1.本发明属于生物医药
技术领域：
：，具体涉及一种多肽及其改造体和在制备抗炎杀菌药物中的应用。
背景技术：
：：2.目前，临床上常见的产超广谱β-内酰胺酶类大肠杆菌，耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等耐药菌的出现使得重症感染的治疗变得束手无策，大大增加了患者病死率；抗生素耐药已然成为了人类健康亟需解决的重大医学问题。3.目前解决临床上抗生素耐药的途径主要有：(1)研发新型抗生素；(2)研发抗感染免疫调节药物。由于当前新型抗生素的研发处于瓶颈期，未能得到重大突破；因此抗感染免疫调节药物成为了研发主流。4.g蛋白偶联受体是一类具有七次跨膜螺旋的膜蛋白受体，参与了生物体内大部分的生命活动，因此每一个g蛋白偶联受体都有可能成为潜在的治疗靶点；目前上市药物中，约20％属于gpcr相关药物。g蛋白偶联受体丰富表达于生物体的各类细胞膜上，其在机体多种病理生理过程，特别是在抗感染的免疫调节中发挥重要作用。5.从g蛋白偶联受体出发开发抗感染免疫调节药物能够为临床抗感染的免疫调节治疗提供新思路。技术实现要素：6.本发明的发明目的是提供一种多肽及其改造体和在制备抗炎杀菌药物中的应用。7.为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：8.一种多肽，该多肽具有如seqidno.1所示的氨基酸序列。9.本发明从g蛋白偶联受体的全长结构中鉴定并获得了上述多肽(命名为rh-000)，其氨基酸序列为：10.ile1-glu2-arg3-his4-val5-ala6-ile7-ala8-lys9-val10-lys11-leu12-tyr13-gly14-ser15-asp16-lys17-ser18-cys19-arg20；11.研究发现，该多肽能够显著提高脓毒症小鼠的生存率，脓毒症小鼠的72h生存率达到50％以上，表明该多肽能够用于治疗细菌感染引起的疾病，为当前的抗生素耐药问题提供了新的解决途径。12.因此，本发明还提供了上述多肽在制备抗炎杀菌药物中的应用。13.本发明通过蛋白设计和分子动力学模拟分析上述多肽的作用区域，并基于作用表位对上述多肽的结构进行改造，获得了一系列多肽改造体。14.因此，本发明还提供了一种多肽改造体，该多肽改造体即是由上述的多肽改造获得的。15.上述的多肽改造体具有如下所示的氨基酸序列：16.gly1-val2-lys3-leu4-tyr5-gly6-ser7-asp8-lys9-ser10，命名为rh-001；4.6x250mm表示(色谱)柱：(型号为)inertsilod-3，(规格为)4.6x250mm；chromatogram表示色谱图；mv表示响应强度，min表示(保留时间)/分钟；detecterachannel1220nm表示探测器a的检测波长为220nm；peaktable表示出峰表，peak表示峰，ret.time表示保留时间，area表示峰面积，height表示峰高，total表示总和；下同；31.图2为本发明的多肽rh-000的质谱鉴定结果图；32.其中，massspectrum表示质谱；positveintensity表示正强度，m/z表示质荷比，下同；33.图3为本发明的多肽rh-001的mass鉴定结果图；34.图4为本发明的多肽rh-001的hplc纯化结果图；35.其中，lctimeprogram表示液相色谱梯度洗脱程序；equipment：zj20010140表示设备(型号为)：zj20010140；下同；36.图5为本发明的多肽rh-002的hplc纯化结果图；37.图6为本发明的多肽rh-002的mass鉴定结果图；38.图7为本发明的多肽rh-003的mass鉴定结果图；39.图8为本发明的多肽rh-003的hplc纯化结果图；40.图9为本发明的多肽rh-004的hplc纯化结果图；41.图10为本发明的多肽rh-004的mass鉴定结果图；42.图11为本发明的多肽rh-m-001的mass鉴定结果图；43.图12为本发明的多肽rh-m-001的hplc纯化结果图；44.图13为本发明的多肽rh-m-002的hplc纯化结果图；45.图14为本发明的多肽rh-m-002的mass鉴定结果图；46.图15为本发明的多肽rh-m-003的mass鉴定结果图；47.图16为本发明的多肽rh-m-003的hplc纯化结果图；48.图17为本发明的多肽rh-m-004的hplc纯化结果图；49.图18为本发明的多肽rh-m-004的mass鉴定结果图；50.图19为本发明的多肽改造体rh-001的cck8细胞毒性试验分析结果；51.图20为本发明的多肽改造体rh-002的cck8细胞毒性试验分析结果；52.图21为本发明的多肽改造体rh-003的cck8细胞毒性试验分析结果；53.图22为本发明的多肽改造体rh-004的cck8细胞毒性试验分析结果；54.图23为本发明的多肽改造体rh-m-001的cck8细胞毒性试验分析结果；55.图24为本发明的多肽改造体rh-m-002的cck8细胞毒性试验分析结果；56.图25为本发明的多肽改造体rh-m-003的cck8细胞毒性试验分析结果；57.图26为本发明的多肽改造体rh-m-004的cck8细胞毒性试验分析结果；58.图27为本发明的多肽rh-000及多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004处理后脓毒症小鼠的kaplan-meier生存曲线；59.图28为本发明的多肽rh-000及多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠的kaplan-meier生存曲线；60.图29为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠血液中细菌负荷量的变化；61.图30为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠肝脏中细菌负荷量的变化；62.图31为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠脾脏中细菌负荷量的变化；63.图32为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠肺脏中细菌负荷量的变化；64.图33为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠肾脏中细菌负荷量的变化。具体实施方式65.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。66.实施例167.本实施例从g蛋白偶联受体的全长结构中鉴定并获得了多肽rh-000，该多肽rh-000的氨基酸序列如seqidno.1所示：68.ile1-glu2-arg3-his4-val5-ala6-ile7-ala8-lys9-val10-lys11-leu12-tyr13-gly14-ser15-asp16-lys17-ser18-cys19-arg20；69.该多肽rh-000的合成方法包括以下步骤：70.(1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；71.(2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-arg(pbf)-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；72.