一种混合催化剂及其在蛋白质含量测定中的应用的制作方法

1.本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种混合催化剂及其在蛋白质含量测定中的应用。


背景技术：

2.烟草中的蛋白质是对烟叶品质有重要影响的化合物之一，首先烟株生长发育过程中，蛋白质是保证机体活力的物质基础，其次烟叶在采摘后，烘烤及醇化过程中蛋白质会和其他化学物质发生一系列的化学反应，一方面会生成改善烟叶的吸食品质的香味成分等，提高烟叶的使用价值，另一方面也会生成具有刺激性和辛辣的物质，如氨等。因此要将烟叶中的蛋白质含量控制在一定范围内。
3.目前烟草行业中对于蛋白质的的检测，大多是以红色氧化汞作为消化反应时的催化剂，而红色氧化汞属于剧毒化学物，它的保管、使用及废液处理都需要严格监督与管理，不仅需要大量额外的人力来进行管理，且容易造成环境污染，另外使用红色氧化汞作为催化剂时，样品消化时间也较长，导致检测效率大大降低。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的是提供一种混合催化剂及其在蛋白质含量测定中的应用，通过加入的催化助剂能够提高混合催化剂的催化活性，从而有利于减少消化时间，提高检测效率。
5.本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
6.一种混合催化剂，包括硫酸铜和硒粉，还包括催化助剂，所述催化助剂是以碳气凝胶作为载体，载体上负载纳米四氧化三铁后再接枝乳酸制成。
7.本发明的混合催化剂，还加入了催化助剂，在使用的时候，接枝的聚乳酸能够破坏蛋白质分子中的α-螺旋和β-折叠，蛋白质分子的高级结构，使得其更容易被消化，分解成氨，同时作为载体的碳气凝胶具有多孔的结构，且表面具有更多的活性空位，在使用的时候有利于吸附和活化蛋白质，提高表面蛋白质的浓度，提高催化效率，但是碳气凝胶质量较轻且不易和反应底物相分离，因此在碳气凝胶上负载的纳米四氧化三铁，一方面能够增加载体的质量，使得其能够更好的进入反应液中，形成悬浊液，另一方面能够增加催化助剂的磁性，有利于后期分离回收二次利用。
8.进一步，所述硫酸铜、硒粉和催化助剂的质量比为(10-15):1:(0.1-0.2)。
9.进一步，所述催化助剂的制备方法为：
10.负载：取硫酸亚铁铵搅拌溶解于水合肼中，得到硫酸亚铁铵溶液，将经过预处理的碳气凝胶粉末加入乙二醇中，超声分散后，加入硫酸亚铁铵溶液，于1000-1200r/min的转速下持续搅拌30-40min，调节ph至11-13，加热至沸腾回流2-4h，反应完成后过滤，滤饼用无水乙醇和去离子水现有冲洗，烘干得到负载纳米四氧化三铁的载体；
11.接枝：取制备得到的负载纳米四氧化三铁的载体加入四氢呋喃中，超声分散后，滴
加加入辛酸亚锡，再滴加加入乳酸，滴加完成后，抽真空，在50-75℃温度下搅拌反应4-6h，反应产物加入氯仿中，搅拌20min后离心，得到沉淀真空干燥得到催化助剂。
12.进一步，所述负载步骤中采用1mol/l的氢氧化钠乙二醇溶液进行ph的调节。
13.进一步，所述负载步骤中的预处理为：取碳气凝胶粉末加入球磨机中，喷洒加入甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，加入玛瑙圆珠，在转速为150-200r/min的条件下进行球磨15-18h，球磨完成后过滤得到碳气凝胶粉末，洗涤后烘干。
14.通过对碳气凝胶粉末进行湿法球磨，能够降低碳气凝胶粉末的团聚，使得其在使用的过程中更容易分散，同时，加入甲基丙烯酰氧基硅烷水解液对其进行处理，还能够增加其亲水性能，能够在一定程度上促使其能够更好的和反应液接触，起到更好的助催化效果。
15.进一步，所述碳气凝胶粉末和甲基丙烯酰氧基硅烷水解液的固液比为1:(2-20)，所述碳气凝胶粉末和玛瑙圆珠的质量比为1:(20-50)。
16.此外，本发明还公开了上述催化剂在烟草制品蛋白质检测中的应用。
17.进一步，所述混合催化剂在进行烟草制品的消化时，消化温度为380℃，消化时间为1h。
18.进一步，所述应用具体包括以下步骤，
