线绳)以靛蓝染色领域中本身已知的方式从一个反应器移动到下一个，例如通过使用布置在反应器2外部和内部的多个辊8"，其构造类似于用于根据现有技术的靛蓝染色工艺的那些。换言之，在本发明的装置中，多个反应器2代替了先前已知的染色浴。
[0145]
根据图2的实施例，纺织品9由辊8"引导以浸没于第一反应混合物3并从其中移出，然后浸没于第二反应混合物3，然后浸没于第三反应混合物3并从其中移出。当将纺织品9浸没于第一反应混合物3时，纺织品9被提供(例如浸渍)第一量的隐色靛蓝7的溶液。随后，当纺织品9从第一反应混合物3中移出时，它暴露于空气，从而发生隐色靛蓝的第一量的至少一部分的氧化，为纺织品提供第一量的靛蓝，由此对纺织品9的至少一部分进行染色。随后，将纺织品9浸没于第二反应混合物3中，从而用第二量的隐色靛蓝7溶液浸渍纺织品9并移出，由此为纺织品9提供第二量的靛蓝。根据图2的实施例，进行浸没于反应混合物3并移出的第三次循环，从而为纺织品提供第三量的隐色靛蓝，由此提供第三量的靛蓝。
[0146]
图2示意性地示出纺织品9的颜色变化，这种变化在纺织品浸没于不同反应器2中的反应混合物3之后暴露于空气时发生。
[0147]
根据实施例，如果反应混合物3包括不同的反应物(例如，吲哚和至少一种吲哚衍生物)，则可以在一个以上的反应器2中产生不同的靛蓝衍生物的隐色形式，可以为纺织品9提供至少一种靛蓝衍生物，作为靛蓝的补充或替代。
[0148]
根据本发明工艺的实施方案，有利地，可以增加纺织品上一种染料例如靛蓝的量。同样有利的是，当使用不同的隐色形式时，可以为纺织品提供多于一种染料以获得纺织品所需的最终颜色。
[0149]
根据本发明的一个方面，可溶性隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式是以吲哚或色氨酸或其衍生物开始，通过级联的酶促反应步骤的方式获得的，以获得隐色靛蓝(或一种以上的靛蓝衍生物的隐色形式)。隐色靛蓝(或一种以上的靛蓝衍生物的隐色形式)经由例如当用包含所述隐色靛蓝的溶液浸渍的纺织品被例如暴露于空气时发生的自发氧化反应被氧化，以产生靛蓝(或一种以上的靛蓝衍生物)。在纺织品被提供了靛蓝或其衍生物之后，可以可选择地对其进行洗涤和/或漂洗和干燥。
[0150]
根据实施方案，纺织品，即纺织制品，选自纱线、织物或服装。
[0151]
根据实施方案，优选地选自由纱线、织物和服装所组成的组的纺织制品可以被提供有隐色靛蓝和/或一种以上的靛蓝衍生物的隐色形式，由此隐色靛蓝和/或一种以上的靛蓝衍生物的隐色形式的至少一部分被氧化(例如通过暴露于空气)以在纺织品上产生靛蓝和/或一种以上的靛蓝衍生物。
[0152]
本发明的另一个目的是根据本发明的工艺可获得的染色纺织品。
[0153]
根据实施方案，染色纺织品是靛蓝染色纺织品，例如靛蓝染色纱线、靛蓝染色织物或靛蓝染色服装。根据实施方案，染色纺织品是泰尔紫染色纺织品，例如泰尔紫染色纱线、泰尔紫染色织物或泰尔紫染色服装。
[0154]
根据实施方式，当纺织品是纱线时，染色纱线可以用于生产制品，诸如织物和服装制品，例如服装。根据实施方式，当纺织品是织物时，染色织物可以剪裁成服装，或者可以包括在服装中。
[0155]
本发明的再一个目的是一种通过酶促合成生产隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的方法，包含以下步骤：
[0156]
a')提供吲哚或吲哚衍生物，可选择地通过在至少一种色氨酸酶的存在下将色氨酸或色氨酸衍生物转化为所述吲哚或吲哚衍生物；
[0157]
b')在至少一种氧化酶的存在下羟基化步骤a')中获得的吲哚或吲哚衍生物，以获得吲哚酚或吲哚酚衍生物；以及
[0158]
c')在至少一种还原酶的存在下将步骤b')中获得的吲哚酚或吲哚酚衍生物转化为隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式。
[0159]
有利地，根据实施方案，本发明的方法允许合成隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式，优选地通过级联的酶促反应步骤的方式从色氨酸或色氨酸衍生物开始。
[0160]