(3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；73.(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；74.(5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；75.(6)缩合：保护氨基酸(fmoc-cys(tbu)-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；76.(7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；77.(8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；78.(9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；79.配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；80.切割时间：120min；81.(10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(如图1)和mass鉴定(如图2)，获得本实施例的多肽rh-000。82.实施例283.本实施例进一步对多肽rh-000的结构进行改造，获得了一系列多肽改造体，各多肽改造体的氨基酸序列如表1所示。84.表1多肽改造体及其氨基酸序列[0085][0086]由表1可见，本实施例先通过蛋白设计和分子动力学模拟分析多肽rh-000的作用区域，并基于作用表位对多肽rh-000的结构进行改造，先获得了多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004；而后进一步通过脂肪酸的羟基与n端氨基酸残基上的游离羧基发生脱水缩合反应，在多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004的n端修饰肉豆蔻酸，进一步获得了多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004。[0087]其中，多肽改造体rh-001的合成方法包括以下步骤：[0088](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0089](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-ser-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0090](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0091](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0092](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0093](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-lys(boc)-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0094](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0095](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0096](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0097]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0098]切割时间：120min；[0099](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图4)和mass鉴定(图3)，获得本实施例的多肽改造体rh-001。[0100]多肽改造体rh-002的合成方法包括以下步骤：[0101](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0102](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0103](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0104](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0105](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0106](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-leu-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0107](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0108](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0109](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0110]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0111]切割时间：120min；[0112](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图5)和mass鉴定(图6)，获得本实施例的多肽改造体rh-002。[0113]多肽改造体rh-003的合成方法包括以下步骤：[0114](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0115](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0116](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0117](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0118](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0119](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-leu-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0120](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0121](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0122](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0123]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0124]切割时间：120min；[0125](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图8)和mass鉴定(图7)，获得本实施例的多肽改造体rh-003。