一种刺梨天然纳米颗粒及其提取方法和应用与流程

1.本发明涉及纳米颗粒技术领域，具体涉及一种刺梨天然纳米颗粒及其提取方法和应用。


背景技术：

2.刺梨（roxburgh，rosa roxburghii tratt），又称缫丝花、刺蘑、山刺梨等，是中国特有的一种水果，果实呈扁球形或圆锥形，稀纺锤形，直径2~4厘米。表面黄褐色，密被针刺，有的并具褐色斑点。刺梨在我国陕西、甘肃、云南、贵州等省区，均有野生或栽培，具有很高的营养价值和药用价值。刺梨不仅果肉中含有的维生素c远超许多其它水果，并且刺梨中多酚类物质含量丰富，对淀粉水解酶如α-淀粉酶，α-糖苷酶具有相对较好的抑制作用，有望可以达到抑制淀粉消化的效果。然而，传统的刺梨汁由于提取工艺受限导致出汁率低，产品中目标作用物的浓度低，以及活性成分易在加工过程中失活等客观问题，对淀粉酶抑制功效往往并不明显，再者传统的刺梨汁作为一个复杂分散系统，不易达到专一高效的功能功效。
3.如脂质体，水凝胶，微乳液等纳米材料因其纳米尺寸的巨大优势被广泛用于各个领域。纳米颗粒已经被证明可携带生物活性物质，重新定义了活性成分的生物可及性、生物利用度以及其功能。发明者首次发现了刺梨汁中存在天然纳米颗粒（rnps），并发现了rnps中有效结合了多酚等活性成分，相比较于游离多酚，因为纳米结构比表面积的特性，跟目标底物有着更多的反应碰撞和反应速率，从而有更显著的水解酶抑制效果。但是，对于如何提取这种天然纳米颗粒仍对研究者们提出了不小的难题。


技术实现要素：

4.为弥补现有技术中刺梨中天然纳米颗粒提取分离的空白，发明者开发了真空干燥后榨汁、以季铵盐-氧化石墨烯改性石墨烯膜特异性吸附rnps、置换透析”的全流程提取技术。发明者前期研究发现rnps中含有多酚等成分，可与金属离子形成配位键从而被吸附结合，但如钙离子、镁离子等金属离子容易与刺梨汁中杂蛋白反应，或者诱导rnps蛋白变性沉淀。季铵盐为铵离子中的四个氢原子都被烃基取代而生成的化合物，带电性弱于强阳离子，易与带多酚基团的rnps产生配位键及静电作用，且相比于杂蛋白及多糖，其与多酚基团结合更强，由此对rnps与杂分子进行有效分离。因此，发明者开发了一种基于复合季铵盐改性的石墨烯纤维膜，形成了对rnps的特异性富集分离，同时去除游离杂质分子。此外，富集在改性膜上的rnps以酸根缓冲液进行置换透析，得到游离rnps且去除未结合的多酚分子，实现多酚，实现rnps的高提出率及多酚的有效包含率。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：一种刺梨天然纳米颗粒的提取方法，包括以下步骤：步骤1，去除刺梨外果皮，对刺梨果肉部分进行真空低温干燥后，压榨破碎得到刺梨果汁；步骤2，将得到的刺梨果汁进行离心处理，取上清液进行低温超滤浓缩得到浓缩
液；步骤3，以季铵盐-氧化石墨烯修饰的改性石墨烯纤维膜为滤纸对浓缩液进行抽滤；步骤4，将改性石墨烯纤维膜取出放入透析袋中并在酸性溶液中进行置换透析，置换出改性石墨烯纤维膜中的刺梨天然纳米颗粒并同时除去未结合的游离分子；步骤5，将透析截留液冷冻干燥得到刺梨天然纳米颗粒。
6.优选的，所述步骤1的真空低温干燥后破碎的工艺参数为：真空度为-0.05 ~
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0.2mpa，温度为-30 ~
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4℃，干燥处理0.5~3h。
7.优选的，所述步骤2离心处理时，离心转速为5000~12000r/min，离心时间为15~30min，离心温度为-10~10℃。
8.优选的，所述步骤2低温超滤浓缩的截留分子量为10~100kda，温度为-20~4℃，时间为15~60min。
9.优选的，所述步骤3中季铵盐-氧化石墨烯修饰的改性石墨烯纤维膜制备步骤如下：将石墨烯纤维膜浸入含氧化石墨烯的溶液中，不断搅拌，令氧化石墨烯吸附在石墨烯纤维膜上；将氧化石墨烯吸附的石墨烯纤维膜再加入到含有季铵盐的水溶液中，加热搅拌，结束后取出并用乙醇清洗，去除未反应的氧化石墨烯及季铵盐，两次微波烘干后得到季铵盐修饰的石墨烯纤维膜。
