一种治疗肥胖症的药物筛选试剂盒及其使用方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗肥胖症的药物筛选试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.随着人们生活水平的不断提高，肥胖已成为21世纪严重威胁公众健康的重要因素，肥胖会引发多种疾病，如代谢性疾病、皮肤病、高血压，增加心、脑血管疾病的风险，易引起心理障碍，对人们的日常生活产生困扰。目前，减肥手术是肥胖症最有效的治疗方法，但是它有很多局限性，包括手术的不可逆性、围手术期的风险，包括出血、吻合口漏、感染、内部疝、营养不足、餐后低血糖、死亡以及高昂的财务成本，因此亟需治疗肥胖症的药物筛选试剂盒来筛选更多有效的治疗肥胖的药物。
3.秀丽隐杆线虫培养条件简单，可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌(e.coli)；世代周期短，通常为3天左右；寿命短，通常为3周左右；而秀丽隐杆线虫实验群体容易放大，且可以同步化，还可避免大鼠、小鼠模型的高价、耗时的缺点，因此秀丽隐杆线虫因为寿命周期短和容易实现高通量的优势，是药物高通量筛选的理想模型。
4.由此本发明提供一种治疗肥胖症的药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够高通量筛选治疗肥胖症的药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法，供本领域研发人员高通量准确地筛选治疗肥胖症的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种治疗肥胖症的药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出治疗肥胖症的药物。
6.本发明的另一个目的是提供上述治疗肥胖症的药物筛选试剂盒的使用方法。
7.本发明提供一种治疗肥胖症的药物筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有以下试剂：
8.(1)秀丽隐杆线虫n2；
9.(2)含有10mg/ml胆固醇的ngm培养基；
10.(3)5mg/ml的大肠杆菌op50菌液；
11.(4)尼罗红染液。
12.所述的秀丽隐杆线虫n2为同步化后的线虫，线虫同步化的步骤为：
13.(1)用m9缓冲液冲洗平板上的秀丽隐杆线虫，将冲洗液吸入离心管，5000-7000rpm离心7分钟，去除上清；
14.(2)加入裂解液，在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫n2的虫体破裂释放卵；
15.(3)5000-7000rpm离心7min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵：
16.(4)m9缓冲液冲洗两次，再加入1ml m9缓冲液，置于20℃恒温培养48小时，获得同步化的秀丽隐杆线虫n2。
17.所述的m9缓冲液(以体积为400ml为例)配置方法为：称取nacl 1.99g，na2hpo
4 2.38g，kh2po
4 1.19g，无水mgso
4 0.048g。400ml蒸馏水完全溶解后，湿热灭菌(121℃，20min)，室温保存。
18.所述的裂解液的配置方法为：吸取320μl的10％naclo3溶液加入4.68ml的m9缓冲液混匀，然后与1m的naoh溶液等体积混合，现用现配。
19.所述的ngm培养基为25ml，大肠杆菌op50菌液450μl，尼罗红染液1.8μl。
20.所述的ngm培养基(以500ml为例)配置方法为：1.52g nacl，1.36g蛋白胨，1.15gk2hpo4，8.52g kh2po4，完全溶解于500ml的蒸馏水之后加入8.58g琼脂糖，摇匀，湿热灭菌(121℃，20min)。灭菌后培养基温度降至75℃时，加入500μl浓度为1m的mgso4溶液，500μl浓度为1m的cacl2溶液，500μl的5mg/ml的胆固醇溶液，摇匀后倒入玻璃培养皿中凝固备用。
21.所述的尼罗红染液由丙酮配制，终浓度为0.5mg/ml。
22.优选的，离心时转速为6000rpm。