[0126]多肽改造体rh-004的合成方法包括以下步骤：[0127](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0128](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-val-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0129](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0130](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0131](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0132](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-lys(boc)-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0133](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0134](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0135](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0136]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0137]切割时间：120min；[0138](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图9)和mass鉴定(图10)，获得本实施例的多肽改造体rh-004。[0139]多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004的合成方法包括以下步骤：[0140](1)按上述rh-001的合成步骤组装合成肽链；[0141](2)肽链组装完毕后，加入过量的肉豆蔻酸将其缩合偶联至多肽链的n端；[0142](3)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0143]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0144]切割时间：120min；[0145](4)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图12)和mass鉴定(图11)，获得多肽改造体rh-m-001。[0146]采用与上述相同的方法获得多肽改造体rh-m-002(hplc纯化结果见图13，mass鉴定结果见图14)、rh-m-003(hplc纯化结果见图16，mass鉴定结果见图15)和rh-m-004(hplc纯化结果见图17，mass鉴定结果见图18)。[0147]专利权人继续对上述获得的多肽改造体的生物安全性和生物有效性进行测试。[0148]首先，通过cck8细胞毒性试验分析各多肽改造体的生物安全性。测试方法包括：[0149]在96孔板中接种骨髓来源巨噬细胞(bmdm)悬液，每孔100μl，按照浓度梯度，在每孔细胞悬液中分别加入0μm(对照组)，3.125μm，6.25μm，12.5μm，25μm，50μm的多肽rh-000和各多肽改造体，共孵育24小时后，采用酶标仪测定细胞活力(实验重复3次)。试验结果如图19至图26所示。[0150]由图19至图26可见，相比于对照组，随着药物浓度的增加，各多肽改造体处理组的细胞活性未见明显降低，表明本发明制备的各多肽改造体无细胞毒性，生物安全性高。[0151]而后对多肽rh-000和各多肽改造体的脓毒症治疗效果进行测试以分析其生物有效性，测试方法为：[0152]取多肽rh-000和各多肽改造体，依次设置相应的试验组，每组9只小鼠，分别腹腔注射8×106cfu的大肠杆菌，然后分别给予多肽rh-000及各多肽改造体单剂量治疗(每只老鼠10mg/kg)；同时设置对照组，对照组给予相同剂量的生理盐水；通过kaplan-meier生存曲线分析多肽rh-000和各多肽改造体在脓毒症小鼠中的治疗效果，分析结果见图27和图28。[0153]如图27所示，与对照组相比，多肽rh-000和多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004均能明显提高小鼠生存率。其中，rh-000处理组脓毒症小鼠72h的生存率为56％，而rh-001、rh-002处理组脓毒症小鼠72h的生存率分别达到了89％和67％，明显优于rh-000处理组；而多肽改造体rh-003处理组的脓毒症小鼠生存率始终保持在100％，明显优于对照组和其他处理组。[0154]如图28所示，与对照组相比，多肽rh-000和多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004均能明显提高小鼠生存率。其中，多肽改造体rh-m-001和rh-m-002以及多肽rh-000处理组对小鼠的72h生存率在50-70％之间；而多肽改造体rh-m-004处理组的小鼠生存率始终保持在100％，明显优于对照组和其他处理组。[0155]值得注意的是，在多肽n端修饰肉豆蔻酸后，rh-m-003处理组的12h生存率优于rh-003处理组，rh-m-001和rh-m-002处理组的36h生存率分别优于rh-001和rh-002处理组，尤其是rh-m-004处理组的72h生存率更是远远优于rh-004处理组，表明在多肽n端修饰肉豆蔻酸有利于改善小鼠生存率。这可能是因为肉豆蔻酸修饰后多肽改造体的渗透性和稳定性都有所提高，使得多肽改造体能够发挥其应有的功效。[0156]在兼具生物安全性和生物有效性的基础上，选取氨基酸数目以及修饰较少的多肽，可以提高多肽的合成成功率和纯度，降低生产成本，提高制备经济性。在此前提下，选取rh-001，rh-002，rh-003和rh-m-004作为后期研究药物，测试药物处理对小鼠体内细菌负载量的影响。[0157]测试方法包括：设置五个试验组和一个对照组，每组6只小鼠，分别腹腔注射8×106cfu的大肠杆菌，然后分别给予生理盐水(对照组)，rh-001，rh-002，rh-003和rh-m-004单剂量治疗(每只老鼠10mg/kg)。治疗8小时后，分别采集血液、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的标本，进行细菌定量；结果如图29、图30、图31、图32和图33所示。[0158]由图29、图30、图31、图32和图33可见，rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004均能有效降低血液和脏器的细菌负荷。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，具体涉及一种多肽及其改造体和在制备抗炎杀菌药物中的应用。
