南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基因及其筛选方法和应用与流程

技术特征：
1.南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因，其特征在于，包括15个内参基因，所述内参基因分别为：18s核糖体rna、肌动蛋白、网格蛋白、水孔蛋白、延伸因子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、组蛋白、蛋白磷酸酶、核糖体蛋白s13、s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶、ski互作蛋白、微管蛋白tua、微管蛋白tub、泛素缀合酶、多聚泛素基因，所述内参基因的核苷酸序列分别如seq id no.1～seq id no.15所示。2.用于实时荧光pcr扩增权利要求1所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的引物，其特征在于，用于扩增18srrna的引物序列为seq id no.16/seq id no.17，用于扩增肌动蛋白的引物序列为seq id no.18/seq id no.19，用于扩增网格蛋白的引物序列为seq id no.20/seq id no.21，用于扩增水孔蛋白的引物序列为seq id no.22/seq id no.23，用于扩增延伸因子的引物序列为seq id no.24/seq id no.25，用于扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶的引物序列为seq id no.26/seq id no.27，用于扩增组蛋白的引物序列为seq id no.28/seq id no.29，用于扩增蛋白磷酸酶的引物序列为seq id no.30/seq id no.31，用于扩增核糖体蛋白s13的引物序列为seq id no.32/seq id no.33，用于扩增s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的引物序列为seq id no.34/seq id no.35，用于扩增ski互作蛋白的引物序列为seq id no.36/seq id no.37，用于扩增微管蛋白tua的引物序列为seq id no.38/seq id no.39，用于扩增微管蛋白tub的引物序列为seq id no.40/seq id no.41，用于扩增泛素缀合酶的引物序列为seq id no.42/seq id no.43，用于扩增多聚泛素基因的引物序列为seq id no.44/seq id no.45。3.南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，包括：(1)采用南京椴不同组织等量rna混样构建全长cdna文库，并进行转录组测序；利用获得的南京椴全长转录组测序数据，以拟南芥中相应的15个内参基因序列为参考，采用本地blast获得权利要求1所述的15个南京椴内参基因序列；依据上述内参基因序列设计全长引物，以南京椴cdna为模板扩增上述序列，并对扩增产物进行测序验证；(2)以经过验证一致的序列作为模板，采用oligo7软件进行实时荧光定量pcr引物的设计，要求引物扩增片段长度为100～250bp，随后采用pcr扩增结合琼脂糖凝胶电泳验证引物扩增特异性，南京椴cdna为模板对特异性扩增的引物进行实时荧光定量pcr扩增并进行溶解曲线分析，获得权利要求2所述的15个内参基因实时荧光定量pcr溶解曲线呈现单峰扩增的引物；(3)分别采集南京椴不同组织以及胁迫处理后的不同组织样本，液氮速冻后，-70℃至-80℃冰箱保存；(4)分别提取上述样本的总rna后，经反转录反应获得互补的cdna样本。以反转录后获得cdna为模板进行实时荧光定量pcr检测，并记录ct值；(5)对实时荧光定量pcr得到的ct值数据，进行不同组织及胁迫条件下内参稳定性和内参数目分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合，最后对内参基因的稳定性进行综合排序；(6)在不同的实验条件下，采用2-δδct
法分别选取最稳定和最不稳定的内参基因进行校正目标基因的表达进行验证。4.根据权利要求3所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因
的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中，南京椴实时定量pcr中引物扩增特异性检测，采用普通pcr产物电泳和实时荧光定量pcr反应生成的溶解曲线法，其中电泳检测单一条带，片段大小100～250bp且实时荧光定量pcr溶解曲线为单峰，则证明荧光定量pcr引物局扩增的特异性，采用linregpcr软件计算引物扩增效率，确保扩增效率大于1.80。5.根据权利要求3所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述的不同组织样本采自15年生南京椴成熟植株的嫩根、嫩茎、成叶、苞片、花苞、盛开花、果实、未成熟种子和成熟种子共9个组织，胁迫处理包括低温、高温、淹水、干旱和盐胁迫7种处理，处理后分别于0、1、3、6、12、24和48h采集南京椴组培苗组织材料，其中高温和低温胁迫处理仅采集叶片组织，淹水、干旱和盐胁迫处理下分别采集叶片及根两个组织。6.根据权利要求5所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，所述的胁迫处理条件为：低温胁迫温度为0℃至8℃，高温胁迫温度为36℃至42℃，淹水胁迫为水面高于栽培基质表面2cm，盐胁迫采用hoagland’s水培营养液中添加3
‰
nacl模拟，水培营养液的ph＝5.5，干旱采用hoagland’s水培营养液中添加15％peg-6000模拟，水培营养液的ph＝5.5。7.根据权利要求3所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中各组织及处理条件下的试验材料在反转录反应中rna模板的用量均为0.5μg，反转录后获得的cdna原液稀释5倍，取1μl进行实时荧光定量pcr扩增，实时荧光定量pcr反应体系为10μl，上下游引物浓度0.5μm。8.根据权利要求3所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中实时荧光定量pcr反应程序为：第一步预变性94℃30s；第二步pcr反应95℃10s，60℃15s，40个循环；第三步溶剂曲线60℃-95℃逐渐升温。9.根据权利要求3所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)中采用genorm、normfinder、bestkeeper和deltact4种算法，分析内参基因的稳定性并排序；利用reffinder对4种算法得到的候选内参基因稳定性排序结果进行综合排名，得到综合排序结果。10.根据权利要求3所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤(6)中利用2-δδct法对应用内参基因进行目标基因基因表达量分析验证，δct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)，δδct＝δct(处理)-δct(对照)，2-δδct
＝目标基因相对表达量。11.权利要求1所述的南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量pcr内参基基因在计算目标基因相对表达量中的应用。

技术总结
本发明公开了南京椴不同组织及胁迫处理条件下实时定量PCR内参基基因及其筛选方法和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公布的15个内参基因来源于南京椴不同组织的全长转录组序列，并依据序列信息设计15对特异性实时定量PCR引物，分别对南京椴不同组织及胁迫处理的植物材料，进行实时定量PCR扩增，获得内参基因的Ct值，对候选内参基因的稳定性由强到弱进行排序，最后对排序结果进行综合评价，筛选获得不同组织及胁迫处理条件下最稳定的内参基因及组合。本发明筛选获得的内参基因及其引物，具有特异性强，适用性广的优点，填补了南京椴内参基因研究的空白。京椴内参基因研究的空白。京椴内参基因研究的空白。


技术研发人员：王欢利 汤诗杰 黄犀 严灵君 王仲伟 罗会婷
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/3/18