皮肤源性多能性前体细胞的制作方法与流程

1.本发明涉及一种皮肤源性多能性前体细胞的制作方法。


背景技术：

2.近年来，使用人工培养的细胞或组织的再生医学已经引起了人们的关注。例如，通过再生毛囊来治疗脱发，对改善人们在外观(社会方面)和健康方面的生活质量(qol)非常重要。
3.作为用于人工培养细胞或组织的细胞源的1种，有皮肤源性多能性前体细胞(skin-derived precursor cells：以下，本说明书中也称为“skps”)。skps是存在于毛乳头中的细胞，能够分化为神经细胞、神经胶质细胞(胶质细胞)、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、真皮成纤维细胞、毛乳头细胞等。另外，skps在维持真皮环境、组织修复和毛囊形成方面等发挥着重要功能(参照非专利文献1及2)。
4.目前，在再生医学领域中正在进行各种临床和非临床研究。对于这些研究，有必要开发一种有效的方法来大量获得skps。作为迄今为止所报道的skps的获得方法，报道有从人或人以外的动物组织中作为浮游细胞块采集和培养的方法(例如参照非专利文献1)、利用人或人以外的动物组织培养的黏附细胞而制作的方法(例如参照非专利文献3)。专利文献1中公开了一种skps的制作方法，其包括将来自人源性多能性干细胞的神经嵴干细胞在含有wnt信号的激动剂的分化诱导培养基中进行培养并分化为skps的步骤。
5.es细胞或ips细胞等多能性细胞的培养通常在饲养层细胞的共存下进行。另一方面，用于人的再生医学的人工培养细胞优选在不使用饲养层细胞的无饲养层且不含有异种源性成分(无异源物)的条件下培养。已经开发了使用细胞粘附分子取代饲养层细胞，在无饲养层条件下培养多能性细胞的方法。专利文献2中公开了一种人多能性干细胞的培养方法，其使用涂覆了层粘连蛋白511的e8片段或层粘连蛋白332的e8片段的培养基材。专利文献3中公开了一种哺乳动物细胞的培养方法，其包括在改性层粘连蛋白的存在下培养es细胞或ips细胞等干细胞的步骤，该改性层粘连蛋白由结合了含有硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等的增殖因子结合部位的片段的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段构成。专利文献4中公开了一种多能性干细胞的培养方法，其包括使层粘连蛋白421、层粘连蛋白121或它们的片段与多能性干细胞接触的步骤。专利文献5中公开了一种多能性干细胞的分化诱导方法，其包括使连结有层粘连蛋白e8片段和含有硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的增殖因子结合部位的片段的结合物与人多能性干细胞接触的步骤。
6.专利文献1：日本特开2015-213495号公报
7.专利文献2：日本特开2011-078370号公报
8.专利文献3：国际公开公报第2012/137970号
9.专利文献4：国际公开公报第2018/038242号
10.专利文献5：国际公开公报第2018/088501号
11.非专利文献1：nature cell biology,2001,3:778-784
12.非专利文献2：cell stem cell,2009,5:610-623
13.非专利文献3：plos one,2012,7(11):e50742