根据实施方案，本发明的方法进一步包含氧化隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式以获得靛蓝或所述靛蓝衍生物的步骤。
[0161]
本发明的方法特别有利于以成本效益高的方式生产隐色靛蓝和靛蓝衍生物的隐色形式，以及靛蓝和/或靛蓝衍生物，诸如如泰尔紫。
[0162]
此外，有利地，本发明的方法允许以工业规模制造隐色靛蓝和隐色形式的靛蓝衍生物，以及靛蓝和/或靛蓝衍生物。
[0163]
在本说明书中，参考染色纺织品工艺所提供的信息，包括所使用的酶以及试剂和所获得的产品，也适用于通过酶促合成生产隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式、以及靛蓝和靛蓝衍生物的方法，这也是本发明的一个目的。
[0164]
根据本发明，在染色纺织品工艺中使用的所有酶，以及在通过酶促合成生产隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式的方法中使用的所有酶，可以是基因工程化的，以为酶提供例如附加功能特征和/或提高的活性。
[0165]
有利地，根据实施方案，隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式到靛蓝或靛蓝衍生物的氧化可以在隐色靛蓝已被提供至载体之后进行，载体例如纺织制品，诸如织物。
[0166]
根据实施方案，将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)氧化成靛蓝(或靛蓝衍生物)的步骤可以通过空气氧化进行。例如，已经提供了隐色靛蓝的纺织品可以暴露于空气，使得空气中的氧气在纺织品表面上将这种隐色靛蓝氧化成靛蓝。
[0167]
有利地，根据实施方案，色氨酸可用作起始化合物以酶促产生隐色靛蓝和隐色靛蓝衍生物形式，以及靛蓝和靛蓝衍生物。有利地，使用色氨酸作为起始化合物允许成本有效地生产靛蓝和/或靛蓝衍生物及其隐色形式。
[0168]
根据实施方案，本发明方法的步骤a')的色氨酸衍生物是色氨酸的卤代衍生物。优选地，卤代色氨酸是6-溴色氨酸。
[0169]
根据实施方案，当色氨酸衍生物为卤代衍生物时，本发明的方法进一步包含以下步骤：i)在至少一种色氨酸卤化酶和卤素源的存在下卤化色氨酸，以获得色氨酸的卤代衍生物。优选地，卤素源是卤素溴。
[0170]
根据实施方案，在本发明的方法以及本发明的工艺中使用的酶可以是分离的酶，
优选为纯化的或半纯化的酶。酶可以根据本领域已知的技术从例如细菌细胞的宿主细胞和宿主生物体中分离和/或纯化。
[0171]
根据实施方案，色氨酸酶和/或氧化酶和/或还原酶和/或色氨酸卤化酶是分离的酶。
[0172]
根据实施方案，色氨酸酶和/或氧化酶和/或还原酶和/或色氨酸卤化酶是固定化酶。
[0173]
根据实施方案，步骤b')、c')以及可选择的所述步骤a')和所述卤化色氨酸的步骤在单个反应器中进行，即作为一锅法进行。
[0174]
根据实施方案，当卤素源为卤素溴时，色氨酸的卤代衍生物优选为6-溴色氨酸，并且靛蓝衍生物优选为泰尔紫。
[0175]
根据实施方案，本发明的方法可以在纺织品的存在下进行，由此至少部分地为所述纺织品的至少一部分提供隐色靛蓝和/或所述靛蓝衍生物的所述隐色形式。
[0176]
在此情形中，有利地，将隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)氧化成靛蓝(或靛蓝衍生物)的步骤可以通过空气氧化进行，例如，通过将已经提供有隐色靛蓝的纺织品暴露于空气，使得空气中的氧气在纺织品表面上将这种隐色靛蓝氧化成靛蓝。
[0177]
根据实施方案，氧化隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式以获得靛蓝或所述靛蓝衍生物的步骤可以在纺织品的存在下进行，使得所获得的靛蓝或靛蓝衍生物的至少一部分沉积在纺织品上。换言之，例如，隐色靛蓝可以被提供至纺织品并且随后被氧化以获得靛蓝，从而使纺织品的至少一部分被染色。
[0178]
根据实施方案，本发明的方法可以在一个反应器中进行，从而提供一锅反应。
[0179]
