一种基于三维细胞电化学传感器评价农药免疫毒性的方法与流程

1.本发明涉及生物传感技术领域，具体涉及一种基于三维细胞电化学传感器评价农药免疫毒性的方法。


背景技术：

2.农药是用于控制害虫和病媒的各种化学品。农药的广泛使用有助于提高农业生产力，但由于其对动物和人类的有害影响导致了世界范围内的重大公共卫生问题。接触农药的不良反应，如致突变性、致畸性和致癌性已被广泛报道。然而，免疫毒性作为一种通常不直接导致死亡的毒性作用，很少引起公众的关注。有研究报告称，三嗪类、有机磷类和氨基甲酸酯类农药会影响免疫能力并发挥免疫毒性作用。阿特拉津(at)是三嗪类除草剂家族的一员，被认为是一种内分泌干扰物，对人类的内分泌和免疫系统构成严重威胁。对于人类和其他哺乳动物来说，at在体内通过细胞色素p450s代谢为脱乙基阿特拉津(dea)、脱异丙基阿特拉津(dia)，进一步代谢为脱乙基脱异丙基阿特拉津(dact)。已有研究表明，免疫毒性与癌症、超敏反应、自身免疫等免疫疾病密切相关。因此，迫切需要一种方便、可靠的农药及其代谢物免疫毒性评价方法，对免疫疾病的预测具有重要意义。
3.细胞生物传感技术具有灵敏度高、反应快、体积小、使用方便等特点，已广泛应用于体外研究。基于哺乳动物细胞的生物传感器具有独特的优势，能够反映与人类相关的生理、毒理学和细胞反应。小鼠巨噬细胞raw264.7是研究免疫机制的常用细胞。raw264.7细胞中一氧化氮(no)的产生是免疫反应的典型指标之一。脂多糖(lps)诱导的raw264.7细胞模型是研究炎症和免疫调节的常见体外模型。在lps刺激下，raw264.7细胞分泌no合酶并产生no，而具有免疫抑制作用的农药会破坏细胞免疫系统，削弱lps诱导的细胞免疫应答，导致no释放量减少。因此，在lps诱导模型的基础上，可以通过检测no的抑制释放来评价农药的免疫毒性。然而由于活细胞中no的半衰期短、痕量和复杂干扰的存在，检测活细胞中的no是一个挑战。
4.电化学传感技术作为一种无创、灵敏、快速的技术，是一种很有前途的原位检测活体细胞释放no的工具。构建电化学传感器的重点是电极的修饰，以提高电极的性能。近些年大量基于细胞的电化学传感器被开发，以实现有毒有害物质的检测和毒性评估。然而这些传感器大多是基于二维细胞培养，不能准确反映细胞在自然条件下生长时的反应。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于构建一种能够实现农药免疫毒性评价的、更接近体内反应、灵敏快速的三维细胞电化学传感器，并应用于at及其代谢物的免疫毒性研究。
6.本发明是通过以下方案来实现的：首先制备铁卟啉(fetcp)修饰的还原型氧化石墨烯(rgo)复合物，即fetcp@rgo，然后将其修饰到丝网印刷碳电极(spce)的工作电极上；同时，合成水凝胶前体，即甲基丙烯酸酰化明胶(gelma)；其次，小鼠巨噬细胞raw264.7被封装在gelma水凝胶中，在电极上的培养池内进行三维培养；最后，细胞经农药at或其代谢物预
处理，再用lps诱导细胞释放no，采用差分脉冲伏安法(dpv)测定no的电信号，通过计算农药处理对细胞no释放的抑制率来评价农药的免疫毒性。
7.本发明提供一种基于三维细胞电化学传感器评价农药免疫毒性的方法，步骤如下：
8.(1)fetcp@rgo的制备
9.将fetcp通过疏水相互作用和π-π堆积作用自组装到氧化石墨烯(go)上，经水合肼还原，超纯水清洗后再分散于超纯水中，得到fetcp@rgo溶液；
10.(2)甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶(gelma前体)的制备
11.用甲基丙烯酸酐与明胶反应，产物透析后经过滤后再冻干，得到gelma前体；
12.(3)三维细胞电化学传感器的构建
13.取中空结构的细胞培养池，将细胞培养池中空处对准丝网印刷碳电极(spce)的工作电极区域，并固定在其表面以进行细胞培养；然后取步骤(1)制备的fetcp@rgo溶液滴在spce的工作电极上，待溶液完全干燥后，再滴加全氟磺酸(nafion)溶液，室温干燥；随后，将步骤(2)制备的gelma前体溶于pbs缓冲液后加入光引发剂，经温浴得到澄清的溶液，即光敏型gelma溶液；用滤膜过滤光敏型gelma溶液进行除菌，过滤后的液体与细胞混合后，得到细胞-gelma溶液；