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：：2.目前，临床上常见的产超广谱β-内酰胺酶类大肠杆菌，耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等耐药菌的出现使得重症感染的治疗变得束手无策，大大增加了患者病死率；抗生素耐药已然成为了人类健康亟需解决的重大医学问题。3.目前解决临床上抗生素耐药的途径主要有：(1)研发新型抗生素；(2)研发抗感染免疫调节药物。由于当前新型抗生素的研发处于瓶颈期，未能得到重大突破；因此抗感染免疫调节药物成为了研发主流。4.g蛋白偶联受体是一类具有七次跨膜螺旋的膜蛋白受体，参与了生物体内大部分的生命活动，因此每一个g蛋白偶联受体都有可能成为潜在的治疗靶点；目前上市药物中，约20％属于gpcr相关药物。g蛋白偶联受体丰富表达于生物体的各类细胞膜上，其在机体多种病理生理过程，特别是在抗感染的免疫调节中发挥重要作用。5.从g蛋白偶联受体出发开发抗感染免疫调节药物能够为临床抗感染的免疫调节治疗提供新思路。技术实现要素：6.本发明的发明目的是提供一种多肽及其改造体和在制备抗炎杀菌药物中的应用。7.为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：8.一种多肽，该多肽具有如seqidno.1所示的氨基酸序列。9.本发明从g蛋白偶联受体的全长结构中鉴定并获得了上述多肽(命名为rh-000)，其氨基酸序列为：10.ile1-glu2-arg3-his4-val5-ala6-ile7-ala8-lys9-val10-lys11-leu12-tyr13-gly14-ser15-asp16-lys17-ser18-cys19-arg20；11.研究发现，该多肽能够显著提高脓毒症小鼠的生存率，脓毒症小鼠的72h生存率达到50％以上，表明该多肽能够用于治疗细菌感染引起的疾病，为当前的抗生素耐药问题提供了新的解决途径。12.因此，本发明还提供了上述多肽在制备抗炎杀菌药物中的应用。13.本发明通过蛋白设计和分子动力学模拟分析上述多肽的作用区域，并基于作用表位对上述多肽的结构进行改造，获得了一系列多肽改造体。14.因此，本发明还提供了一种多肽改造体，该多肽改造体即是由上述的多肽改造获得的。15.上述的多肽改造体具有如下所示的氨基酸序列：16.gly1-val2-lys3-leu4-tyr5-gly6-ser7-asp8-lys9-ser10，命名为rh-001；4.6x250mm表示(色谱)柱：(型号为)inertsilod-3，(规格为)4.6x250mm；chromatogram表示色谱图；mv表示响应强度，min表示(保留时间)/分钟；detecterachannel1220nm表示探测器a的检测波长为220nm；peaktable表示出峰表，peak表示峰，ret.time表示保留时间，area表示峰面积，height表示峰高，total表示总和；下同；31.图2为本发明的多肽rh-000的质谱鉴定结果图；32.其中，massspectrum表示质谱；positveintensity表示正强度，m/z表示质荷比，下同；33.图3为本发明的多肽rh-001的mass鉴定结果图；34.图4为本发明的多肽rh-001的hplc纯化结果图；35.其中，lctimeprogram表示液相色谱梯度洗脱程序；equipment：zj20010140表示设备(型号为)：zj20010140；下同；36.图5为本发明的多肽rh-002的hplc纯化结果图；37.图6为本发明的多肽rh-002的mass鉴定结果图；38.图7为本发明的多肽rh-003的mass鉴定结果图；39.图8为本发明的多肽rh-003的hplc纯化结果图；40.图9为本发明的多肽rh-004的hplc纯化结果图；41.图10为本发明的多肽rh-004的mass鉴定结果图；42.图11为本发明的多肽rh-m-001的mass鉴定结果图；43.图12为本发明的多肽rh-m-001的hplc纯化结果图；44.图13为本发明的多肽rh-m-002的hplc纯化结果图；45.图14为本发明的多肽rh-m-002的mass鉴定结果图；46.图15为本发明的多肽rh-m-003的mass鉴定结果图；47.图16为本发明的多肽rh-m-003的hplc纯化结果图；48.图17为本发明的多肽rh-m-004的hplc纯化结果图；49.图18为本发明的多肽rh-m-004的mass鉴定结果图；50.图19为本发明的多肽改造体rh-001的cck8细胞毒性试验分析结果；51.图20为本发明的多肽改造体rh-002的cck8细胞毒性试验分析结果；52.图21为本发明的多肽改造体rh-003的cck8细胞毒性试验分析结果；53.图22为本发明的多肽改造体rh-004的cck8细胞毒性试验分析结果；54.图23为本发明的多肽改造体rh-m-001的cck8细胞毒性试验分析结果；55.图24为本发明的多肽改造体rh-m-002的cck8细胞毒性试验分析结果；56.图25为本发明的多肽改造体rh-m-003的cck8细胞毒性试验分析结果；57.图26为本发明的多肽改造体rh-m-004的cck8细胞毒性试验分析结果；58.图27为本发明的多肽rh-000及多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004处理后脓毒症小鼠的kaplan-meier生存曲线；59.图28为本发明的多肽rh-000及多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠的kaplan-meier生存曲线；60.图29为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠血液中细菌负荷量的变化；61.图30为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠肝脏中细菌负荷量的变化；62.图31为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠脾脏中细菌负荷量的变化；63.图32为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠肺脏中细菌负荷量的变化；64.图33为多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004处理后脓毒症小鼠肾脏中细菌负荷量的变化。具体实施方式65.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。66.实施例167.本实施例从g蛋白偶联受体的全长结构中鉴定并获得了多肽rh-000，该多肽rh-000的氨基酸序列如seqidno.1所示：68.ile1-glu2-arg3-his4-val5-ala6-ile7-ala8-lys9-val10-lys11-leu12-tyr13-gly14-ser15-asp16-lys17-ser18-cys19-arg20；69.该多肽rh-000的合成方法包括以下步骤：70.(1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；71.(2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-arg(pbf)-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；72.