根据一个方面，本发明涉及一种用于实施本发明方法的装置，其包含含有酶的反应器，其中所述酶包括氧化酶和还原酶，所述氧化酶优选为单加氧酶，所述还原酶优选为偶氮还原酶，还优选为色氨酸酶，并且可选择地还包含色氨酸卤化酶。
[0180]
有利地，本发明的装置允许从吲哚(或吲哚衍生物)开始，或优选地从色氨酸或色氨酸衍生物开始，生产隐色靛蓝或靛蓝衍生物的隐色形式。
[0181]
靛蓝或靛蓝衍生物可根据标准技术从隐色靛蓝(或靛蓝衍生物的隐色形式)获得，标准技术例如标准暴露于空气。有利地，当纺织品被提供有隐色靛蓝并暴露于空气时，空气中的氧气在纺织品表面上将这种隐色靛蓝氧化成靛蓝。
[0182]
本发明的方法以及根据本发明的纺织品染色工艺可以在水性介质中进行。这种水性介质可具有中性或微碱性ph，诸如7.0至10，优选为7.4至9。因此，这种水性介质可以包含缓冲剂，例如磷酸钾缓冲剂或tris hcl缓冲剂。诸如6-溴色氨酸的一些色氨酸衍生物难溶于水性介质，本发明的方法可以利用悬浮在水性介质中的这种色氨酸衍生物进行。
[0183]
步骤a')涉及在色氨酸酶存在下色氨酸或其衍生物上的碳-碳键的裂解。
[0184]
如上所述，色氨酸酶是已知的酶，其切割色氨酸的碳-碳键，释放吲哚。它们可以使用磷酸吡哆醛(plp)作为辅因子。适用于本发明方法的色氨酸酶是大肠杆菌的色氨酸酶。
[0185]
plp可以可选择地添加到步骤a')的反应混合物中以提高色氨酸或其衍生物的转化率。
[0186]
本发明方法的步骤b')涉及在氧化酶和o2的存在下，至少在步骤a')获得的吲哚或
其衍生物的3位的碳上的羟基化。因此，步骤b')提供吲哚酚或吲哚酚衍生物。
[0187]
合适的氧化酶是如前文所述的那些，例如微生物fmo(mfmo)，诸如来自嗜甲基菌属(methylophaga sp)菌株sk1和baeyer-villiger单加氧酶的微生物fmo。
[0188]
氧化酶在反应混合物中需要o2，即氧气，以催化吲哚或其衍生物的羟基化。进行本发明方法的步骤b')所需的o2可以是正常溶解在含水反应混合物中的氧气；如果需要，可以调节反应混合物中o2的浓度，以例如提高吲哚或其衍生物向吲哚酚或其衍生物的转化。
[0189]
也需要氧气，即o2，以将隐色靛蓝(或隐色靛蓝衍生物)转化为靛蓝(或靛蓝衍生物)。例如，靛蓝可以经由非酶促反应从隐色靛蓝获得，例如通过暴露于空气。
[0190]
根据实施方案，步骤a')的色氨酸衍生物是卤代色氨酸，其通过步骤i)在至少一种色氨酸卤化酶的存在下卤化色氨酸而获得。
[0191]
如上所述，色氨酸卤化酶是已知的能够催化色氨酸在不同位置的卤化的酶。色氨酸卤化酶通常是黄素依赖性卤化酶，即它们使用fad或fadh2作为辅因子。根据本发明的方法，合适的色氨酸卤化酶是色氨酸卤化酶，诸如紫黑链霉菌的色氨酸卤化酶。
[0192]
根据实施方案，色氨酸卤化酶是紫黑链霉菌的菌株spc6的色氨酸卤化酶。
[0193]
例如，色氨酸卤化酶可以具有前文报道的序列seq.id no.1。
[0194]
这种类型的色氨酸卤化酶优选地催化色氨酸的6位的碳的卤化，由此它适合于根据本发明的工艺产生泰尔紫(6,6'-二溴靛蓝)。
[0195]
适合于本发明方法的另一种色氨酸卤化酶是色氨酸卤化酶prna，优选为荧光假单胞菌的prna，其优选地在色氨酸的5或7位的碳上催化色氨酸的卤化。
[0196]
例如，色氨酸卤化酶(prna)可以具有前文报道的序列seq.id no.2。
[0197]
根据实施方案，色氨酸卤化酶可以是基因修饰的酶；换言之，色氨酸卤化酶可以是突变形式。例如，色氨酸卤化酶可以是紫黑链霉菌的菌株spc6的色氨酸卤化酶的突变形式，或色氨酸卤化酶prna的突变形式。
[0198]
卤化色氨酸以获得色氨酸的卤代衍生物的步骤i)需要反应混合物中的卤素源才能进行，因为色氨酸必须在色氨酸卤化酶存在下与卤素反应以转化为色氨酸的卤代衍生物，即卤代色氨酸。根据本发明的方法，合适的卤素源可以是卤素盐，即其中阴离子为卤素离子的盐。合适的卤素盐可以是镁、银、钠、钾、锂和钙的卤素盐，例如nacl、kcl、ki、licl、cucl2、cubr2、agcl、cacl2、cabr2、clf、mgcl2、mgbr2等。
[0199]
根据实施方案，卤化色氨酸的步骤i)可以在20℃至60℃的范围内的温度下进行，优选为25℃至40℃，更优选为约30℃，持续时间在30分钟至4小时的范围内，优选为1小时至3小时，更优选为约2小时。