14.取一定体积细胞-gelma溶液加到电极上的细胞培养池中，并用紫外光光固化；最后，在培养池中加入一定体积的细胞培养基，即可得到三维细胞培养电极，将电极与电化学工作站相连，即得到三维细胞电化学传感器；
15.(4)lps诱导的raw267.4细胞模型的建立
16.为研究步骤(3)所制备三维细胞电化学传感器在lps刺激下的no检测能力，取步骤(3)制备的三维细胞培养电极若干个，向各个培养池中分别加入用dmem培养基配成的不同浓度lps溶液，一种浓度的lps溶液对应一个三维细胞培养电极，两者是一一对应关系；孵育一段时间后用dpv法检测细胞所释放的no电流信号，得到no氧化的峰电流值，然后以lps浓度的对数和峰电流值建立检测lps的标准曲线，计算出的检测限反映该传感器对细胞释放的no的检测能力；
17.(5)农药免疫毒性的检测
18.基于步骤(4)构建的lps标准曲线，选取一定的lps浓度和孵育时间，进一步研究阿特拉津(at)及其代谢物脱乙基阿特拉津(dea)、脱异丙基阿特拉津(dia)、脱乙基脱异丙基阿特拉津(dact)的免疫调节作用；
19.在细胞培养池中加入用dmem培养基配成的不同浓度的at或其代谢物dea、dia、dact孵育一段时间，然后再加入一定浓度lps溶液孵育一段时间，采用dpv法检测细胞释放no的峰电流值，记为i
农药
；
20.在细胞培养池中加入一定浓度lps溶液孵育一段时间，采用dpv法检测细胞释放no的峰电流值，记为i
lps
；
21.在细胞培养池中只加入dmem培养基，孵育与i
农药
组相同的时间，采用dpv法检测细胞释放no的峰电流值，记为i
对照
；
22.如下计算抑制率：
23.抑制率(％)＝100[(i
lps
–i农药
)/(i
lps
–i对照
)]
ꢀꢀ
(1)
[0024]
其中，i
lps
是一定浓度lps处理后的细胞释放的no峰电流值，i
农药
是农药预处理后再经lps溶液处理的细胞释放的no峰电流值，i
对照
是不经任何处理的细胞释放的no峰电流值。
[0025]
通过抑制率的计算，实现定量测定细胞受到农药的免疫抑制程度，即可反应农药的免疫毒性；抑制率越大，农药免疫毒性越大；
[0026]
以农药浓度的对数和抑制率绘制毒性曲线，将30％最大抑制率对应的农药浓度定义为ic
30
，通过比较农药之间的ic
30
实现农药免疫毒性大小的比较；农药所对应的ic
30
值越小，raw264.7细胞对该农药的免疫毒性敏感性越高。
[0027]
进一步地，步骤(1)所述fetcp@rgo具体制备过程如下：将氧化石墨烯加到超纯水中，其中氧化石墨烯与超纯水的用量比为4mg：16.5ml；然后在室温下超声溶解20～30min，得到go悬浮液中；随后，将fetcp分散于dmf与水的混合液中，得到混合溶液a；所述混合液中dmf与水的体积比为4:1，所述fetcp与混合液的用量比为17.6mg：3.5ml；将混合溶液a滴加到go悬浮液中，其中混合溶液a与go悬浮液的体积比为1:1-3；超声30～35分钟，然后在70-80℃下搅拌过夜，得到红褐色溶液(在此过程中，fetcp通过疏水相互作用和很强的π-π堆积作用自组装到氧化石墨烯上)；再将体积浓度85％联氨溶液和25wt％氨水加入上述红褐色溶液中，所述联氨溶液、氨水与红褐色溶液中fetcp的用量关系为3.2μl：64μl：17.6mg，在95℃剧烈搅拌下保存1h；得到混合溶液b，在10000g离心20-30min，离心的产物用超纯水洗涤3-5次；最后将产物用超声波分散超纯水中，得到fetcp@rgo溶液；所述fetcp@rgo与超纯水的比例为10-20mg：4ml。
[0028]
进一步地，步骤(2)所述gelma水凝胶具体制备过程如下：明胶溶解在杜氏磷酸缓冲溶液(dpbs)中，在50-60℃搅拌后再滴加甲基丙烯酸酐，搅拌2h，得到混合溶液a；其中明胶、dpbs和甲基丙烯酸酐的用量关系为5g：50ml：4ml；混合溶液a中加入其五倍体积的dpbs稀释以终止甲基丙烯酸酯化反应，然后在50-60℃下透析6-7天，截留分子量：12-14kda，以去除低分子量杂质；最后，透析液用0.22μm膜过滤器过滤溶液，过滤后的溶液在-80℃或-20℃预冻，然后经5-14天冻干得到的产物即为gelma前体。