10.优选的，所述氧化石墨烯溶液的质量分数为1~10％，季铵盐质量分数为10-30％。
11.优选的，所述季铵盐类型为含碳数为6~22的一种或者几种。
12.优选的，所述季铵盐为复合季铵盐，所述复合季铵盐由六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵以3:1:1组成。
13.优选的，所述步骤3中的两次微波，其中第一次微波功率为200w，时间为5min，第二次微波功率为700w，时间为1min。
14.优选的，所述步骤3中季铵盐-氧化石墨烯修饰的改性石墨烯纤维膜的平均孔径为1~5μm。
15.优选的，所述步骤3中抽滤速度为1~20 ml/min。
16.优选的，所述步骤4中透析袋孔径为8~14kda，透析8~24h。
17.本发明还提供由上述提取方法提取的刺梨天然纳米颗粒。
18.本发明的刺梨天然纳米颗粒可应用于抑制淀粉水解消化、低血糖食物。
19.本发明具有以下有益效果：针对刺梨果皮厚实，组织过硬，汁液及其中天然纳米颗粒难以溶出等问题，发明者有效结合真空低温干燥与破碎技术，粉碎果皮与果肉组织的情况下，更易挤压细胞壁，释放果汁及其中天然纳米颗粒，实现rnps高溶出率。本发明的刺梨有效出汁率超过90%。
20.rnps是同时带有亲水性和疏水性基团的复合结构，在水相中分离rnps则要更多考虑吸附剂的疏水性。本发明选用带有疏水性与静电相互作用的季铵盐对其进行有效吸附。氧化石墨烯是石墨烯的氧化衍生物，具有类界面活性剂的亲水和疏水两亲性。利用氧化石墨烯疏水性与季铵盐结合，并对石墨烯纤维膜进行改性修饰，得到季铵盐-石墨烯纤维膜，提取率高，速度快，操作方便。本发明的刺梨纳米颗粒提取率超过85%，多酚包含率高于5%，实现了rnps的高产率与多酚的高含量。
21.相比化学法（如酒精沉降，peg处理），本发明对组分更为亲和，可较大程度上保留原有纳米特性，且有效结合刺梨多酚，对淀粉水解酶有着理想的抑制作用，本发明的刺梨天然纳米颗粒对淀粉水解酶的抑制率超过80%。
附图说明
22.图1 刺梨天然纳米颗粒的tem电镜图图2 季铵盐用量对刺梨天然纳米颗粒提取率影响图3 不同浓度下rnps和纯多酚对α-淀粉酶酶活抑制曲线图（上线为rnps作用曲线，下线为纯多酚作用曲线）图4 不同浓度下rnps和纯多酚对α-糖苷酶酶活抑制曲线图（上线为rnps作用曲线，下线为纯多酚作用曲线）。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
24.除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
25.实施例1：去除刺梨外果皮后，对果肉部分进行真空低温干燥压榨并破碎，其中真空度为-0.05 ~
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0.2mpa，温度为-20℃，干燥处理0.5~3h。
26.对比例1：与实施例1的区别在于对果肉部分采用真空低温压榨或真空常温压榨或常温压榨。
27.表1 不同压榨方式对刺梨出汁率的影响为实现高出出汁率和保护活性成分的目的，发明人采用了“真空低温干燥压榨”的组合技术，在测定刺梨总含水量为70%的基础上，通过不同技术得到刺梨汁，与刺梨总含水量进行比较得到刺梨有效出汁率。如表1所示，真空低温干燥压榨技术所取得的刺梨汁远高于对比技术，说明该技术有效组合，发挥了重要作用。
28.实施例2：一种季铵盐-氧化石墨烯修饰的改性石墨烯纤维膜包括以下步骤：将石墨烯纤维膜浸入含氧化石墨烯的溶液中，不断搅拌，令氧化石墨烯充分吸附在纤维膜上；将氧化石墨烯吸附的石墨烯纤维膜再加到含有复合季铵盐水溶液中（六烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵按照3:1:1的比例混合加入水中溶解，），加热搅拌，