[0200]
根据实施方案，辅因子再生酶可以用于再生本发明方法中使用的酶可能需要的辅因子。
[0201]
根据实施方案，步骤b')可以在至少一种适合于再生nadph辅因子的酶的存在下进行。优选地，适合于再生nadph辅因子的酶选自由如下所述的葡萄糖脱氢酶(gdh)、亚磷酸盐脱氢酶(ptdh)和甲酸脱氢酶(fdh)所组成的组，更优选为如下所述的ptdh，由此提供了nadph再生酶系统。有利地，此实施方案提供了一种酶系统，其中昂贵的辅因子(例如nadph)通过消耗更便宜的辅因子(诸如葡萄糖、亚磷酸盐或甲酸盐)来再生。例如，诸如fmo的氧化酶可以使用nadph作为辅因子，nadph可以通过nadph再生酶使用诸如葡萄糖、亚磷酸盐和甲
酸盐的廉价的辅因子产生。
[0202]
在另一个实施方案中，在黄素还原酶和nad(p)h再生酶的存在下进行色氨酸的卤化以获得其卤代衍生物，该nad(p)h再生酶优选地选自由葡萄糖脱氢酶(gdh)、亚磷酸酯脱氢酶(ptdh)和甲酸脱氢酶(fdh)所组成的组，更优选为ptdh，由此提供了色氨酸卤化酶-黄素还原酶-nad(p)h再生酶系统。
[0203]
黄素还原酶(ec 1.5.1.30)是催化以下反应的酶：
[0204]
黄素 nadph h

→
还原黄素 nadp h

[0205]
而nad(p)h再生酶是产生nadh或nadph的酶，诸如gdh、ptdh和fdh。有利地，此实施方案提供了一种酶系统，其中昂贵的辅因子(即nadph)通过消耗更便宜的辅因子(诸如葡萄糖、亚磷酸盐或甲酸盐)来再生，提高了本发明方法的工业可行性。例如，色氨酸卤化酶可以使用fad作为辅因子，fad可以由可以使用nadh或nadph作为辅因子的黄素还原酶产生，而nadh或nadph可以通过nad(p)h再生酶使用诸如葡萄糖、亚磷酸盐和甲酸盐的廉价的辅因子产生。
[0206]
适用于本发明工艺的黄素还原酶可以是枯草芽孢杆菌的黄素还原酶，特别是枯草芽孢杆菌的菌株wu-s2b的黄素还原酶。例如，黄素还原酶可以具有前文报道的序列seq.id no.3。
[0207]
适用于本发明的工艺和方法的酶的野生型形式本身是本领域已知的。例如，合适的mmfo是aminisulfidivorans噬甲基菌的mmfo的野生型形式，具有以下序列：
[0208]
matriailgagpsgmaqlrafqsaqekgaeipelvcfekqadwggqwnytwrtgldengepvhssmyrylwsngpkeclefadytfdehfgkpiasypprevlwdyikgrvekagvrkyirfntavrhvefnedsqtftvtvqdhttdtiyseefdyvvcctghfstpyvpefegfekfggrilhahdfrdalefkdktvllvgssysaedigsqcykygakkliscyrtapmgykwpenwderpnlvrvdtenayfadgssekvdaiilctgyihhfpflnddlrlvtnnrlwplnlykgvvwednpkffyigmqdqwysfnmfdaqawyardvimgrlplpskeemkadsmawrekeltlvtaeemytyqgdyiqnlidmtdypsfdipatnktflewkhhkkenimtfrdhsyrslmtgtmapkhhtpwidalddsleaylsdkseipvakea(seq.id no.5)。
[0209]
根据实施方案，合适的mmfo可以具有相对于seq.id no.5具有至少80％的序列同一性的序列。
[0210]
在本发明的方法和工艺中使用的任何酶的突变形式可以用于提高本发明的方法和工艺的产率和工业可行性。
[0211]
适用于产生酶的突变形式的技术是本领域已知的。
[0212]
例如，可以将一个以上的突变引入野生型序列以获得更加热稳定的酶的突变形式，即酶的突变形式的表观解链温度高于同一酶的野生型形式的表观解链温度。
[0213]
例如，已经观察到，在aminisulfidivorans噬甲基菌的野生型mmfo序列(上文报道的seq.id no.5)的n末端插入两个突变m15l和s23a，导致表观解链温度提高3℃。
[0214]