[0029]
进一步地，步骤(3)中，所述培养池由聚二甲基硅氧烷制成，形状是与spce等宽的中空立方体，中空处与spce的工作区域吻合。
[0030]
进一步地，步骤(3)中，spce由碳工作电极、碳对电极和银伪参比电极组成，其工作区域包含上述的三电极。
[0031]
进一步地，步骤(3)中，所述fetcp@rgo溶液滴加的体积为5-20μl；所述nafion溶液的浓度为0.5wt％，滴加体积为5-10μl。
[0032]
进一步地，步骤(3)中，所述pbs缓冲液为0.01m，ph为7.0；所述光敏型gelma溶液中gelma前体浓度为5-15wt％；所用光引发剂为irgacure 2959，浓度为0.5-1wt％；所述经温浴得到澄清的溶液，温浴的温度为40-45℃。
[0033]
进一步地，步骤(3)中，所述细胞-gelma溶液中细胞密度为10
3-107个/ml；所用细胞为小鼠巨噬细胞raw264.7细胞；所述培养池中所加入的细胞-gelma溶液与细胞培养基的体积比为1:1；所述细胞培养基为含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的dmem培养基。
[0034]
进一步地，步骤(3)中，所述固化条件为紫外光(365nm,50mw/cm2)下光固化30-60s。
[0035]
进一步地，步骤(4)中，所述脂多糖(lps)溶液的浓度范围为0.01-2000ng/ml；所述
孵育的温度和气体环境分别为37℃、5％co2，孵育时间为3-9h。
[0036]
进一步地，步骤(4)中，所述dpv法的信号测定条件如下：扫描范围：-0.6至1.0v，脉冲周期：0.5s，脉冲幅度：0.05v。
[0037]
进一步地，步骤(5)中，所述at或其代谢物dea、dia、dact的浓度均为0.001-100μg/ml；所述孵育的温度和气体环境分别为37℃、5％co2，孵育时间均为3-24h。
[0038]
进一步地，步骤(5)中，所述lps溶液的浓度为1μg/ml，孵育温度和气体环境分别为37℃、5％co2，孵育时间为3-9h。
[0039]
本发明制备的三维细胞电化学传感器相比其他用于毒性检测的细胞传感器有如下优势：
[0040]
(1)免疫毒性作为一种通常不直接导致死亡的毒性作用，很少引起公众的关注。但已有多项研究表明，免疫毒性与癌症、超敏反应、自身免疫等免疫疾病密切相关。本发明构建的三维细胞电化学传感器对脂多糖的响应快速、灵敏，设备便捷、检测成本低。基于脂多糖诱导的raw264.7细胞模型，结合农药刺激后的抑制率计算，成功应用于农药及其代谢物的免疫毒性分析，并在分析其他毒物的免疫毒性方面具有良好的应用前景。
[0041]
(2)本发明采用具有优异生物相容性、渗透性和机械稳定性的gelma水凝胶封装细胞，实现了在电极上的细胞三维培养，更好地模拟了体内微环境、细胞间相互作用和药物渗透作用。
[0042]
(3)本发明将三维细胞培养技术与电化学传感技术结合，采用修饰了fetcp@rgo的一次性spce，采用电化学方法测定细胞释放的no电流值作为检测信号，不仅提高了检测灵敏度而且加快了检测速度。
附图说明
[0043]
图1为三维细胞电化学传感器的构建及其用于评价农药免疫毒性的流程图。
[0044]
图2为fetcp@rgo复合物的表征图：
[0045]
其中a图是go，rgo，fetcp和fetcp@rgo的紫外吸收光谱，插图是go(ⅰ)，rgo(ⅱ)和fetcp@rgo(ⅲ)水溶液照片；
[0046]
b图是go和fetcp@rgo的xps能谱图，插图为两者fe2p元素的xps窄谱图；
[0047]
c和d图分别是go和fetcp@rgo的c1s谱去卷积；
[0048]
e和f图分别是rgo和fetcp@rgo在云母片上的afm图像；
[0049]
g图是裸spce，rgo、fetcp@rgo和nafion/fetcp@rgo修饰的spce在0.1m pbs中的cv曲线，扫描速率为50mv/s；
[0050]
h图是裸spce和rgo、fetcp@rgo和nafion/fetcp@rgo修饰的spce在含有100μm no