捞出后乙醇清洗，去除未反应的氧化石墨烯及季铵盐，两次微波烘干后得到季铵盐修饰的石墨烯纤维膜。
29.所述氧化石墨烯溶液的质量分数为1~10％，季铵盐质量分数为10-30％。
30.其中第一次微波功率为200w，时间为5min，第二次微波功率为700w，时间为1min。
31.所述石墨烯纤维膜为市售石墨烯纤维膜。
32.表2 氧化石墨烯对改性膜孔径的影响表3 微波烘干对改性膜孔径的影响为了保证rnps可与膜进行充分接触作用和分离效率，本发明考察了氧化石墨烯以及微波烘干两个重要因素对改性膜的影响。1）、固定其他参数相同，改变氧化石墨烯溶液的质量浓度，固定两次微波烘干参数，进行探究；2），1）、固定其他参数相同，改变微波烘干参数，固定氧化石墨烯溶液的质量浓度为5%，进行探究。结果显示，膜孔径对于吸附及过滤速度极其重要，孔径太大不利于rnps在膜上的自然吸收。
33.实施例3：一种刺梨天然纳米颗粒的提取方法包括以下步骤：步骤1，去除刺梨外果皮，对刺梨果肉部分进行真空低温干燥后，压榨破碎得到刺梨果汁；步骤2，将得到的刺梨果汁进行离心处理，取上清液进行低温超滤浓缩得到浓缩液；步骤3，将浓缩液加入布氏漏斗中，并以季铵盐-氧化石墨烯修饰的改性石墨烯纤维膜为滤纸进行抽滤，改性纤维膜充分吸附含有多酚基团的刺梨天然纳米颗粒而滤过未吸附的杂蛋白及其余分子；步骤4，将改性石墨烯纤维膜取出放入透析袋中并在酸性溶液中进行置换透析，置换出改性石墨烯纤维膜中的刺梨天然纳米颗粒并同时除去未结合的游离分子；步骤5，将透析截留液冷冻干燥得到刺梨天然纳米颗粒。
34.图1为利用改性膜分离所得rnps的tem电镜观察图，其中利用改性膜所得rnps呈圆球颗粒状，平均粒径为110nm，粒径分布集中，且跟刺梨原样相对比，基本未发生改变；跟原样颗粒浓度相对比，发现经改性膜分离，rnps提取率可超过85%。
35.表4 rnps分离前后的胶体性质及其得率
实施例4表5 季铵盐组成对rnps提取率的影响结果显示，不同季铵盐（六烷基三甲基氯化铵c9、十二烷基三甲基氯化铵c15、十六烷基三甲基氯化铵c19，其中c9 c15 c19的比例为3:1:1）组成改性的石墨烯纤维膜对rnps提取率影响显著，只用单一类型季铵盐，不能完全吸附rnps，而复合季铵盐使用效果理想，提取率超过85%。不同季铵盐的疏水性不同，短链和长链季铵盐相互补充，形成和纤维膜紧密结合，同时又可以有效吸附rnps。同时，季铵盐使用量对于提取率也很关键，使用量小时，其对rnps吸附作用不充足，而使用量过大时，其对rnps吸附过强，导致难以洗脱，反而阻碍了提取效果（如图2）。
36.实施例5：表6 抽滤速度对rnps提取率的影响考察刺梨浓缩液汁至于布氏漏斗后，其抽滤速度对提取效果的影响。结果显示，rnps提取效果对抽滤速度有着依赖关系。当抽滤速度达到10 ml/min时，rnps的富集效果最好，而抽滤速度过大或者过小对其皆有影响。速度过大时，容易导致物料未能与膜充分接触，速度过小时，真空挤压条件加深了rnps与膜的过度作用，降低了洗脱效果。
37.实施例6：多酚包含率含量测试实验：采用紫外分光光度计法，以没食子酸溶液为标准溶液，测定不同处理得到的rnps中所包含的多酚含量。操作如下：0.2 ml稀释后的样品与0.8 ml folin-ciocalteu试剂反应3-5 min后，加入1.5 ml浓度为10%的na2co
3 (w/v)溶液加入蒸馏水，得到最终体积为10 ml。混合物在765 nm处测量在黑暗中120分钟后。用1 cm比色皿，以试剂空白调节零点。将多酚含量与rnps浓度相比，得到rnps对多酚的包含率。
38.准确称取100 mg干燥至恒重的没食子酸，溶于少量甲醇，用蒸馏水定容至100ml，配成1 mg／ml的母液，分别移取母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml于10ml棕色容量瓶。取0.2ml上述方法。根据测定绘制没食子酸标准曲线。0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12 mg。
