一种治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒及其使用方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于秀丽隐杆线虫模型的治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.近年来，由于生活水平的提高、饮食结构发生改变、生活节奏加快、久坐的生活方式等因素，导致全球糖尿病发病率增长迅速，并且患者年龄呈年轻化趋势，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病，预计到2030年，糖尿病患者的人数预计将达到4.38亿。其中2型糖尿病是最常见的糖尿病类型，在糖尿病患者中，2型糖尿病占95％以上。2型糖尿病患者发生结直肠癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的风险显著高于一般人群。
3.秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。秀丽隐杆线虫有以下几个特点：身体透明，结构简单，显微镜下易于观察；生命周期短，分为4个阶段：胚胎发育期、生长发育期、生殖期和生殖后期，能够作为相对完整的实验动物模型，又可避免大鼠、小鼠模型的高价、耗时的缺点，可大幅降低药物筛选的成本，是用于大规模药物筛选的理想系统，近年来越来越多地受到科学家们的青睐。
4.2型糖尿病的秀丽隐杆线虫模型在daf-2基因上携带有一个突变，而秀丽隐杆线虫中daf-2基因是人类胰岛素样生长因子受体的同源物。突变体秀丽隐杆线虫中由于daf-2基因的失活而引起了类似胰岛素抵治疗的代谢变化使线虫进入了dauer期状态，因此可以通过统计、比较空白对照组和待测药物组成虫数目占线虫总数(dauer期线虫数 成虫数)的百分比来判断待测药物是否具有治疗2型糖尿病活性。
5.由此本发明提供一种治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够高通量筛选治疗2型糖尿病药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法，供本领域研发人员高通量准确地筛选治疗2型糖尿病药物。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出治疗2型糖尿病药物。
7.本发明的另一个目的是提供上述治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒的使用方法。
8.本发明提供一种2型糖尿病药物筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下材料：
9.(1)秀丽隐杆线虫dr1564；
10.(2)5mg/ml的大肠杆菌op50菌液；
11.(3)线虫液体培养基。
12.所述的线虫液体培养基为s液培养基。
13.所述的s液培养基的配置方法为：量取s基础液50ml，1m mgso4溶液、1m cacl2溶液
各150μl，1m的柠檬酸缓冲液及trace液各500μl，5mg/ml胆固醇溶液50μl，将其混合均匀，现配现用。
14.所述的s基础液配置方法为：称量nacl 1.76g，kh2po
4 1.80g，k2hpo
4 0.30g，将上述混合物溶于300ml蒸馏水，121℃灭菌20min；
15.所述trace液的配置方法为：将0.093g edta,0.0345g feso4·
7h2o,0.0145g znso4·
7h2o,0.00125g cuso4·
5h2o,0.01g mncl2·
4h2o溶解于50ml蒸馏水中，121℃灭菌20min；
16.所述的s液培养基为160μl，大肠杆菌op50菌液为20μl。
17.所述的秀丽隐杆线虫dr1564为同步化后的线虫，线虫同步化的步骤为：
18.(1)用m9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管，5000-7000rpm离心7分钟，去除上清；
19.(2)加入裂解液，在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；
20.(3)5000-7000rpm离心7min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵：
21.(4)m9缓冲液冲洗两次，再加入1ml m9缓冲液，置于20℃恒温培养48小时，获得同步化的秀丽隐杆线虫dr1564。
22.优选的，离心时转速为6000rpm。
23.所述的m9缓冲液(以体积为400ml为例)配置方法为：称取nacl 1.99g，na2hpo
4 2.38g，kh2po
4 1.19g，无水mgso
4 0.048g。400ml蒸馏水完全溶解后，湿热灭菌(121℃，20min)，室温保存。
24.所述的裂解液的配置方法为：吸取320μl的10％naclo3溶液加入4.68ml的m9缓冲液混匀，然后与1m的naoh溶液等体积混合，现用现配。
25.本发明还提供上述治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒的使用方法：
26.(1)采用治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒筛选治疗2型糖尿病药,设定空白对照组和药液测定组,将96孔板中的每一孔设置为一个独立的实验单元；
27.(2)药液测定组：无菌条件下将80—100条线虫、160μl s液培养基、20μl大肠杆菌op50菌液、20μl含有待测药液的溶液，依次加入96孔板的孔中，使得每孔总体积均为200μl；
28.(3)空白对照组:将80—100条线虫、160μl s液培养基、20μl大肠杆菌op50菌液、与待测药物等量的s液,依次加入96孔板的孔中，使得每孔总体积均为200μl；
29.(4)加样完成后将96孔板置于20℃恒温培养96小时；