23.本发明还提供上述治疗肥胖症的药物筛选试剂盒的使用方法：
24.(1)采用治疗肥胖症的药物筛选试剂盒筛选治疗肥胖症的药，设定模型对照组和药效评价组；
25.(2)药效评价组，无菌条件下在90mm培养皿中加入含有待测药物的ngm培养基25ml，待其凝固备用；将大肠杆菌op50菌液和尼罗红染液均匀涂布在ngm培养基上，所述大肠杆菌op50菌液和尼罗红染液的体积比为250:1，然后将400-600条同步化的秀丽隐杆线虫n2加入ngm培养基并置于20℃恒温培养48h，设定三个平行；
26.(3)模型对照组，无菌条件下在90mm培养皿中加入含有与待测药物溶液等量的无菌水或溶媒的ngm培养基25ml，待其凝固备用；将大肠杆菌op50菌液和尼罗红染液均匀涂布在ngm培养基上，所述大肠杆菌op50菌液和尼罗红染液的体积比为250:1，然后将400-600条同步化的秀丽隐杆线虫n2加入ngm培养基并置于20℃恒温培养48h，建立成为肥胖模型作为模型对照组，设定三个平行；
27.(4)秀丽隐杆线虫n2的后处理：用m9缓冲液分别将模型对照组和药效评价组中的秀丽隐杆线虫n2从培养基上洗下收集到离心管中，用m9缓冲液清洗，去除上清，重复3次，再次加入150μl m9缓冲液20℃脱色2h，脱色完成后，吸取150μlm9缓冲液清洗，去除上清，重复2次，吸取20μl线虫于载玻片上，并吸取20μl 20mm nan3固定；
28.(5)在荧光显微镜下观察染色结果并拍照记录，采用统计软件对实验数据进行处理、分析，如果药效评价组的荧光强度低于模型对照组，则证明待测药物具有治疗肥胖的活性；如果药效评价组的荧光强度与模型对照组无显著性差异，则证明待测药物不具有治疗肥胖的活性；以此评价待测药物的治疗肥胖的活性。
29.优选的，所述的大肠杆菌op50菌液和尼罗红染液分别为450μl和1.8μl。
30.优选的，加入ngm培养基的秀丽隐杆线虫n2线虫数量为500条。
31.本发明的有益效果：本发明提供的基于秀丽隐杆线虫模型的治疗肥胖症的药物筛选试剂盒使用方法简单，准确率高，筛选速度快，可广泛用于筛选治疗肥胖症的药物。
32.以下提供具体实施例以实现本发明所述的治疗肥胖症药物筛选试剂盒，但不限于这些实施例。
附图说明
33.图1使用治疗肥胖症的药物筛选试剂盒评估左旋肉碱的治疗肥胖症的功效
具体实施方式
34.实验生物：
35.秀丽隐杆线虫n2，秀丽隐杆线虫n2为野生型株系，购买于the caenorhabditis genetics center(cgc)。
36.大肠杆菌e.coli op50，尿嘧啶营养缺陷型，作为培养c.elegans的标准食物，购自cgc。
37.实施例1试剂盒的装配
38.一种治疗肥胖症药物筛选试剂盒，该试剂盒包括如下材料：
39.(1)秀丽隐杆线虫n2；
40.(2)含有10mg/ml胆固醇的ngm培养基；
41.(3)5mg/ml的大肠杆菌op50菌液；
42.(4)尼罗红染液。
43.所述大肠杆菌op50的培养方法为：将高温湿热灭菌的lb固体培养基倒入直径为90mm的玻璃培养皿中，使其冷却凝固后，用接种环蘸取少量菌液，使用平板划线法分离菌落，然后放入37℃恒温培养箱培养过夜，以得到大肠杆菌op50单菌落，4℃保存备用。
44.所述的lb固体培养基(以200ml为例)配置方法为：分别称取分析纯的nacl和蛋白胨各2.00g，酵母粉1.00g，完全溶于200ml蒸馏水中后，再加入3.42g琼脂。经湿热灭菌(121℃，20min)后备用。
45.所述的尼罗红染液由丙酮配制，终浓度为0.5mg/ml。
46.所述的秀丽隐杆线虫n2为同步化后的线虫，线虫同步化的步骤为：
47.(1)用m9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管，5000-7000rpm离心7分钟，去除上清；
48.(2)加入裂解液，在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；
49.(3)5000-7000rpm离心2min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵：
50.(4)m9缓冲液冲洗两次，再加入1ml m9缓冲液，置于20℃恒温培养48小时，获得同步化秀丽隐杆线虫n2。
51.优选的，离心时转速为6000rpm。
