基于新毒力基因改造的减毒单增李斯特菌构建方法及应用与流程

技术特征：
1.一种减毒单核细胞增多性李斯特菌，其特征在于，该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除毒力相关基因lmo0734后获得。2.一种减毒菌株，其特征在于，含有权利要求1所述的减毒单核细胞增多性李斯特菌；该减毒菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏名称为单核细胞增生李斯特氏菌，listeria monocytogenes.lads0734；保藏编号为cgmcc no：21384。3.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌作为活疫苗载体、预防性疫苗载体或治疗性疫苗载体的用途。4.权利要求1所述减毒单核细胞增多性李斯特菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建重组质粒psl1969；(2)以单増李斯特菌野生株制备感受态细胞；(3)利用步骤(1)制备的重组质粒对步骤(2)制备的感受态细胞进行电转化；(4)以单増李斯特菌野生株与重组质粒同源杂交培养、筛选验证。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：从ncbi上下载转录调控蛋白lmo0734的lmo0734基因前后共5个基因的序列；使用snapgene软件选取lmo0734基因阅读框上、下游片段作为同源臂，设计引物扩增上、下游同源臂，条带大小分别为492bp和495bp，作为片段a和片段b；以sal i和ecor i为酶切位点，经酶切、酶连至李斯特菌穿梭质粒pksv7，获得重组质粒psl1969。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物包括：引物p1，李斯特菌基因组上距离片段a上游208bp用于验证重组质粒的引物，其序列如seq id no.2所示；引物p2，扩增片段a的上游引物，其序列如seq id no.3所示；引物p3，扩增片段a的下游引物，其序列如seq id no.4所示；引物p4，扩增片段b的上游引物，其序列如seq id no.5所示；引物p6，扩增片段b的下游引物，其序列如seq id no.6所示。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：将单増李斯特菌野生株接种于新鲜无菌的bhi液体培养基中，37℃振荡培养至od
600 nm值为0.18-0.25；加入青霉素g，使其终浓度为20μg/ml，37℃振荡培养2h；离心收集菌体，加入适量洗涤缓冲液，洗涤两次；离心弃上清，向沉淀中加入洗涤缓冲液，重悬菌体以获得感受态细胞；分装，置-80℃冰箱备用。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：将步骤(1)所得重组质粒电转入步骤(2)所得单増李斯特菌感受态细胞中，加入预热的2
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bhi和1m蔗糖等体积混合的混合液，充分混匀，置30℃恒温培养箱2-3h；将转化液均匀涂布于氯霉素抗性的bhi固体培养基中，置37℃培养，得到单克隆菌落。9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：挑取步骤(3)中经电转化获得的单克隆菌落，在无菌的bhi液体培养基扩大培养，进行pcr验证；将阳性菌株置于42℃进行同源重组，以及30℃连续传代丢失质粒，最后进行pcr筛选和基因测序验证，得到重组减毒单増李斯特菌；将菌液和60％甘油按体积比1:1混合，置-80℃冰箱保存。

技术总结
本发明涉及基因工程领域，旨在提供一种基于新毒力基因改造的减毒单增李斯特菌构建方法及应用。该减毒单核细胞增多性李斯特菌是以单増李斯特菌野生株为背景，经敲除毒力相关基因Lmo0734后获得。本发明提供了含有该减毒单核细胞增多性李斯特菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的单増李斯特菌的减毒株可用于活疫苗治疗载体或免疫佐剂；将Lmo0734基因从基因簇中敲除使该细菌毒力大大降低，在达到规定安全级别的同时，仍保留了非常好的免疫原性。由于是在李斯特菌基因组上对毒力相关基因进行改造，不含抗性质粒等生物标记，符合生物安全性。符合生物安全性。符合生物安全性。


技术研发人员：宋厚辉 程昌勇 孙静 刘晨 夏菁 陈绵绵 徐加利 翟瑞东
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2021.11.15
技术公布日：2022/3/18