FOXQ1激活剂在抑制人脐带间充质干细胞衰老中的应用的制作方法

foxq1激活剂在抑制人脐带间充质干细胞衰老中的应用
技术领域
1.本发明属于干细胞领域，涉及foxq1激活剂在抑制人脐带间充质干细胞衰老中的应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一种具有高度自我更新、多向分化及独特免疫调节能力特性的细胞，其可以通过与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用以及分泌细胞调节性因子发挥免疫调节作用。间充质干细胞外泌体(exosomes frommesenchymal stem cells，mscs-exo)就是mscs发挥功能的一种分泌物质。研究表明，mscs-exo具有多种活性，比如组织修复、免疫调节和疾病治疗，越来越被重视。
3.脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells，uc-mscs)具有来源充足、取材方便、培养简单等特点，也不存在伦理学问题，因而得到广泛研究。
4.然而，体外培养的包括uc-mscs在内的mscs易衰老特性制约着其临床发展与应用。如何延缓uc-mscs的衰老成为国内外学者研究的热点。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术不足，提供foxq1激活剂在抑制人脐带间充质干细胞衰老中的应用。
6.本发明目的通过如下技术方案实现：
7.foxq1激活剂用于体外培养人脐带间充质干细胞抑制其衰老的用途。
8.进一步的，所述激活剂包括小分子化合物、核酸分子以及包含所述核酸分子的表达载体，所述小分子化合物包括千金子二萜醇。
9.技术效果：
10.d-半乳糖诱导是构建体外衰老细胞模型的经典方法。本发明研究结果发现，foxq1激活剂一方面可以提高uc-mscs的抗衰老活性，另一方面可以提高其体外增殖活性。因此，foxq1激活剂可以用于体外培养uc-mscs抑制其衰老。
附图说明
11.图1中a为uc-mscs的倒置显微镜观察图，b为uc-mscs的流式细胞仪检测图；
12.图2中a为各组uc-mscs中foxq1蛋白表达水平比较，b为各组衰老细胞比例，c为各组细胞增殖活性。
具体实施方式
13.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
14.一、实验材料
15.胎牛血清、dmem/f12培养基购自gibco公司，双抗、pbs和胰蛋白酶购自碧云天生物。fitc或pe标记的小鼠抗人cd90、cd105、cd73、cd14、cd34和cd45抗体及各相关同型对照购自美国ebioscince公司。千金子二萜醇购自源叶生物。trizol试剂盒购自赛默飞世尔。western blot相关试剂材料购自碧云天生物等。
16.二、实验方法
17.1、uc-mscs分离培养
18.按照常规方法在无菌条件下取健康足月顺产新生儿脐带组织，用含1％双抗的pbs洗涤多次以去除残血，并剔除脐动静脉，留下wharton胶样组织，将其剪碎，形成约1mm3的小块，然后用含10％胎牛血清和1％双抗的dmem/f12培养基于37℃、5％co2、饱和湿度条件培养，每3～4d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞长至90％融合时，胰蛋白酶消化传代培养。取第3代uc-mscs用于流式检测表面标志物。流式检测方法为：取第3代uc-mscs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1
×
106个/ml，每离心管中加入1ml细胞悬液，无菌pbs洗涤2次，1000
×
g离心5min，弃上清，100μlpbs重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量cd90、cd105、cd73、cd14、cd34和cd45抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000
×
g离心5min，pbs洗涤2次，加入500μlpbs重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
19.2、uc-mscs分组和foxq1蛋白表达水平检测
20.实验分为空白对照组(blank)、低浓度药物组(low concentration，lc)和高浓度药物组(how concentration，hc)。取生长状态良好的uc-mscs，用含10％胎牛血清和1％双抗的dmem/f12培养基于37℃、5％co2、饱和湿度条件培养，接种于培养板中，并分组如下：
21.blank组：完全培养基培养；
22.lc组：含50μg/ml千金子二萜醇的完全培养基培养；
23.hc组：含100μg/ml千金子二萜醇的完全培养基培养。
24.western blot法测定foxq1蛋白表达水平：培养24h后，收集细胞，裂解，按照bca试剂盒说明书提取总蛋白并计算蛋白浓度，以空白对照组蛋白浓度为标准调整药物组蛋白浓度。调整蛋白浓度一致后，加入5
×
上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入foxq1、β-actin一抗，4℃孵育过夜。tbst反复洗膜后，hrp标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照，image j软件分析灰度值。。
25.3、抗衰老活性测定
26.首先按照“2、uc-mscs分组和foxq1蛋白表达水平检测”中方法获得药物干预24h的uc-mscs及其空白对照，然后将这三种uc-mscs接种于24孔板中，每孔0.5ml，每孔含有细胞2
×
105个。待细胞完全贴壁后，全部更换为含有10mg/mld-半乳糖的完全培养基培养24h诱导uc-mscs衰老。24h后，使用sa-β-gal检测试剂盒检测细胞衰老，衰老细胞呈蓝色。于倒置显微镜下观察，每组随机取3个视野，计数衰老细胞比例(视野内衰老细胞占视野内总细胞的百分比)。
27.4、细胞增殖活性测定
28.首先按照“2、uc-mscs分组和foxq1蛋白表达水平检测”中方法获得药物干预24h的uc-mscs及其空白对照，然后将这三种uc-mscs接种于96孔板中，每孔100μl，每组设6个复
孔。培养24h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，培养4h，去上清液，加入150μldmso轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(od值)，通过od值按照如下公式计算药物组增殖活性，blank组增殖活性计为100％：药物组增殖活性＝药物组od值/blank组od值
×
100％。吸光度越高代表增殖活性越强。
29.5、统计学分析
30.采用graphpad prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，p《0.05认定为差异显著。
31.三、实验结果
32.1、uc-mscs倒置显微镜下观察结果
33.图1中a为uc-mscs的倒置显微镜观察图，可见细胞呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合uc-mscs细胞生物学特点。
34.图1中b为流式细胞仪检测图，cd90、cd105、cd73阳性表达，cd14、cd34和cd45阴性表达，符合uc-mscs表面标记特点。
35.2、foxq1蛋白表达水平检测结果
36.图2中a为各组uc-mscs中foxq1蛋白表达水平比较，药物组组foxq1蛋白表达水平显著高于blank组，且可见明显的剂量依赖性。
37.3、抗衰老活性测定结果
38.表1和图2中b为各组衰老细胞比例，药物组衰老细胞比例显著低于blank组，且可见明显的剂量依赖性。
39.表1各组衰老细胞比例
[0040][0041]
*代表与blank组相比差异显著。
[0042]
4、细胞增殖活性测定
[0043]
表2和图2中c为各组细胞增殖活性，药物组细胞增殖活性显著高于blank组，且可见明显的剂量依赖性。
[0044]
表2细胞增殖活性
[0045][0046]
*代表与blank组相比差异显著。
[0047]
d-半乳糖诱导是构建体外衰老细胞模型的经典方法。上述研究结果说明，提高
foxq1蛋白表达水平一方面可以提高uc-mscs的抗衰老活性，另一方面可以提高其体外增殖活性，且呈现明显的剂量依赖性。千金子二萜醇可能正是通过这种激活foxq1机理发挥抗人脐带间充质干细胞衰老的作用。
[0048]
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。