一种白细胞介素-6的检测试剂条及其应用的制作方法

1.本发明涉及免疫分析领域，尤其涉及一种白细胞介素-6的检测试剂条及其应用。


背景技术：

2.白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。最初是指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子。现在是指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息、激活与调节免疫细胞、介导t、b细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起着重要作用。
3.白细胞介素-6是一种多效细胞因子，能够辅助临床急诊病人急性炎症的早期诊断。白细胞介素-6在传染性炎症的早期阶段，由受到toll样受体刺激的单核细胞和巨噬细胞产生。在非感染性炎症，如烧伤或外伤性损伤中，也可以由受到toll样受体刺激的细胞产生。
4.目前临床上白细胞介素-6的检测，主要方法有elisa法、化学发光法和免疫荧光法等。
5.其中elisa方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低、易受干扰等；化学发光法灵敏度高，特异性好，但是一般化学发光机器由于有复杂的液路清洗系统，机器一般比较庞大，即使通过优化设计使变小，但是同时使得机器的日常维护变得困难。
6.因此亟需一种白细胞介素-6的检测试剂条及其应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种白细胞介素-6的检测试剂条及其应用。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
9.本发明的第一方面是提供一种白细胞介素-6的检测试剂条，所述检测试剂条包括若干并排设置的孔位；所述孔位内分别设有用于套设磁棒的磁棒套、包被抗体磁珠、标记反应物、磁珠清洗液或预激发液中的至多一种。
10.优选地，所述包被抗体磁珠为包被有抗白细胞介素-6单克隆抗体的磁性微球。
11.优选地，所述标记反应物为标记有吖啶酯的抗白细胞介素-6单克隆抗体。
12.优选地，所述磁珠清洗液为含有吐温以及防腐剂的tris-hcl缓冲液。
13.优选地，所述预激发液为含有双氧水的硝酸溶液。
14.优选地，所述检测试剂条的0号孔位内设有用于套设磁棒的磁棒套；3号孔位内设有包被抗体磁珠；6号孔位内设有标记反应物；7-9号孔位内均设有磁珠清洗液；10号孔位内设有预激发液。
15.本发明的第二方面是提供一种采用如上所述检测试剂条的检测方法，步骤包括：
16.s1、将样本加至4号孔位，同时将所述包被抗体磁珠以及所述标记反应物转移至所述4号孔位，通过免疫反应结合为免疫复合物，所述免疫复合物为抗白细胞介素-6单克隆抗体包被的磁性微球-白细胞介素-6抗原-标记有吖啶酯的抗白细胞介素-6单克隆抗体；
17.s2、将所述免疫复合物依次转移至所述7-9号孔位，以通过洗涤去除尚未结合的抗原或所述标记反应物；
18.s3、将所述免疫复合物转移至所述10号孔位，加入激发液，即可测定化学发光反应的发光值。
19.本发明的第三方面是提供一种含有如上所述检测试剂条的检测试剂盒，还包括校准品。
20.优选地，所述校准品为含有白细胞介素-6抗原的bsa溶液。
21.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
22.本发明提供的白细胞介素-6检测试剂条，将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系；与现有技术相比，具有更高的检测灵敏度和特异性，达到了更佳的性能参数；所用检测技术为完全自动化随机检测系统，基于磁微粒化学发光技术，使用磁棒提取技术，并且采用即开即用的单人份检测方式，灵活性高，可同时进行不同试验，也可单个测试运作，从而获得更短的检测时间，并且大大降低了产品成本，完全自动化，配合使用一次性枪头，可避免污染，并减少从采样到生成结果的人工操作，提高了检测安全性和准确度。
附图说明
23.图1为本发明白细胞介素-6检测试剂条的结构示意图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