(3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；73.(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；74.(5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；75.(6)缩合：保护氨基酸(fmoc-cys(tbu)-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；76.(7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；77.(8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；78.(9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；79.配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；80.切割时间：120min；81.(10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(如图1)和mass鉴定(如图2)，获得本实施例的多肽rh-000。82.实施例283.本实施例进一步对多肽rh-000的结构进行改造，获得了一系列多肽改造体，各多肽改造体的氨基酸序列如表1所示。84.表1多肽改造体及其氨基酸序列[0085][0086]由表1可见，本实施例先通过蛋白设计和分子动力学模拟分析多肽rh-000的作用区域，并基于作用表位对多肽rh-000的结构进行改造，先获得了多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004；而后进一步通过脂肪酸的羟基与n端氨基酸残基上的游离羧基发生脱水缩合反应，在多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004的n端修饰肉豆蔻酸，进一步获得了多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004。[0087]其中，多肽改造体rh-001的合成方法包括以下步骤：[0088](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0089](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-ser-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0090](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0091](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0092](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0093](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-lys(boc)-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0094](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0095](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0096](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0097]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0098]切割时间：120min；[0099](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图4)和mass鉴定(图3)，获得本实施例的多肽改造体rh-001。[0100]多肽改造体rh-002的合成方法包括以下步骤：[0101](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0102](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0103](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0104](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0105](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0106](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-leu-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0107](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0108](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0109](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0110]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0111]切割时间：120min；[0112](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图5)和mass鉴定(图6)，获得本实施例的多肽改造体rh-002。[0113]多肽改造体rh-003的合成方法包括以下步骤：[0114](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0115](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-tyr(tbu)-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0116](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0117](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0118](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0119](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-leu-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0120](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0121](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0122](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0123]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0124]切割时间：120min；[0125](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图8)和mass鉴定(图7)，获得本实施例的多肽改造体rh-003。