39.对比例2：
取浓缩后刺梨汁分别进行化学法（peg与乙醇）提取，结果显示，peg与乙醇分别处理后，这说明化学法不利于rnps的稳定性，且提取率与多酚偏低。
40.表7 刺梨原样及不同分离方法下rnps的得率实施例7：刺梨天然纳米颗粒rnps对α-淀粉酶抑制能力的测试实验（1）三角瓶中加入40 ml（0.5mg/ml）的可溶性淀粉溶液，将三角瓶放置于37℃恒温振荡水浴锅中，预热5 min。
41.（2）预热后的三角瓶中分别加入3ml各个浓度的纯多酚溶液和刺梨纳米颗粒溶液，3 ml（500 u/ml）α-淀粉酶酶液，于水浴锅中振荡反应30 min，取消化悬浊液4 ml，立即于沸水浴中进行灭酶。
42.（3）灭酶结束后，离心（6000 r/min，10 min，4℃），取上清液测溶液中的还原糖含量。
43.（4）用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。
44.（5）阳性对照用3 ml（500 u/ml）α-淀粉酶酶液与3 ml（5 mg/l）的可溶性淀粉溶液，而阴性对照为3ml各个浓度的纯多酚溶液和刺梨纳米颗粒溶液与40 ml（0.5 mg/ml）的可溶性淀粉溶液反应。不同浓度的刺梨纳米颗粒溶液和纯多酚溶液对α-淀粉酶活性的抑制能力的大小，根据下列公式进行计算：α-淀粉酶酶活抑制能力=[a
0-(a
k-ai)]/a0×
100%其中，a0阳性对照组溶液中还原糖含量(mg)；ak样品组溶液中还原糖含量(mg)；ai为阴性对照组溶液中还原糖含量(mg)。
[0045]
如图3，结果显示，rnps对α-淀粉酶抑制效果显著，随着rnps浓度增加，抑制效果随之增加。且rnps浓度超过5mg/ml时候，其抑制效果超过80%，相对比，纯多酚对于α-淀粉酶抑制效果只有不到30%，这说明刺梨天然纳米结构对于化学反应具有重要作用，能够更好抑制α-淀粉酶活性。
[0046]
实施例8：刺梨天然纳米颗粒rnps对α-糖苷酶抑制能力的测试实验（1）三角瓶中加入40 ml（0.5mg/ml）的可溶性淀粉溶液，将三角瓶放置于37℃恒温振荡水浴锅中，预热5 min。
[0047]
（2）预热后的三角瓶中分别加入3ml各个浓度的纯多酚溶液和刺梨纳米颗粒溶液，3 ml（500 u/ml）α-淀粉酶酶液，于水浴锅中振荡反应30 min，取消化悬浊液4 ml，立即于沸水浴中进行灭酶。
[0048]
（3）灭酶结束后，离心（6000 r/min，10 min，4℃），取上清液测溶液中的还原糖含量。
[0049]
（4）用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。
[0050]
（5）阳性对照用3 ml（500 u/ml）α-糖苷酶液与3 ml（5 mg/l）的可溶性淀粉溶液，而阴性对照为3ml各个浓度的纯多酚溶液和刺梨纳米颗粒溶液与40 ml（0.5 mg/ml）的可溶性淀粉溶液反应。不同浓度的刺梨纳米颗粒溶液和纯多酚溶液对α-淀粉酶活性的抑制能力
的大小，根据下列公式进行计算：α-糖苷酶酶活抑制能力=([a
0-(a
k-ai)])/a0×
100%其中，a0阳性对照组溶液中还原糖含量(mg)；ak样品组溶液中还原糖含量(mg)；ai为阴性对照组溶液中还原糖含量(mg)。
[0051]
如图4，结果显示，rnps对α-糖苷酶抑制效果显著，随着rnps浓度增加，抑制效果随之增加。且rnps浓度超过10mg/ml时候，其抑制效果超过75%，相对比，纯多酚对于α-淀粉酶抑制效果只有不到50%，这说明刺梨天然纳米结构对于化学反应具有重要作用。，能够更好抑制α-糖苷酶活性。
[0052]
以上未涉及之处，均适用于现有技术及本领域技术人员的常规技术手段。
[0053]
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。