2-的0.1m pbs(ph＝2.5)中的cv曲线，扫描速率为50mv/s。
[0051]
图3为5wt％gelma水凝胶的sem扫描电镜图。
[0052]
图4为5wt％gelma水凝胶中细胞活/死染色的荧光三维重建图。
[0053]
图5为所设计电化学细胞传感器用于检测不同浓度的lps；a图是不同浓度lps(0、0.01、0.1、1、10、50、100、1000、2000ng/ml)处理raw264.7细胞后所测得的dpv曲线；
[0054]
b图是不同浓度lps对应传感器的dpv峰值电流，b中插图：峰值电流与lps浓度对数的线性校准图。
[0055]
图6中的a-d图：未处理raw264.7细胞(a，a1-a4)和100μg/ml at或其代谢物单独处理的细胞(b，b1-b4)的dpv曲线；(c-j)分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100μg/ml at或其代谢物处理3h，再经1μg/ml lps刺激后，raw264.7细胞的dpv曲线；(e)为不存在或存在1μg/ml lps的情况下，不同浓度的at或其代谢物对应的no峰值电流。
[0056]
图7为利用该传感器得到的(a)at、(b)dea、(c)dia和(e)dact对raw264.7细胞的免疫毒性曲线。
具体实施方式
[0057]
为了更清楚地说明本发明的内容，下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，显而易见地，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应被解释为本发明的全部实施例。
[0058]
实施例1
[0059]
(1)fetcp@rgo的制备；
[0060]
将4mg氧化石墨烯加到16.5ml超纯水中，在室温下超声溶解20min。随后，将17.6mg fetcp分散于3.5ml dmf/水混合液(4:1，v/v)中，得到混合溶液a；滴加到go悬浮液中。将得到的混合物进一步超声30分钟，然后在70℃下搅拌过夜，得到红褐色溶液。在此过程中，fetcp通过疏水相互作用和很强的π-π堆积作用自组装到氧化石墨烯上。再将3.2μl联氨溶液(体积浓度85％)和64μl氨水(25wt％)加入上述溶液中，在95℃剧烈搅拌下保存1h。得到的fetcp@rgo在10000g离心20min，用超纯水洗涤3次。最后取15mg所得fetcp@rgo用超声波分散于4ml超纯水中得到fetcp@rgo溶液。
[0061]
图2是fetcp@rgo复合物的表征图。如图2中a图所示，氧化石墨烯在229nm处有典型的紫外-可见吸收峰，经水合肼还原形成还原氧化石墨烯后，吸收峰移至266nm。fetcp在405nm处有一个明显的峰，其归属于卟啉的soret带。fetcp在石墨烯薄片表面吸附后，所制得的fetcp@rgo在266nm和437nm处出现两个吸附峰，其中437nm对应fetcp的soret带，红移32nm。另外，未修饰的rgo发生严重团聚，而在rgo上引入fetcp后显著提高了rgo在水中的分散性和稳定性(图2a中插图)。通过xps验证了fetcp和石墨烯薄片的成功组装(图2中b-d图)。与go相比，fetcp@rgo不仅有c1和o1s峰，而且有明显的n1s峰，n1s峰属于fetcp(图2中b图)。同时，在xps窄谱中，fetcp/rgo出现了明显的fe2p特征峰，这在go中是不存在的(图2中b图的插图)。从图2中c-d图的c1s谱图可以看出，经水合肼还原后，属于氧化碳类(c-o,c＝o,o-c＝o)的峰被大大削弱。此外，fetcp@rgo在286.2ev处出现了一个新峰，该峰与c-n键有关。用原子力显微镜(afm)对氧化石墨烯和fetcp@rgo的厚度进行了评价。在图2e中，rgo的平均厚度约为1.0nm。而在fetcp@rgo中增加了0.8nm(图2中f图)，这是由于fetcp在rgo薄片上的吸附。
[0062]