因此，合适的mmfo是aminisulfidivorans噬甲基菌的mmfo的m15l/s23a突变形式，具有以下序列：
[0215]
matriailgagpsglaqlrafqaaqekgaeipelvcfekqadwggqwnytwrtgldengepvhssmyrylwsngpkeclefadytfdehfgkpiasypprevlwdyikgrvekagvrkyirfntavrhvefnedsqtftvtvqdhttdtiyseefdyvvcctghfstpyvpefegfekfggrilhahdfrdalefkdktvllvgssysaedigsqcykyg
akkliscyrtapmgykwpenwderpnlvrvdtenayfadgssekvdaiilctgyihhfpflnddlrlvtnnrlwplnlykgvvwednpkffyigmqdqwysfnmfdaqawyardvimgrlplpskeemkadsmawrekeltlvtaeemytyqgdyiqnlidmtdypsfdipatnktflewkhhkkenimtfrdhsyrslmtgtmapkhhtpwidalddsleaylsdkseipvakea(seq.id no.6)。
[0216]
作为补充或替代，可以提供提高酶催化活性的突变。
[0217]
例如，发现选自由c78i、c78v、y207w、y207w/w319a、c78i/y207w/w319a所组成的组的fmo突变可提高fmo对吲哚的催化活性。
[0218]
特别地，观察到突变体c78i具有比野生型形式更高的催化活性(即，相对于野生型形式，c78i具有更高的k
cat
值)。观察到c78i突变对于催化速度有着意想不到的大影响。事实上，发现c78位置位于fmo酶结构的第二壳层中。
[0219]
此外，观察到突变体y207w对底物(即吲哚)的亲和力大于野生型形式(即，相对于野生型形式，y207w相具有更低的km值)。
[0220]
例如，合适的mmfo是aminisulfidivorans噬甲基菌的mmfo的m15l/s23a/c78i突变形式，具有以下序列：
[0221]
matriailgagpsglaqlrafqaaqekgaeipelvcfekqadwggqwnytwrtgldengepvhssmyrylwsngpkeilefadytfdehfgkpiasypprevlwdyikgrvekagvrkyirfntavrhvefnedsqtftvtvqdhttdtiyseefdyvvcctghfstpyvpefegfekfggrilhahdfrdalefkdktvllvgssysaedigsqcykygakkliscyrtapmgykwpenwderpnlvrvdtenayfadgssekvdaiilctgyihhfpflnddlrlvtnnrlwplnlykgvvwednpkffyigmqdqwysfnmfdaqawyardvimgrlplpskeemkadsmawrekeltlvtaeemytyqgdyiqnlidmtdypsfdipatnktflewkhhkkenimtfrdhsyrslmtgtmapkhhtpwidalddsleaylsdkseipvakea(seq.id no.7)。
[0222]
例如，合适的mmfo是aminisulfidivorans噬甲基菌的mmfo的m15l/s23a/y207w突变形式，具有以下序列：
[0223]
matriailgagpsglaqlrafqaaqekgaeipelvcfekqadwggqwnytwrtgldengepvhssmyrylwsngpkeclefadytfdehfgkpiasypprevlwdyikgrvekagvrkyirfntavrhvefnedsqtftvtvqdhttdtiyseefdyvvcctghfstpyvpefegfekfggrilhahdfrdalefkdktvllvgsswsaedigsqcykygakkliscyrtapmgykwpenwderpnlvrvdtenayfadgssekvdaiilctgyihhfpflnddlrlvtnnrlwplnlykgvvwednpkffyigmqdqwysfnmfdaqawyardvimgrlplpskeemkadsmawrekeltlvtaeemytyqgdyiqnlidmtdypsfdipatnktflewkhhkkenimtfrdhsyrslmtgtmapkhhtpwidalddsleaylsdkseipvakea(seq.id no.8)。
