用于在半合成生物体中复制、转录和翻译的试剂和方法与流程

技术特征：
1.一种具有以下结构的核碱基：其中：每个x独立地是碳或氮；当x是碳时，r2是存在的且独立地是氢、烷基、烯基、炔基、甲氧基、甲硫醇、甲烷硒基、卤素、氰基或叠氮基；y是硫、氧、硒或仲胺；以及e是氧、硫或硒；其中波浪线指示与核糖基、脱氧核糖基或二脱氧核糖基部分或其类似物的键合点，其中所述核糖基、脱氧核糖基或二脱氧核糖基部分或其类似物是游离形式，连接至单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、α-硫代三磷酸酯、β-硫代三磷酸酯或γ-硫代三磷酸酯基团，或包含在rna或dna中或者rna类似物或dna类似物中。2.根据权利要求1所述的核碱基，其中x是碳。3.根据权利要求1或2所述的核碱基，其中e是硫。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核碱基，其中y是硫。5.根据权利要求1所述的核碱基，所述核碱基具有结构6.根据权利要求1至5中任一项所述的核碱基，所述核碱基与互补碱基配对核碱基结合以形成非天然碱基对(ubp)。7.根据权利要求6所述的核碱基，其中所述互补碱基配对核碱基选自：8.一种双链寡核苷酸双链体，其中第一寡核苷酸链包含根据权利要求1至5中任一项所述的核碱基，并且第二互补寡核苷酸链在其互补碱基配对位点中包含互补碱基配对核碱基。9.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸双链体，其中所述第一寡核苷酸链包含
并且所述第二链在其互补碱基配对位点中包含选自以下的互补碱基配对核碱基：10.根据权利要求9所述的双链寡核苷酸双链体，其中所述第二链包含互补碱基配对核碱基11.根据权利要求9所述的双链寡核苷酸双链体，其中所述第二链包含互补碱基配对核碱基12.一种包含编码转移rna(trna)的基因和/或编码目的蛋白质的基因的质粒，其中所述基因包含根据权利要求1至5中任一项所述的至少一种核碱基或tpt3以及根据权利要求7所述的至少一种互补碱基配对核碱基或nam其中所述互补碱基配对核碱基在互补碱基配对位点中。13.一种由根据权利要求10所述的质粒编码的mrna，所述mrna编码所述trna。14.一种由根据权利要求10所述的质粒编码的mrna，所述mrna编码所述蛋白质。15.一种包含根据权利要求1至5中任一项所述的核碱基的转移rna(trna)，所述转移rna包含：反密码子，其中所述反密码子包含所述核碱基，任选地其中所述核碱基位于所述反密
码子的第一位置、第二位置或第三位置；以及识别元件，其中所述识别元件通过氨酰trna合成酶促进所述trna选择性装载非天然氨基酸。16.根据权利要求15所述的trna，其中所述氨酰trna合成酶源自甲烷八叠球菌属或其变体，或者甲烷球菌属(methanocaldococcus)或其变体。17.根据权利要求15所述的trna，其中所述非天然氨基酸包含芳族部分。18.根据权利要求15所述的trna，其中所述非天然氨基酸是赖氨酸或苯丙氨酸衍生物。19.一种包含下式的结构：n1-zx-n2其中：每个z独立地是根据权利要求1至7中任一项所述的核碱基，其与核糖基或脱氧核糖基或其类似物键合；n1是在z的核糖基或脱氧核糖基或其类似物的5'端处附接的一个或多个核苷酸或其类似物或末端磷酸酯基团；n2是在z的核糖基或脱氧核糖基或其类似物的3'端附接的一个或多个核苷酸或其类似物或末端羟基基团；并且x是从1至20的整数。20.根据权利要求19所述的结构，其中所述结构编码基因，任选地其中zx位于所述基因的翻译区中，或者其中zx位于所述基因的非翻译区中。21.一种多核苷酸文库，其中所述文库包含至少5000种独特多核苷酸，并且其中每种多核苷酸包含根据权利要求1至5中任一项所述的至少一种核碱基。22.一种包含核碱基的核苷三磷酸，其中所述核碱基选自：23.根据权利要求22所述的核苷三磷酸，其中所述核碱基是24.根据权利要求22或23所述的核苷三磷酸，其中所述核苷包含核糖或脱氧核糖。25.一种dna，所述dna包含具有结构的核碱基和具有结构的互补碱基配对核碱基。
26.一种dna，所述dna包含具有结构的核碱基和具有结构的互补碱基配对核碱基。27.一种将dna转录到trna或编码蛋白质的mrna的方法，所述方法包括：使包含编码所述trna或蛋白质的基因的dna与核糖核苷三磷酸和rna聚合酶接触，其中所述编码trna或蛋白质的基因包含与第二非天然碱基配对并与所述第二非天然碱基形成第一非天然碱基对的第一非天然碱基，并且其中所述核糖核苷三磷酸包含能够与所述第一非天然碱基形成第二非天然碱基对的第三非天然碱基，其中所述第一非天然碱基对和所述第二非天然碱基对不相同。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述核糖核苷三磷酸还包含第四非天然碱基，其中所述第四非天然碱基能够与所述第三非天然碱基形成第二非天然碱基对。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一非天然碱基对和所述第二非天然碱基对不相同。30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，所述方法还包括在使所述dna与所述核糖核苷三磷酸和rna聚合酶接触之前，通过使所述dna与脱氧核糖核苷三磷酸和dna聚合酶接触来复制所述dna，其中所述核糖核苷三磷酸包含能够与所述第一非天然碱基形成第五非天然碱基对的第五非天然碱基，其中所述第一非天然碱基对和所述第五非天然碱基对不相同。31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基包括tpt3，所述第二非天然碱基包括cnmo或nam，所述第三非天然碱基包括tat1，并且所述第四非天然碱基包括nam或5fm。32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用半合成生物体，任选地其中所述生物体是细菌，任选地其中所述细菌是大肠杆菌。33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：36.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：37.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所