30.(5)结果的评价：镜检并计数空白对照组和药液测定组秀丽隐杆线虫dr1564成虫线虫数目和秀丽隐杆线虫dr1564总数目，分别计算空白对照组和药液测定组秀丽隐杆线虫dr1564成虫线虫数占秀丽隐杆线虫dr1564总数目的百分比，药液测定组成虫所占百分比大于空白对照组即说明待测药物具有治疗2型糖尿病活性。
31.优选的，加入96孔板中的线虫为100条。
32.所述的秀丽隐杆线虫dr1564总数目为秀丽隐杆线虫dr1564成虫数与dauer期线虫数之和。
33.所述的秀丽隐杆线虫dr1564成虫体型呈细长状，dauer期线虫体型呈短胖状。
34.本发明的有益效果：本发明提供的基于秀丽隐杆线虫模型的治疗治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒使用方法简单，准确率高，筛选速度快，可广泛用于筛治疗2型糖尿病药物。
35.以下提供具体实施例以实现本发明所述的治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒，但不限于这些实施例。
附图说明
36.图1使用治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒评估正钒酸钠的治疗2型糖尿病的功效
具体实施方式
37.实验生物：
38.daf-2突变株线虫dr1564，购买于the caenorhabditis genetics center(cgc)。
39.大肠杆菌e.coli op50，尿嘧啶营养缺陷型，作为培养c.elegans的标准食物，购自cgc。
40.实施例1试剂盒的装配
41.一种治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒，该试剂盒包括以下材料：
42.(1)秀丽隐杆线虫dr1564；
43.(2)5mg/ml的大肠杆菌op50菌液；
44.(3)s液培养基。
45.所述大肠杆菌op50的培养方法为：将高温湿热灭菌的lb固体培养基倒入直径为90mm的玻璃培养皿中，使其冷却凝固后，用接种环蘸取少量菌液，使用平板划线法分离菌落，然后放入37℃培养箱中培养过夜，以得到大肠杆菌op50单菌落，4℃保存备用。
46.所述的lb固体培养基(以200ml为例)配置方法为：分别称取分析纯的nacl和蛋白胨各2.00g，酵母粉1.00g，完全溶于200ml蒸馏水中后，再加入3.42g琼脂。经湿热灭菌(121℃，20min)后备用。
47.所述的秀丽隐杆线虫dr1564为同步化后的线虫，线虫同步化的步骤为：
48.(1)用m9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫dr1564冲下来，将冲洗液吸入离心管，6000rpm离心7分钟，去除上清；
49.(2)加入裂解液，在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫dr1564的虫体破裂释放卵；
50.(3)6000rpm离心2min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫dr1564卵：
51.(4)m9缓冲液冲洗两次，再加入1ml m9缓冲液，置于20℃恒温培养48小时，获得同步化的秀丽隐杆线虫dr1564。
52.实施例2试剂盒效果验证
53.钒酸盐可以影响糖代谢、刺激糖转运、氧化和抑制糖异生，钒制剂作为食物补充剂以及2型糖尿病和并发症的替代药物而得到广泛应用，多项体内外研究不断证实了钒化合物的降血糖作用，其中正钒酸钠已被用于研究对糖尿病小鼠和大鼠血糖水平的影响，因此选用正钒酸钠作为待测药物对试剂盒效果进行验证。
54.(1)药液测定组
55.无菌条件下将100条秀丽隐杆线虫dr1564、160μl s液培养基、20μl大肠杆菌op50菌液、20μl含有正钒酸钠药液的溶液，依次加入96孔板的孔中，使得每孔总体积均为200μl,设定三个平行；
56.(2)空白对照组
57.无菌条件下将100条秀丽隐杆线虫dr1564、160μl s液培养基、20μl大肠杆菌op50菌液、与正钒酸钠药液等量的s液,依次加入96孔板的孔中，使得每孔总体积均为200μl，设定三个平行；
58.(3)加样完成后将96孔板置于20℃恒温培养96小时；
59.(4)结果的评价：镜检并计数空白对照组和药液测定组秀丽隐杆线虫dr1564成虫线虫数目和秀丽隐杆线虫dr1564总数目，分别计算空白对照组和药液测定组秀丽隐杆线虫dr1564成虫线虫数占秀丽隐杆线虫dr1564总数目的百分比，结果如图1所示，显示正钒酸钠药液测定组成虫所占百分比大于空白对照组，说明正钒酸钠具有治疗2型糖尿病活性，该试剂盒准确有效。
60.所述的秀丽隐杆线虫dr1564总数目为秀丽隐杆线虫dr1564成虫数与dauer期线虫数之和。
61.所述的秀丽隐杆线虫dr1564成虫体型呈细长状，dauer期线虫体型呈短胖状。
62.所述正钒酸钠药液的配置方法为：称取0.3678g na3vo4,溶于1ml的蒸馏水中，保存备用。
63.实施例3试剂盒的使用
64.(1)采用治疗2型糖尿病药物筛选试剂盒筛选治疗2型糖尿病药,设定空白对照组和药液测定组,将96孔板中的每一孔设置为一个独立的实验单元；
65.(2)药液测定组：无菌条件下将100条秀丽隐杆线虫dr1564、160μl s液培养基、20μl大肠杆菌op50菌液、20μl含有待测药液的溶液，依次加入96孔板的孔中，使得每孔总体积均为200μl,设定三个平行；
66.(3)空白对照组:无菌条件下将100条秀丽隐杆线虫dr1564、160μl s液培养基、20μl大肠杆菌op50菌液、与待测药物等量的s液,依次加入96孔板的孔中，使得每孔总体积均为200μl，设定三个平行；
67.(4)加样完成后将96孔板置于20℃恒温培养96小时；
68.(5)结果的评价：镜检并计数空白对照组和药液测定组秀丽隐杆线虫dr1564成虫数目和秀丽隐杆线虫dr1564总数目，分别计算空白对照组和药液测定组秀丽隐杆线虫dr1564成虫数占秀丽隐杆线虫dr1564总数目的百分比，药液测定组成虫所占百分比大于空白对照组即说明待测药物具有治疗2型糖尿病活性。
69.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。