在0.1m pbs中进行电化学循环伏安检测，以验证fetcp在rgo表面的附着情况(图2中g图)。在fetcp@rgo改性的spce上出现了一对可逆的氧化还原峰，而裸spce和rgo改性的spce没有出现可逆的氧化还原峰。氧化还原峰属于fe(ⅱ)tcp/fe(ⅲ)tcp内核铁的特征电子转移反应。此外，nafion修饰后的电极峰值电流略有下降，说明nafion降低了传感器的灵敏度。图2h显示了裸spce和修饰后的spce在含有100μm no
2-的0.1m pbs(ph 2.5)中no氧化的cv响应。裸spce在 0.8v时出现no氧化峰。rgo/spce显示出明显的no氧化峰，峰值电流为
32.48μa，而fetcp@rgo/spce显示出更高的峰值电流(44.54μa)，说明fetcp和rgo对no氧化表现出协同催化作用。随后对nafion进行修饰以增强传感器的no选择性，nafion/fetcp@rgo修饰的spce使no的氧化峰电位向较高的正电位方向移动( 0.827v)，峰值电流略有下降。结果表明，nafion对no的氧化有轻微的抑制作用。综上，这些结果有力地证实了go的还原和fetcp的组装形成了fetcp@rgo。
[0063]
(2)gelma前体的制备
[0064]
5g明胶溶解在50ml dpbs中，在60℃轻轻搅拌。将4ml甲基丙烯酸酐滴加到上述溶液中，50℃搅拌2h，用五倍的dpbs(维持温度在50℃条件下)稀释以终止甲基丙烯酸酯化反应，然后在50℃下透析一周，以去除低分子量杂质(截留分子量：12-14kda)；最后，用0.22μm膜过滤器过滤溶液，在-80℃预冻，然后冻干5天得到gelma前体。
[0065]
gelma前体溶解在含有光引发剂irgacure 2959的pbs(0.01m，ph 7.0)中，紫外光(365nm,50mw/cm2)下光固化30s，形成gelma水凝胶，其中gelma前体的浓度为5wt％，引发剂浓度为0.5wt％，冷冻干燥后通过扫描电镜研究了其形貌。如图3所示，gelma水凝胶交联后呈孔隙相互连通的多孔结构，孔隙均匀、规则。gelma中形成的孔洞为no向电极表面转移提供了通道，促进了无机盐和大分子的转移。
[0066]
(3)三维细胞电化学传感器的构建
[0067]
spce由直径为5mm的碳工作电极、碳对电极和银伪参比电极组成，大小为30
×
12mm。自制的细胞培养池形状是与spce等宽的中空立方体(12
×
12
×
12mm)，中空处正好与spce的工作区域吻合。
[0068]
将细胞培养池中空处对准spce的工作区域固定在其表面以进行细胞培养。10μl fetcp@rgo溶液滴在spce的工作电极上。待溶液完全干燥后，将5μl 0.5wt％的nafion溶液滴于fetcp@rgo/spce上，室温下干燥。随后，将5wt％gelma前体溶解在含有0.5wt％光引发剂irgacure 2959的pbs(0.01m，ph 7.0)中，45℃下温浴得到澄清的溶液。用0.22μm膜过滤器过滤液体。将raw264.7细胞加到过滤液体中得到细胞-gelma溶液，其中细胞密度为106个/ml。将100μl的细胞-gelma溶液加到工作电极区域的细胞培养池中，并在紫外光(365nm,50mw/cm2)下光固化30s，形成细胞-gelma水凝胶。最后，在培养池中加入100μl的含有体积浓度10％胎牛血清的dmem培养基。由上所述即可得到三维细胞培养电极，将电极与chi660e电化学工作站相连，即得到三维细胞电化学传感器。
[0069]
图4是gelma凝胶中细胞活/死染色的荧光三维重建图；raw264.7细胞均匀分布在gelma水凝胶的每一层，形成三维细胞培养模型；细胞呈现出良好的活性，表明gelma水凝胶具有良好的生物相容性。
[0070]
(4)lps诱导的raw267.4细胞模型的建立
[0071]
为研究步骤(3)所制备传感器在lps刺激下的no检测能力，取步骤(3)制备的三维细胞培养电极若干个，向各个培养池中分别加入用dmem培养基配成的0.01，0.1，1，10，50，100，1000或2000ng/ml lps溶液，加入的lps溶液浓度与三维细胞培养spce为一一对应关系；37℃、5％co2条件下孵育6h后用dpv法检测细胞所释放的no电流信号；dpv法的信号测定条件如下：扫描范围：-0.6至1.0v，脉冲周期：0.5s，脉冲幅度：0.05v。以lps浓度的对数和电流峰值建立检测lps的标准曲线。