19.s1：样品处理液的制备：按照yc/t31制备烟草样品，并测定水分含量，准确称取烟草样品，置于消化管中，依次加入混合催化剂后，加入硫酸钾，再加入浓硫酸，将消化管置于消化器中进行消化，消化完成后将消化管提出，稍冷，缓慢加入少量水并摇匀，冷却至室温，用水定容至刻度，混匀，得样品处理液；
20.s2：标准配制液的制备：于消化管中，依次加入混合催化剂后，加入硫酸钾，再加入浓硫酸，将消化管置于消化器中进行消化，消化完成后将消化管提出，稍冷，缓慢加入少量水并摇匀，冷却至室温，用水定容到刻度，混匀，待用；
21.s3：储备液的制备：称取硫酸铵于消化管中，加入混合催化剂后，加入硫酸钾，再加入硫酸，于消化器内进行消化，待冷却后移入容量瓶，用s2步骤中的标准配制液定容摇匀；
22.s4：工作标准液的制备：根据预计检测到的样品的总氮含量，用s2步骤中的标准配制液定容s3步骤中制备出的储备液，得到氮含量浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％的工作标准液；
23.s5：洗针液的制备：用s2步骤中制备出的标准配制液作洗针液；
24.s6：结果检测：使用流动分析仪，按照烟草行业标准方法后续步骤进行上机检测，并计算结果。
25.本发明的有一种混合催化剂，具有如下优点：
26.1、本发明的混合催化剂，避免了红色氧化汞的使用，不仅避免了使用过程中存在的对检测人员造成伤害的隐藏危险，同时省去了保管、废液处理等问题，环保、安全。
27.2、本发明的混合催化剂，通过添加的催化助剂能够提高硫酸铜、硒粉的催化作用，有利于提高催化效率，降低蛋白质消化时间，且使用后能够进行回收二次利用，有利于降低蛋白质检测成本。
28.3、本发明的混合催化剂，应用于对烟草中蛋白质含量进行检测时，和现有的标准方法检测出结果无显著差异，稳定性好，且样品消化处理时间明显小于现有的标准检测方法。
具体实施方式
29.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制：
30.实施例一催化剂的制备1
31.催化助剂的制备
32.预处理：量取甲基丙烯酰氧基硅烷滴加加入1wt％的醋酸水溶液中，同时搅拌至溶液澄清透明，得到甲基丙烯酰氧基硅烷质量分数为2wt％的甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，备用；取碳气凝胶粉末加入球磨机中，喷洒加入甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，加入玛瑙圆珠，碳气凝胶粉末和甲基丙烯酰氧基硅烷水解液的固液比为1:5，碳气凝胶粉末和玛瑙圆珠的质量比为1:20，在转速为150r/min的条件下进行球磨16h，球磨完成后过滤得到碳气凝胶粉末，洗涤后烘干。
33.负载：取1.0g硫酸亚铁铵搅拌溶解于10ml水合肼中，得到硫酸亚铁铵溶液，将0.25g 经过预处理的碳气凝胶粉末加入15ml乙二醇中，超声分散后，加入硫酸亚铁铵溶液，于 1200r/min的转速下持续搅拌35min，调节ph至11-13，加热至沸腾回流3h，反应完成后过滤，滤饼用无水乙醇和去离子水先后冲洗，烘干得到负载纳米四氧化三铁的载体；
34.接枝：取0.2g制备得到的负载纳米四氧化三铁的载体加入10ml四氢呋喃中，超声分散后，滴加加入1ml辛酸亚锡-乙二醇溶液，再滴加加入2g乳酸，滴加完成后，抽真空，在60℃温度下搅拌反应5h，反应产物加入氯仿中，搅拌20min后离心，得到的沉淀真空干燥得到催化助剂。
35.本实施例的混合催化剂，包括硫酸铜0.2g、硒粉0.02g、催化助剂2mg。
36.实施例二催化剂的制备2
37.催化助剂的制备
38.预处理：量取甲基丙烯酰氧基硅烷滴加加入1wt％的醋酸水溶液中，同时搅拌至溶液澄清透明，得到甲基丙烯酰氧基硅烷质量分数为1wt％的甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，备用；取碳气凝胶粉末加入球磨机中，喷洒加入甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，加入玛瑙圆珠，碳气凝胶粉末和甲基丙烯酰氧基硅烷水解液的固液比为1:20，碳气凝胶粉末和玛瑙圆珠的质量比为1: 50，在转速为180r/min的条件下进行球磨15h，球磨完成后过滤得到碳气凝胶粉末，洗涤后烘干。