[0224]
测试了aminisulfidivorans噬甲基菌的mfmo的其他突变形式，即：c78l、c78a、w319a、w319f、y207n/w319a、y207n/w319f、y207n/w319n、y207n、y207w/w319c、y207w/w319f、y207w/w319n、w319n、c78f/y207n/w319a、c78f/y207n/w319f、c78f/y207n/w319n、c78f/y207n、c78f/y207w/w319f、c78f/y207w/w319n、c78f/y207w、c78f/w319f、c78f/w319n、c78i/y207n/w319a、c78i/y207n/w319f、c78i/y207n/w319n、c78i/y207n、c78i/y207w/w319f、c78i/y207w/w319n、c78i/y207w、c78i/w319a、c78i/w319f、c78i/w319n、c78v/y207n/w319a、c78v/y207n/w319f、c78v/y207n/w319n、c78v/y207n、c78v/y207w/w319a、c78v/y207w/w319f、c78v/y207w/w319n、c78v/y207w、c78v/w319a、c78v/w319f、c78v/w319n。
[0225]
例如，发现选自由w319a、c78i、c78i/y207w和c78i/y207w/w319f所组成的组的fmo突变可提高fmo对6-溴吲哚的催化活性。此外，nadph再生酶可以是提高了nadph产量的突变体，例如wo 2004/108912 a2中公开的ptdh。
[0226]
以上关于mfmo讨论的相同或基本相同的突变可以被引入nitrincola lacisaponensis(nifmo)的fmo序列中。事实上，已经观察到nifmo具有与mfmo几乎相同的活性位点。
[0227]
根据实施方案，合适的mmfo可以具有相对于seq.id no.5或seq.id no7或seq.id no.8具有至少80％的序列同一性的序列。
[0228]
此外，测试了前文报道的和光芽孢杆菌的azoa还原酶(seq.id no.4)的突变形式：w60a、w60t、w60d、w60r、w60f。根据实施方案，可以使用与本发明的工艺和方法中使用的任何酶的野生型形式具有至少80％的序列同一性的酶，条件是这些酶催化与野生型形式相同的反应.
[0229]
根据实施方案，当酶需要辅因子时，这种酶可以作为与辅因子再生酶融合的酶提供。
[0230]
例如，色氨酸卤化酶和黄素还原酶可以作为融合酶提供，fmo和nadph再生酶可以作为融合酶提供，优选地作为ptdh-fmo提供。根据此实施方案，在本发明的方法中(当进行可选择的步骤i)时)可以仅使用三种单独的酶，即色氨酸卤化酶-黄素还原酶融合酶、色氨酸酶和fmo-nadph再生融合酶。后一种融合酶的nadph再生部分能够从其廉价的底物(即亚磷酸盐)开始再生融合酶的fmo区域和黄素还原酶区域所需的nadph。
[0231]
例如，色氨酸卤化酶-黄素还原酶融合酶(thal-fre)可以具有以下序列：
[0232]
mgsshhhhhhssglvprgshlnnvvivgggtagwmtasylkaafgdriditlvesghigavgvgeatfsdirhffeflglkekdwmpacnatyklavrfenwrekghyfyhpfeqmrsvngfpltdwwlkqgptdrfdkdcfvmasvidaglsprhqdgtlidqpfdegademqgltmsehqgktqfpyayqfeaallakyltkysvergvkhivddvrevslddrgwitgvrtgehgdltgdlfidctgfrglllnqaleepfisyqdtlpndsavalqvpmdmerrgilpcttataqdagwiwtipltgrvgtgyvyakdylspeeaertlrefvgpaaadveanhirmrigrsrnswvkncvaiglssgfveplestgiffihhaieqlvknfpaadwnsmhrdlynsavshvmdgvreflvlhyvaakrndtqywrdtktrkipdslaeriekwkvqlpdsetvypyyhglppysymcillgmggielkpspalaladggaaqrefeqirnktqrltevlpkaydyftqsgsaagmkvlvlafhpnmeqsvvnrafadtlkdapgitlrdlyqeypdeaidvekeqklceehdrivfqfplywyssppllkkwldhvllygwaygtngtalrgkefmvavsagapeeayqaggsnhyaisellrpfqatsnfigttylppyvfyqagtagkselaegatqyrehvlksf(seq.id no.9)。
[0233]
根据实施方案，合适的融合酶可以具有相对于seq.id no.9具有至少80％的序列同一性的序列。
[0234]
有利地，根据本发明的实施方案，选自由氧化酶、还原酶、色氨酸酶和色氨酸卤化酶所组成的组的至少两种酶可以偶联在一起，优选为融合在一起。
[0235]
有利地，当氧化酶与辅因子再生酶偶联时，可以使用包括色氨酸酶、氧化酶和辅因子再生酶的酶复合物。例如，包含融合在一起的色氨酸酶、氧化酶和辅因子再生酶的融合酶可以在本发明的方法中使用。在此情形中，根据本发明的实施例，有利地，色氨酸可以以特别快速和有效的方式转化为隐色靛蓝。
[0236]
例如，包括融合在一起的色氨酸酶、氧化酶和辅因子再生酶的合适的融合酶可以
是色氨酸酶-ptdh-mfmo。
[0237]
实验部分
[0238]
实施例1
[0239]
材料和方法
[0240]
使用融合酶ptdh-mfmo(与辅因子再生酶ptdh融合的氧化酶mfmo)和ptdh-azoa(与辅因子再生酶ptdh融合的还原酶azoa)，根据本发明的工艺进行棉带的靛蓝染色。
[0241]
棉带是用几块棉布手工缝制，最终尺寸为2x 20cm。
[0242]
此实验的装置根据图1的示意性绘制而配置。特别地，用于纺织品在反应混合物中的循环或交替浸没(浸入)和移出的设备8包括作为马达8'的蠕动泵，具有适配为作为滚轮8"配置的头部，为浸没于反应混合物中(浸入2cm)的棉带提供旋转运动。
[0243]
棉带通过蠕动泵的能量旋转，使棉布旋转进出反应混合物。因此，当棉带浸没于反应混合物中时，其被包含隐色靛蓝的溶液浸渍，随后当其未浸没于反应混合物时暴露于空气。棉带在反应混合物中的循环浸没和暴露于空气中持续165分钟。
[0244]
反应混合物(100ml)在单个反应器中包含：
[0245]
ptdh-mfmo(1.5μm)，
[0246]
ptdh-azoa(0.6μm)，
[0247]
nadh(0.2mm)，
[0248]
nadph(0.2mm)，
[0249]
亚磷酸钠(20mm)，
[0250]
吲哚(5mm)，以及
[0251]
过氧化氢酶
[0252]
在120ml的50mm磷酸钾缓冲液中，ph 8.5。
[0253]
结果
[0254]
反应混合物在20-30分钟后已经开始变黄，这表明隐色靛蓝的存在。由于靛蓝存在而导致的混合物中的蓝色在反应的任何时刻都没有观察到。不受特定科学解释的束缚，已经假设通过mfmo对吲哚的羟基化和随后的二聚化产生的靛蓝立即且连续地被azoa还原为隐色靛蓝。自反应开始45分钟后，棉带上出现明显的蓝色，并在接下来的2小时获得更深的颜色。停止反应。注意到当反应混合物在4℃储存7天时，在此期间混合物基本上保持黄色。此实验表明，酶促纺织品染色是可行的，并且反应混合物的隐色靛蓝溶液是稳定的，可以储存。可替代地，可以使用色氨酸酶、单加氧酶和偶氮还原酶(可选择地固定化)来产生隐色靛蓝。在此情形中，色氨酸可以用作工艺的起始材料。酶的可选择的固定化允许最大限度地重复使用酶。
[0255]
例如，源自大肠杆菌的重组色氨酸酶可以有效地用于此工艺。这种酶可以根据本身已知的技术容易地生产，并且需要在反应混合物中添加5-磷酸吡哆醛(plp)。此外，源自大肠杆菌的色氨酸酶也接受卤代色氨酸，因此对于合成卤代靛蓝衍生物和利用卤代靛蓝衍生物对织物进行染色可以使用相同的工艺。