述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者是38.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：39.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基或所述第二非天然碱基是40.根据权利要求34-39中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基或所述第二非天然碱基是41.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是并且所述第二非天然碱基是或所述第一非天然碱基是并且所述第二非天然碱基是42.根据权利要求34-41中任一项所述的方法，其中所述第三非天然碱基或所述第四非
天然碱基是43.根据权利要求34-42中任一项所述的方法，其中所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基是44.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是45.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是
46.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是47.根据权利要求34-43中任一项所述的方法，其中所述第三非天然碱基是48.根据权利要求34-47中任一项所述的方法，其中所述第四非天然碱基是49.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是50.根据权利要求34-49中任一项所述的方法，其中所述dna包含选自以下的至少一种非天然碱基对(ubp)：
以及51.根据权利要求34-50中任一项所述的方法，其中所述dna包含选自以下的至少一种非天然碱基对(ubp)：
并且其中所述mrna和/或所述trna包含至少一种选自以下的非天然碱基：52.根据权利要求27-51中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基包括dcnmo，并且所述第二非天然碱基包括dtpt3。53.根据权利要求27-52中任一项所述的方法，其中所述第三非天然碱基包括nam，并且所述第二非天然碱基包括tat1。54.根据权利要求27-53中任一项所述的方法，其中转录出所述mrna，并且所述方法还包括将所述mrna翻译为蛋白质，其中所述蛋白质在对应于包含所述第三非天然碱基的mrna密码子的位置处包含非天然氨基酸。55.根据权利要求27-54中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含至少两个非天然氨基酸。56.根据权利要求27-54中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含至少三个非天然氨基酸。57.根据权利要求27-54中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含至少两个不同的非天然氨基酸。58.根据权利要求27-54中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含至少三个不同的非天然氨基酸。59.根据权利要求27-58中任一项所述的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸：是赖氨酸类似物；包含芳族侧链；包含叠氮基；包含炔基；或者包含醛基或酮基。60.根据权利要求27-59中任一项所述的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸不包含芳族侧链。61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括n6-叠氮基乙氧基-羰基-l-赖氨酸(azk)或n6-炔丙基乙氧基-羰基-l-赖氨酸(prak)。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括n6-叠氮基乙氧基-羰基-l-赖氨酸(azk)。63.根据权利要求61所述的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括n6-炔丙基乙氧基-羰基-l-赖氨酸(prak)。
64.一种由根据权利要求27-63中任一项所述的方法产生的mrna。65.一种由根据权利要求27-63中任一项所述的方法产生的trna。66.一种由根据权利要求64所述的mrna编码的蛋白质，所述蛋白质在对应于包含所述第三非天然碱基的mrna密码子的位置处包含非天然氨基酸。67.一种半合成生物体，所述半合成生物体包含扩展的遗传字母，其中所述遗传字母包含至少三种不同的非天然碱基。68.根据权利要求67所述的半合成生物体，其中所述生物体包括微生物，任选地其中所述微生物是大肠杆菌。69.根据权利要求67或68所述的半合成生物体，其中所述生物体包含含有至少一种选自以下的非天然核碱基的dna：70.根据权利要求67-69中任一项所述的半合成生物体，其中所述dna包含至少一种非天然碱基对(ubp)，其中所述非天然碱基对(ubp)是dcnmo-dtpt3、dnam-dtpt3、dcnmo-dtat1、d5fm-dtat1或dnam-dtat1。71.根据权利要求67所述的半合成生物体，其中所述dna包含至少一种为的非天然核碱基。72.根据权利要求67-71中任一项所述的半合成生物体，其中所述生物体表达异源核苷三磷酸转运蛋白。73.根据权利要求72所述的半合成生物体，其中所述异源核苷三磷酸转运蛋白是ptntt2。74.根据权利要求67-73中任一项所述的半合成生物体，其中所述生物体还表达异源trna合成酶。