39.负载：取1.2g硫酸亚铁铵搅拌溶解于10ml水合肼中，得到硫酸亚铁铵溶液，将0.2g 经过预处理的碳气凝胶粉末加入15ml乙二醇中，超声分散后，加入硫酸亚铁铵溶液，于 1000r/min的转速下持续搅拌30min，调节ph至11-13，加热至沸腾回流2h，反应完成后过滤，滤饼用无水乙醇和去离子水先后冲洗，烘干得到负载纳米四氧化三铁的载体；
40.接枝：取0.2g制备得到的负载纳米四氧化三铁的载体加入10ml四氢呋喃中，超声分散后，滴加加入2ml辛酸亚锡-乙二醇溶液，再滴加加入2.5g乳酸，滴加完成后，抽真空，在75℃温度下搅拌反应4h，反应产物加入氯仿中，搅拌20min后离心，得到沉淀真空干燥得到催化助剂。
41.本实施例的混合催化剂，包括硫酸铜0.24g、硒粉0.02g、催化助剂3mg。
42.实施例三催化剂的制备3
43.催化助剂的制备
44.预处理：量取甲基丙烯酰氧基硅烷滴加加入1wt％的醋酸水溶液中，同时搅拌至溶液澄清透明，得到甲基丙烯酰氧基硅烷质量分数为1.5wt％的甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，备用；取碳气凝胶粉末加入球磨机中，喷洒加入甲基丙烯酰氧基硅烷水解液，加入玛瑙圆珠，碳气凝胶粉末和甲基丙烯酰氧基硅烷水解液的固液比为1:12，碳气凝胶粉末和玛瑙圆珠的质量比为 1:35，在转速为200r/min的条件下进行球磨15h，球磨完成后过滤得到碳气凝胶粉末，洗涤后烘干。
45.负载：取2.0g硫酸亚铁铵搅拌溶解于15ml水合肼中，得到硫酸亚铁铵溶液，将0.25g 经过预处理的碳气凝胶粉末加入15ml乙二醇中，超声分散后，加入硫酸亚铁铵溶液，于 1100r/min的转速下持续搅拌40min，调节ph至11-13，加热至沸腾回流4h，反应完成后过滤，滤饼用无水乙醇和去离子水先后冲洗，烘干得到负载纳米四氧化三铁的载体；
46.接枝：取0.2g制备得到的负载纳米四氧化三铁的载体加入10ml四氢呋喃中，超声分散后，滴加加入1.5ml辛酸亚锡-乙二醇溶液，再滴加加入3g乳酸，滴加完成后，抽真空，在50℃温度下搅拌反应6h，反应产物加入氯仿中，搅拌20min后离心，得到沉淀真空干燥得到催化助剂。
47.本实施例的混合催化剂，包括硫酸铜0.3g、硒粉0.02g、催化助剂4mg。
48.实验一
49.利用实施例一～实施例三制备得到的催化剂对烟草制品进行消化处理，同时以不添加催化助剂的混合催化剂作为对比例，具体为：
50.取相同的烟叶样品(出自重庆中烟技术中心原料室)，等分为6份，其中三份分别加入实施例一～实施例三制备得到的混合催化剂，另外三份加入实施例一～实施例三中除去催化助剂后的混合催化剂，分别记为对比例一、对比例二和对比例三，在380℃温度下分别消化 0.5、1.0、1.5、2.0h，其余试验条件不变。检测结果如表1所示。
51.表1
[0052][0053]
通过表1数据可以看出，采用本发明制备得到的混合催化剂，在消化时间为1h左右，检测的结果就基本上没有明显变化，而在不添加催化助剂时，消化时间大约在1.5h左右，检测结果没有明显变化，证明本技术的催化助剂能够有利于提高催化剂的催化效果。
[0054]
实验二
[0055]
对加入的催化助剂是否会对烟草中蛋白质含量的检测造成干扰进行试验，取催化助剂 2mg、3mg、4mg、5mg、6mg于75ml消化管中，分别加入硫酸钾2.0g、硫酸铜0.2g、硒粉 0.02g、浓硫酸5ml，消化条件380℃1.0h，冷却定容到刻度，摇匀后作为样品进行检测，发现在仪器上无响应，说明催化助剂在小于6mg时，不会对结果产生干扰。
[0056]
实施例四
[0057]
利用实施例一～实施例三制备得到混合催化剂对烟叶样品中的蛋白质含量进行检测，同时以现有的yc/t 161—2002标准方法作为对比，烟叶样品选取不同等级烤烟10个、白肋烟和雪茄烟的烟叶样品各2个，具体如下所示：
[0058]
主要的试剂、材料与仪器
[0059]