26.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
27.实施例1
28.本实施例提供一种白细胞介素-6检测试剂条，所述检测试剂条包括若干并排设置的孔位；所述孔位内分别设有用于套设磁棒的磁棒套、包被抗体磁珠、标记反应物、磁珠清洗液或预激发液中的至多一种。
29.所述磁棒套与专用上吸式磁珠转移枪配套，在进行白细胞介素-6检测时，磁棒可深入到液体内部快速提取磁珠，而所述磁棒套为一次性耗材，可防止磁珠污染磁棒，同时使得磁珠洗脱变得容易；各试剂均采用热封膜技术分别密封储存于相应孔位内，有效防止了试剂串孔，从而解决了运输问题。
30.其中，所述包被抗体磁珠为包被有抗白细胞介素-6单克隆抗体的磁性微球；所述
标记反应物为标记有吖啶酯的抗白细胞介素-6单克隆抗体；所述磁珠清洗液为含有吐温以及防腐剂的tris-hcl缓冲液；所述预激发液为含有双氧水的硝酸溶液。
31.如图1所示，所述检测试剂条的0号孔位内设有用于套设磁棒的磁棒套；3号孔位内设有包被抗体磁珠；6号孔位内设有标记反应物；7-9号孔位内均设有磁珠清洗液；10号孔位内设有预激发液。
32.实施例2
33.本实施例提供一种采用如实施例1所述检测试剂条的检测方法，步骤包括：
34.s1、将样本加至4号孔位，同时将所述包被抗体磁珠以及所述标记反应物转移至所述4号孔位，通过免疫反应结合为免疫复合物，所述免疫复合物为抗白细胞介素-6单克隆抗体包被的磁性微球-白细胞介素-6抗原-标记有吖啶酯的抗白细胞介素-6单克隆抗体；
35.s2、将所述免疫复合物依次转移至所述7-9号孔位，以通过洗涤去除尚未结合的抗原或所述标记反应物；
36.s3、将所述免疫复合物转移至所述10号孔位，加入激发液，即可测定化学发光反应的发光值，所述发光值与样本中白细胞介素-6的浓度呈正相关。
37.实施例3
38.本实施例提供一种含有如实施例1所述检测试剂条的检测试剂盒，还包括校准品。
39.其中，所述校准品为含有白细胞介素-6抗原的bsa溶液。
40.实施例4
41.本实施例提供了一种如实施例3所述检测试剂盒的制备方法，步骤包括：
42.(1)制备包被抗体磁珠
43.取1mg白细胞介素-6抗体，用pb缓冲液(ph8.1)在室温下透析不少于16-24h；在透析后的抗体中加入0.025mg生物素，混匀；将混合液置于恒温培养箱25
±
1℃，静置反应120
±
10min；使用pb缓冲液(ph7.4)于室温下透析生物素化抗体16-24h；
44.把链霉亲和素磁珠摇匀，容器底部沉淀全部混匀，然后吸取20mg磁珠，用不低于磁珠2倍体积的磁珠清洗液清洗两遍，然后用白细胞介素-6磁珠保存液把磁珠复溶至不低于5mg/ml；把磁珠和生物素化抗体混合，磁珠终浓度不低于10mg/ml，磁珠置于恒温振荡箱37
±
2℃，180rmp/min摇匀反应16-24h；把反应后的磁珠取下，用不低于2倍反应体积的磁珠清洗液清洗4遍，将磁珠液用白细胞介素-6磁珠保存液稀释至25μg/ml，2-8℃保存待用。
45.(2)制备标记反应物
46.取1mg白细胞介素-6标记抗体，用pb缓冲液(ph8.1)于室温下透析16-24h；把透析好的抗体用pb缓冲液(ph 8.1)将抗体稀释到1.0mg/ml，取0.1mg吖啶酯，把抗体与吖啶酯快速混匀；将溶液置于恒温培养箱25
±
2℃，静置反应120
±
10min，反应全程需避光；使用g-50层析柱进行纯化，纯化好的吖啶酯标记抗体用白细胞介素-6吖啶酯标记保存液稀释至60ng/ml，2-8℃保存待用。
47.(3)配制磁珠清洗液
48.室温条件下，向一定体积的纯化水中加入1.212g tris、9.0g氯化钠、0.4ml hcl、0.2ml tween-20、5.0ml 20％nan3、0.5ml brij-35，混合均匀后检测ph值为8.3
±
0.2，纯化水定容至1l。
49.(4)配制预激发液
50.室温条件下，向一定体积的纯化水中加入44ml h2o2和0.55ml浓硝酸，混合均匀后检测ph值为2.5
±
0.2，纯化水定容至1l。
51.(5)配制白细胞介素-6磁珠保存液
52.室温条件下，向一定体积的纯化水中加入6.06g tris、9.0g氯化钠和3.8ml hcl，至少搅拌5min至完全溶解，然后加入1.0ml tween-20和5ml 20％nan3，最后缓慢加入10.0g bsa，至少搅拌10min至完全溶解；待所有成分完全溶解后，用ph计测ph值在7.2
±
0.2为合格，纯化水定容至1l。