52.实施例2试剂盒效果验证
53.左旋肉碱是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，在治疗肥胖症中广泛应用，因此选用左旋肉碱作为待测药物对试剂盒效果进行验证。
54.1设定药效评价组
55.无菌条件下在90mm培养皿中加入含有25μl左旋肉碱药液的ngm培养基25ml，待其凝固备用；将450μl大肠杆菌op50菌液和1.8μl尼罗红染液混合，使尼罗红终浓度为0.002mg/ml,将上述混合液均匀涂布在ngm培养基上，然后将500条同步化的秀丽隐杆线虫n2加入ngm培养基并置于20℃恒温培养48h，设定三个平行；
56.2设定模型对照组
57.无菌条件下在90mm培养皿中加入含有左旋肉碱溶液等量的无菌水或溶媒的ngm培养基25ml，待其凝固备用；将450μl大肠杆菌op50菌液和1.8μl尼罗红染液混合，使尼罗红终浓度为0.002mg/ml,将上述混合液均匀涂布在ngm培养基上，然后将500条同步化的秀丽隐杆线虫n2加入ngm培养基并置于20℃恒温培养48h，设定三个平行；
58.3秀丽隐杆线虫n2的后处理
59.用m9缓冲液分别将模型对照组和药效评价组中的秀丽隐杆线虫n2从培养基上洗下,收集到离心管中，用m9缓冲液清洗，去除上清，重复3次，再次加入150μl m9缓冲液,20℃脱色2h，去除上清；再加入150μl m9缓冲液清洗，去除上清，重复2次，然后吸取20μl线虫于载玻片上，并加入20μl 20mm nan3固定，供观察染色结果；
60.4效果评估
61.在荧光显微镜下观察染色结果并拍照记录，采用统计软件对实验数据进行处理、分析，结果如图1所示，待测药物组左旋肉碱与模型对照组相比，显著降低了秀丽隐杆线虫n2株系体内的脂肪累积，显示左旋肉碱具有治疗肥胖功效，证明该试剂盒检测结果准确有效。
62.所述的左旋肉碱药液配置方法为：称取16.12mg左旋肉碱，加1ml蒸馏水，溶解成100mm的母液，避光操作，置于2～8℃保存备用。
63.所述含药培养基的制备方法为：精确吸取待测药物溶液，在无菌条件下，按照一定稀释比例加入已经灭菌且降温至75℃左右的ngm中，充分摇匀后，倒入已灭菌的玻璃培养皿中，待培养基冷却凝固后，均匀涂布450μl的大肠杆菌op50菌液，置于37℃恒温培养12h，15℃保存备用。
64.实施例3试剂盒的使用
65.(1)采用治疗肥胖症的药物筛选试剂盒筛选治疗肥胖症的药物，设定模型对照组和药效评价组；
66.(2)设定药效评价组：无菌条件下在90mm培养皿中加入待测药液的ngm培养基25ml，待其凝固备用；将450μl大肠杆菌op50菌液和1.8μl尼罗红染液混合，使尼罗红终浓度为0.002mg/ml,将上述混合液均匀涂布在ngm培养基上，然后将400-600条同步化的秀丽隐杆线虫n2加入ngm培养基并置于20℃恒温培养48h，设定三个平行；
67.(3)设定模型对照组：无菌条件下在90mm培养皿中加入含有与待测药液等量的无菌水或溶媒的ngm培养基25ml，待其凝固备用；将450μl大肠杆菌op50菌液和1.8μl尼罗红染液混合，使尼罗红终浓度为0.002mg/ml,将上述混合液均匀涂布在ngm培养基上，然后将400-600条同步化的秀丽隐杆线虫n2加入ngm培养基并置于20℃恒温培养48h，建立成为肥胖模型作为模型对照组，设定三个平行；
68.(4)秀丽隐杆线虫n2的后处理：用m9缓冲液将模型对照组和药效评价组中的秀丽隐杆线虫n2从培养基上洗下,收集到离心管中，用m9缓冲液清洗，去除上清，重复3次，再次加入150μl m9缓冲液,20℃脱色2h，去除上清；再加入150μl m9缓冲液清洗，去除上清，重复2次，然后吸取20μl线虫于载玻片上，并加入20μl 20mm nan3固定；
69.(5)在荧光显微镜下观察染色结果并拍照记录，采用统计软件对实验数据进行处理、分析，如果药效评价组的荧光强度低于模型对照组，则证明待测药物具有治疗肥胖的活性；如果药效评价组的活性氧水平与模型对照组无显著性差异，则证明待测药物不具有治
疗肥胖的活性；以此评价待测药物的治疗肥胖的活性。
70.优选的，加入ngm培养基的秀丽隐杆线虫n2线虫数量为500条。
71.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。