[0072]
图5是所设计电化学细胞传感器检测lps获得的标准曲线。图5a描述了三维细胞传
感器在不同剂量lps刺激后的dpv反应。可以观察到no在 0.768v电位下被氧化，电流峰值随着lps浓度的增加而增加，lps浓度超过1μg/ml时细胞no释放量增加不明显。如图5b所示，电流峰值与lps浓度的对数在0.01-2000ng/ml范围内呈线性关系，r2＝0.996。信噪比为3时，检测限为0.0048ng/ml，表明所制备传感器可以检测到相当低水平lps刺激下细胞所释放的no。
[0073]
(5)农药免疫毒性的检测
[0074]
基于步骤(4)构建的lps诱导模型得到的结论，选取lps浓度为1μg/ml，孵育时间为6h，进一步研究at及其代谢物dea、dia和dact的免疫调节作用。
[0075]
在细胞培养池中加入用dmem培养基配成的0.0001，0.001，0.01，0.1，1，10，50或100μg/ml的at或其代谢物dea、dia、dact孵育3h，然后再加入1μg/ml lps孵育6h，孵育温度和气体环境分别为37℃、5％co2。采用dpv法检测细胞释放no的峰电流值，记为i
农药
；
[0076]
在细胞培养池中加入一定浓度lps孵育6h，采用dpv法检测细胞释放no的峰电流值，记为i
lps
；
[0077]
在细胞培养池中只加入dmem培养基，孵育9h，采用dpv法检测细胞释放no的峰电流值，记为i
对照
；
[0078]
为定量测定农药免疫抑制程度，如下计算抑制率：
[0079]
抑制率(％)＝100[(i
lps
–i农药
)/(i
lps
–i对照
)](1)
[0080]
其中，i
lps
是1μg/ml lps处理后的细胞释放的no峰电流值，i
农药
是农药预处理后再经1μg/ml lps处理的细胞释放的no峰电流值，i
对照
是不经任何处理的细胞释放的no峰电流值。
[0081]
图6中(a-d)是未处理raw264.7细胞(a，a1-a4)和100μg/ml at或其代谢物单独处理的细胞(b，b1-b4)的dpv曲线；(c-j)分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100μg/ml at或其代谢物处理3h，再经1μg/ml lps刺激后，raw264.7细胞的dpv曲线。未经处理的细胞或农药单独处理的细胞不能产生显著水平的no(曲线a-b，a包括a1-a4，b包括b1-b4)，而lps刺激大大增加了no水平(曲线c，包括c1-c4)。(e)为不存在或存在1μg/ml lps的情况下，不同浓度的at或其代谢物对应的no峰值电流。lps诱导的no峰值电流随着农药浓度的增加而降低，这与农药的免疫毒性有关。以上结果显示，阿特拉津及其代谢产物对raw264.7细胞都具有明显的免疫毒性，进一步说明在农药毒性研究方面应重视农药代谢产物的毒性研究。
[0082]
进一步地，通过公式(1)计算抑制率，抑制率越大，农药的免疫毒性越大。以农药浓度的对数和抑制率绘制免疫毒性曲线，将30％最大抑制率对应的农药浓度定义为ic
30
，通过比较农药之间的ic
30
实现农药间免疫毒性大小的比较。
[0083]
图7是(a)at，(b)dea，(c)dia和(d)dact对raw264.7细胞的免疫毒性曲线。随着农药浓度的增大，抑制率增加，说明农药的免疫毒性随农药浓度增大而增大。at、dea、dia和dact的ic
30
分别为25.71
±
1.08、48.63
±
2.17、52.36
±
2.34和49.11
±
1.98μg/ml。at的ic
30
小于其主要代谢产物的ic
30
，表明at的免疫毒性大于其主要代谢产物(dea、dia和dact)的免疫毒性。综上，所开发的3d细胞电化学传感器可用于定量计算农药的免疫毒性大小，实现农药间的免疫毒性大小的比较。
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说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技
术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。