实验室控制样品(购买自国家烟草质量监督检验中心)，其总氮标注值分别为(2.14
±ꢀ
0.11)％，其中烟叶样品均出自重庆中烟技术中心原料室。
[0060]
红色氧化汞(ar，贵州省铜仁汞矿化学试剂厂)；五水合硫酸铜(ⅱ)(ar，国药集团)；硒粉(br,国药集团)；硫酸钾(ar，国药集团)；聚乙氧基月桂醚溶液(30％，荷兰skalar 公司)；水杨酸钠(ar，国药集团)；硝普钠(ar，美国sigma aldrich公司)；氯化钠(ar，国药集团)；硫酸(ar，国药集团)；酒石酸钾钠(ar，美国sigma aldrich公司)；十二水合磷酸氢二钠(ar，国药集团)；氢氧化钠(ar，国药集团)；次氯酸钠(ar，国药集团)；二氯异氰尿酸钠(ar，东京化成株式会社)。
[0061]
skalar san

连续流动分析仪(荷兰skalar公司)；dk20消化器(意大利velp公司)；ax504 分析天平(感量:0.0001g，瑞士mettler toledo公司)；fd115电热鼓风干燥箱(德国binder 公司)；3100粉碎磨(瑞典perten公司)；milli-q direct 16纯水机(美国millipore公司)。
[0062]
具体操作为：
[0063]
s1：样品处理液的制备：按照yc/t31制备烟草样品，并测定水分含量，准确称取0.1000 g(精确至0.0001g)烟草样品，置于75ml消化管中，依次加入硫酸钾的质量为2.0g，本发明制备得到的混合催化剂后，再加入5ml浓硫酸，将消化管置于消化器中，按380℃，1.0 h的条件进行消化，消化完成后将消化管提出，稍冷，缓慢加入少量水并摇匀，冷却至室温，用水定容至75ml，混匀，得样品处理液。
[0064]
s2：标准配制液的制备：于75ml消化管中，依次加入催化剂后，加入硫酸钾，再加入5 ml浓硫酸，将消化管置于消化器中，按380℃，1.0h的条件进行消化，消化完成后将消化管提出，稍冷，缓慢加入少量水并摇匀，冷却至室温，用水定容到刻度，混匀，待用。
[0065]
s3：储备液的制备：称取1.2g硫酸铵于75ml消化管中，加入硫酸钾的质量为2.0g，硫酸铜的质量为0.3g，硒粉的质量为0.02g，再加入5ml硫酸，在380℃，1.0h的条件下消化，待冷却后移入250ml容量瓶，用s2步骤中的标准配制液定容摇匀。
[0066]
s4：工作标准液的制备：根据预计检测到的样品的总氮含量，分别移取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml的储备液，于5个100ml容量瓶，分别用s2步骤中的标准配制液定容s3步骤中制备出的储备液作工作标准液，得到工作标准液中氮含量浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、 0.8％、1.0％。
[0067]
s5：洗针液的制备：用s2步骤中制备出的标准配制液作洗针液；
[0068]
s6：结果检测：使用流动分析仪，按照烟草行业标准方法后续步骤进行上机检测，并计算结果。
[0069]
检测结果如表2所示：
[0070]
表2烟叶样品实验结果
[0071]
烟叶样品本方法(％)标准方法(％)相对偏差(％)
烤烟1#5.195.131.16烤烟2#4.624.580.87烤烟3#4.724.730.21烤烟4#5.145.160.39烤烟5#4.584.641.30烤烟6#5.695.70.18烤烟7#6.926.841.16烤烟8#6.676.680.15烤烟9#5.495.50.18烤烟10#6.276.320.79雪茄1#8.18.170.86雪茄2#9.249.121.30白肋烟1#11.5611.670.95白肋烟2#12.6212.530.72
[0072]
通过表2数据可以看出，采用本技术的混合催化剂对烟草制品中蛋白质含量进行检测，检测结果和现有的标准方法测定出的结果无显著差异,稳定性、重复性较好，但是消化处理时间减少，有利于缩短检测时间，提高生产效率。
[0073]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。