75.根据权利要求74所述的半合成生物体，其中所述异源trna合成酶是巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰-trna合成酶(mb pylrs)。76.根据权利要求67-75中任一项所述的半合成生物体，其中所述生物体还表达异源rna聚合酶。77.根据权利要求76所述的半合成生物体，其中所述异源rna聚合酶是t7 rnap。78.根据权利要求67-77中任一项所述的半合成生物体，其中所述生物体不表达具有dna重组修复功能的蛋白质。79.根据权利要求78所述的半合成生物体，其中所述生物体不表达reca。80.根据权利要求67-79中任一项所述的半合成生物体，所述半合成生物体还包含异源mrna。81.根据权利要求80所述的半合成生物体，其中所述异源mrna包含至少一种选自的非天然碱基。82.根据权利要求67-81中任一项所述的半合成生物体，所述半合成生物体还包含异源trna。83.根据权利要求82所述的半合成生物体，其中所述异源trna包含至少一种选自的非天然碱基。84.一种转录dna的方法，所述方法包括：提供一种或多种dna，所述一种或多种dna包含(1)编码蛋白质的基因，其中所述编码蛋白质的基因的模板链包含第一非天然碱基以及(2)编码trna的基因，其中所述编码trna的基因的模板链包含能够与所述第一非天然碱基形成碱基对的第二非天然碱基；转录所述编码蛋白质的基因以将第三非天然碱基掺入mrna中，所述第三非天然碱基能够与所述第一非天然碱基形成第一非天然碱基对；转录所述编码trna的基因以将第四非天然碱基掺入trna中，其中所述第四非天然碱基能够与所述第二非天然碱基形成第二非天然碱基对，其中所述第一非天然碱基对和所述第二非天然碱基对不相同。85.根据权利要求84所述的方法，所述方法还包括利用所述trna从所述mrna翻译蛋白质，其中所述蛋白质在对应于在所述mrna中包含所述第三非天然碱基的密码子的位置处包含非天然氨基酸。86.一种复制dna的方法，所述方法包括：提供dna，所述dna包含(1)编码蛋白质的基因，其中所述编码蛋白质的基因的模板链包含第一非天然碱基以及(2)编码trna的基因，其中所述编码trna的基因的模板链包含能够与所述第一非天然碱基形成碱基对的第二非天然碱基；以及
复制所述dna以掺入第一替代非天然碱基以代替所述第一非天然碱基，和/或掺入第二替代非天然碱基以代替所述第二非天然碱基；其中所述方法任选地还包括：转录所述编码蛋白质的基因以将第三非天然碱基掺入mrna中，所述第三非天然碱基能够与所述第一非天然碱基和/或所述第一替代非天然碱基形成第一非天然碱基对；和/或转录所述编码trna的基因以将第四非天然碱基掺入trna中，其中所述第四非天然碱基能够与所述第二非天然碱基和/或所述第二替代非天然碱基形成第二非天然碱基对，其中所述第一非天然碱基对和所述第二非天然碱基对不相同。87.根据权利要求86所述的方法，所述方法还包括转录所述编码蛋白质的基因以将第三非天然碱基掺入mrna中，所述第三非天然碱基能够与所述第一非天然碱基和/或所述第一替代非天然碱基形成第一非天然碱基对。88.根据权利要求86或87所述的方法，所述方法还包括转录所述编码trna的基因以将第四非天然碱基掺入trna中，其中所述第四非天然碱基能够与所述第二非天然碱基和/或所述第二替代非天然碱基形成第二非天然碱基对，其中所述第一非天然碱基对和所述第二非天然碱基对不相同。89.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中其中所述方法是体内方法，包括使用作为细菌的半合成生物体。90.根据权利要求89所述的方法，其中所述生物体包括大肠杆菌。91.根据权利要求84-90中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：92.根据权利要求84-91中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：
93.根据权利要求84-92中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：94.根据权利要求84-93中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括95.根据权利要求84-94中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者是96.根据权利要求84-95中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基、所述第二非天然碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者包括：97.根据权利要求84-96中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱
基是98.根据权利要求84-97中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是99.根据权利要求84-98中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是100.根据权利要求84-99中任一项所述的方法，其中所述第一非天然碱基包括dcnmo，并且所述第二非天然碱基包括dtpt3。101.根据权利要求84-100中任一项所述的方法，其中所述第三非天然碱基包括nam，并且所述第二非天然碱基包括tat1。102.根据权利要求84-101中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含至少两个非天然氨基酸。

技术总结
本文公开了用于增加包含一种或多种非天然氨基酸的蛋白质或多肽的产生的组合物、方法、细胞、工程化微生物和试剂盒。还提供了用于增加编码所述非天然氨基酸的非天然核酸在工程化细胞或半合成生物体中的保留的组合物、细胞、工程化微生物和试剂盒。工程化微生物和试剂盒。工程化微生物和试剂盒。


技术研发人员：F
受保护的技术使用者：斯克利普斯研究所
技术研发日：2020.06.12
技术公布日：2022/3/18