53.(6)配制白细胞介素-6吖啶酯标记保存液
54.室温条件下，向一定体积的纯化水中加入6.06g tris、9.0g氯化钠和3.8ml hcl，至少搅拌5min至完全溶解，然后加入0.2ml tween-20和5ml 20％nan3，最后缓慢加入5.0g bsa和1.0g酪蛋白钠盐，至少搅拌10min至完全溶解；待所有成分完全溶解后，用ph计测ph值在7.2
±
0.2为合格，纯化水定容至1l。
55.(7)配制白细胞介素-6定标品
56.将白细胞介素-6抗原用2％bsa配制成定标品并冻干，浓度分别为10和1000pg/ml。
57.(8)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃。
58.本实施例所制得的检测试剂盒需进行如下检查：
59.(1)物理检查：试剂条肉眼观察应清洁，试剂条各孔内无明显杂质，封膜良好；冻干品为一定体积的白色块状或粉末状，无明显其他杂质；
60.(2)准确性：分别测定低、中、高三个浓度的内部质控品(l、m、h)，测定值应在允许范围内；
61.(3)线性：剂量-反应曲线在1.5-5000pg/ml浓度范围内，相关系数r绝对值不低于0.99；
62.(4)分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于1.5pg/ml；
63.(5)精密度：
①
批内差，同一批次试剂盒平行测定精密性参考品(n＝10)，要求精密度(cv％)不高于8％；
②
批间差，三个不同批次试剂盒平行测定精密性参考品(n＝3
×
10)，要求精密度(cv％)不高于10％；
64.(6)稳定性：37℃放置7天，测定值仍应符合上述各项要求。
65.实施例5
66.本实施例提供一种如实施例3所述检测试剂盒的使用方法，采用cn107525922a的检测仪器，将所述试剂条置放于孵育仓后，包括如下步骤：
67.s1、取出试剂，按照要求避光置于室温环境、试剂条应留在不透光铝箔袋中，如需取出，建议连同黑色塑料盒一起放置；
68.(如果是第一次使用该批号的试剂、质控品检测超出靶值范围或者已经使用同一批号试剂达到28天，则需要在检测前使用校准品对仪器进行定标；
69.校准方法如下：用仪器扫描定标卡，将试剂的校准主曲线存入仪器，检测复溶完全的校准品，每个校准品测定两次，根据校准品的浓度和发光值重新拟合出新的校准曲线；检测复溶完全的质控品，根据质控品的靶值范围判断试剂是否在控；)
70.s2、把待测样本置于样本架上，然后放入仪器相应位置；
71.s3、设置输入检测程序；
72.s4、取所需数量的试剂条，按照屏幕提示插入至仪器上的对应通道，并保证插入到底且无松动；
73.s5、点击屏幕上开始按钮开始检测反应；
74.s6、反应完成后，可从仪器界面直接读取检测结果。
75.检测实施例
76.采集213例白细胞介素-6临床标本，采用本试剂盒与已上市同类产品(白介素6检测试剂盒-电化学发光法，罗氏公司)进行同步比对，结果显示：相关系数(r)＝0.976，阳性符合率＝98.3％，阴性符合率＝98.9％，总符合率＝98.6％。
77.综上所述，本发明的白细胞介素-6检测试剂条，至少具有如下性能优势：
78.1)线性范围：本试剂盒检测范围为1.5-5000pg/ml；
79.2)线性：取线性范围上限(约5000pg/ml)的样本进行稀释，计算结果平均值与稀释比例的相关系数为r＝0.99；
80.3)hook效应：浓度≤200000pg/ml的样本无明显钩状效应；
81.4)方法学比对：共213例临床样本，用本试剂盒和已上市试剂盒同时进行测试，两者的结果进行相关系数统计，相关系数r＝0.976；
82.5)与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有较高的临床应用价值；
83.6)采用一次性磁棒套，防止磁珠污染磁棒，同时使得磁珠洗脱变得容易；
84.7)采用包含除激发液之外的全部反应液，避免仪器复杂的液路系统，使得仪器小型化同时变得易于维护；
85.8)单条单测试的检测方式，实现了项目poct化；
86.9)采用1.0-1.5μm的磁珠使得反应迅速，从样本上机到报告结果，总时间在14分钟内；
87.10)采用热封膜技术，有效防止了试剂串孔，解决了运输问题。
88.以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。