[0126]多肽改造体rh-004的合成方法包括以下步骤：[0127](1)树脂溶涨：将2-chlorotritylchlorideresin树脂放入反应管中，加dmf(15ml/g)，振荡30min；[0128](2)偶联第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，取与树脂等摩尔的fmoc-val-oh氨基酸，再加入10倍摩尔过量的diea，hbtu三倍过量，最后加入dmf溶解，振荡30min；[0129](3)脱保护：去掉dmf，加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶dmf溶液(15ml/g)，15min；[0130](4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；[0131](5)洗涤：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0132](6)缩合：保护氨基酸(fmoc-lys(boc)-oh)三倍过量，hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入nmm十倍过量.反应30min；[0133](7)洗涤：dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；[0134](8)重复(2)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；[0135](9)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0136]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0137]切割时间：120min；[0138](10)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图9)和mass鉴定(图10)，获得本实施例的多肽改造体rh-004。[0139]多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004的合成方法包括以下步骤：[0140](1)按上述rh-001的合成步骤组装合成肽链；[0141](2)肽链组装完毕后，加入过量的肉豆蔻酸将其缩合偶联至多肽链的n端；[0142](3)切割多肽侧链保护基团，然后用冷乙醚沉淀多肽；[0143]配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％；[0144]切割时间：120min；[0145](4)吹干乙醚沉淀的多肽产品然后鉴定，经过hplc纯化(图12)和mass鉴定(图11)，获得多肽改造体rh-m-001。[0146]采用与上述相同的方法获得多肽改造体rh-m-002(hplc纯化结果见图13，mass鉴定结果见图14)、rh-m-003(hplc纯化结果见图16，mass鉴定结果见图15)和rh-m-004(hplc纯化结果见图17，mass鉴定结果见图18)。[0147]专利权人继续对上述获得的多肽改造体的生物安全性和生物有效性进行测试。[0148]首先，通过cck8细胞毒性试验分析各多肽改造体的生物安全性。测试方法包括：[0149]在96孔板中接种骨髓来源巨噬细胞(bmdm)悬液，每孔100μl，按照浓度梯度，在每孔细胞悬液中分别加入0μm(对照组)，3.125μm，6.25μm，12.5μm，25μm，50μm的多肽rh-000和各多肽改造体，共孵育24小时后，采用酶标仪测定细胞活力(实验重复3次)。试验结果如图19至图26所示。[0150]由图19至图26可见，相比于对照组，随着药物浓度的增加，各多肽改造体处理组的细胞活性未见明显降低，表明本发明制备的各多肽改造体无细胞毒性，生物安全性高。[0151]而后对多肽rh-000和各多肽改造体的脓毒症治疗效果进行测试以分析其生物有效性，测试方法为：[0152]取多肽rh-000和各多肽改造体，依次设置相应的试验组，每组9只小鼠，分别腹腔注射8×106cfu的大肠杆菌，然后分别给予多肽rh-000及各多肽改造体单剂量治疗(每只老鼠10mg/kg)；同时设置对照组，对照组给予相同剂量的生理盐水；通过kaplan-meier生存曲线分析多肽rh-000和各多肽改造体在脓毒症小鼠中的治疗效果，分析结果见图27和图28。[0153]如图27所示，与对照组相比，多肽rh-000和多肽改造体rh-001、rh-002、rh-003和rh-004均能明显提高小鼠生存率。其中，rh-000处理组脓毒症小鼠72h的生存率为56％，而rh-001、rh-002处理组脓毒症小鼠72h的生存率分别达到了89％和67％，明显优于rh-000处理组；而多肽改造体rh-003处理组的脓毒症小鼠生存率始终保持在100％，明显优于对照组和其他处理组。[0154]如图28所示，与对照组相比，多肽rh-000和多肽改造体rh-m-001、rh-m-002、rh-m-003和rh-m-004均能明显提高小鼠生存率。其中，多肽改造体rh-m-001和rh-m-002以及多肽rh-000处理组对小鼠的72h生存率在50-70％之间；而多肽改造体rh-m-004处理组的小鼠生存率始终保持在100％，明显优于对照组和其他处理组。[0155]值得注意的是，在多肽n端修饰肉豆蔻酸后，rh-m-003处理组的12h生存率优于rh-003处理组，rh-m-001和rh-m-002处理组的36h生存率分别优于rh-001和rh-002处理组，尤其是rh-m-004处理组的72h生存率更是远远优于rh-004处理组，表明在多肽n端修饰肉豆蔻酸有利于改善小鼠生存率。这可能是因为肉豆蔻酸修饰后多肽改造体的渗透性和稳定性都有所提高，使得多肽改造体能够发挥其应有的功效。[0156]在兼具生物安全性和生物有效性的基础上，选取氨基酸数目以及修饰较少的多肽，可以提高多肽的合成成功率和纯度，降低生产成本，提高制备经济性。在此前提下，选取rh-001，rh-002，rh-003和rh-m-004作为后期研究药物，测试药物处理对小鼠体内细菌负载量的影响。[0157]测试方法包括：设置五个试验组和一个对照组，每组6只小鼠，分别腹腔注射8×106cfu的大肠杆菌，然后分别给予生理盐水(对照组)，rh-001，rh-002，rh-003和rh-m-004单剂量治疗(每只老鼠10mg/kg)。治疗8小时后，分别采集血液、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的标本，进行细菌定量；结果如图29、图30、图31、图32和图33所示。[0158]由图29、图30、图31、图32和图33可见，rh-001、rh-002、rh-003和rh-m-004均能有效降低血液和脏器的细菌负荷。当前第1页12当前第1页12
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