技术实现要素：

14.在一个方式中，本发明提供一种皮肤源性多能性前体细胞的制作方法，其包括在选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种存在下培养神经嵴干细胞，使其分化为皮肤源性多能性前体细胞的步骤，该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
15.在其它方式中，本发明提供一种用于由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞分化诱导培养的定着材料，其以选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种为有效成分，其中，该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
16.在另一方式中，本发明提供一种神经嵴干细胞的制作方法，其包括在选自结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种的存在下，培养多能性干细胞，使其分化为神经嵴干细胞的步骤，该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
17.进而，在其它方式中，本发明提供一种用于由多能性干细胞向神经嵴干细胞分化诱导培养的定着材料，其以选自结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种为有效成分，其中，该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
附图说明
18.图1表示在层粘连蛋白片段的存在下从ncs细胞向skps的分化诱导。ips-ncs：分化诱导临开始之前的细胞；ips-skps p0：分化诱导4天后的细胞；ips-skps p1：传代培养后的细胞(倍数全部为40倍)。最下段表示ips-skps p1中的巢蛋白和纤维粘连蛋白的荧光染色像(倍数：50倍)。
19.图2表示在层粘连蛋白片段的存在下从ips细胞向skps的分化诱导。照片表示传代培养后的skps(倍数全部为40倍)。上：在非修饰层粘连蛋白片段的存在下的培养；下：在基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段的存在下的培养。
20.图3表示在基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段的存在下分化了的skps中的标记基因的表达。ips-skps p0：分化诱导后的细胞；ips-skps p1：传代培养后的细胞。
21.图4表示在基底膜蛋白聚糖修饰的层粘连蛋白片段的存在下分化了的skps中的标记蛋白的表达。经免疫组织染色的细胞的荧光显微镜照片。a：巢蛋白的表达；b：纤维粘连蛋白的表达；c：αsma的表达。
22.图5表示在基底膜蛋白聚糖修饰的层粘连蛋白片段的存在下分化了的skps向组织细胞的分化。染色细胞的显微镜照片。a：脂肪细胞；b：骨细胞；c：雪旺细胞。
23.图6表示在无异源物条件下，在层粘连蛋白片段的存在下从ips细胞向skps的分化
诱导。ips-ncs(上)：分化诱导临开始之前的细胞；ips-skps p0(中)：分化诱导4天后的细胞；ips-skps p1(下)：传代培养后的细胞(倍数全部为40倍)。
24.图7表示在层粘连蛋白片段存在下分化了的ncs细胞中的标记基因的表达。
25.图8表示在层粘连蛋白片段存在下进行了分化诱导的skps数。lm：非修饰层粘连蛋白片段；p-lm：基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段。各条下的标签表示层粘连蛋白种类。误差条＝sd、＊：p《0.0005、＊＊：p《0.0001(t检验)。
具体实施方式
26.本说明书中所引用的全部的专利文献、非专利文献以及其他的发行物，其全体在本说明书中作为参考被引用。
27.本说明书中“多能性干细胞”是指具有能够分化为构成成体的各种组织的多能性和自我复制能力的未分化细胞。本发明中所使用的多能性干细胞可以适当选择，作为多能性干细胞的具体例，可举出：胚胎干细胞(以下也称为“es细胞”)、胚胎肿瘤细胞(以下也称为“ec细胞”)、胚胎生殖干细胞(以下也称为“eg细胞”)、人工多能性干细胞(ips细胞)等。这些细胞可以利用常规方法来制备，也可以使用市售的细胞。本发明中所使用的多能性干细胞优选为es细胞或ips细胞，更优选为ips细胞。另外，本发明中所使用的多能性干细胞只要是源自哺乳动物的多能性干细胞即可，优选为源自人、小鼠、大鼠、牛、猪以及非人灵长类的多能性干细胞，更优选为人源性多能性干细胞。其中，优选人源性es细胞或ips细胞，更优选人源性ips细胞。
28.本说明书中“皮肤源性多能性前体细胞(skin-derived precursor cells；skps)”是指：具有自我复制能力的未分化细胞，该细胞具有分化为神经细胞、神经胶质细胞(例如，小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、雪旺细胞、卫星细胞等)、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、真皮成纤维细胞、毛乳头细胞等的能力。skps可以基于巢蛋白、纤维粘连蛋白、αsma等标记蛋白的表达而进行鉴定，优选可以基于巢蛋白和纤维粘连蛋白的共表达而进行鉴定。或者，skps可以基于nestin基因、snail基因、slug基因、sox9基因、dermo-1基因、bmp-4基因、wnt-5a基因等标记基因的表达而进行鉴定。
29.本说明书中的“神经嵴干细胞”(neural crest stem cell；以下也称为“ncs细胞”)是指：具有自我复制能力和多分化能力的多能性的干细胞，该细胞在脊椎动物发育过程中从神经管的背侧迁移到体内，有助于各种组织的形成。神经嵴干细胞可以基于paired box 6(pax6)、nerve growth factor receptor(p75)等公知的标记的表达而进行鉴定。
30.细胞中的标记蛋白或标记基因的表达可以按照常规方法检测。例如，细胞中的标记蛋白的表达可以通过使用针对该标记蛋白的抗体的免疫组织染色、蛋白质印迹、elisa等进行检测。另外，例如细胞中的标记基因的表达可以通过pcr、微阵列、测序等进行检测。
31.本说明书中，“wnt信号”是指由wnt蛋白与其受体结合而引发的β-连环蛋白通路、pcp通路和ca
2
通路这3条通路活化的一系列的通路。wnt信号的活化控制细胞的增殖或分化、器官形成或初期发生时的细胞运动等各种细胞功能。优选本说明书中的“wnt信号”是指β-连环蛋白通路(canonical cascade)。在该通路中，通过wnt蛋白与受体的结合而使β-连环蛋白稳定化，迁移至核内而作为转录因子发挥作用，从而使基因转录活化。另外，据认为β-连环蛋白也参与细胞粘接。另一方面，在该β-连环蛋白通路关闭的情况下，β-连环蛋白形
成由多种蛋白构成的分解复合体，在由该复合体中的丝氨酸/苏氨酸激酶即glycogen synthase 3(gsk-3)或casein kinase 1α(ck1α)导致的磷酸化之后被分解，由此使细胞内的β-连环蛋白维持在低水平。
32.本说明书中，“wnt信号激动剂”是指活化上述的wnt信号的因子，优选活化上述的β-连环蛋白通路(canonical cascade)的因子。作为活化β-连环蛋白通路的因子的实例，可举出通过抑制gsk-3等β-连环蛋白的磷酸化酶而促进β-连环蛋白的核内迁移、由此活化基因转录因子。因此，作为β-连环蛋白的磷酸化酶抑制剂的gsk-3抑制剂可以作为活化β-连环蛋白通路的因子的实例而举出。
33.层粘连蛋白为主要的细胞外基质之一，为参与细胞的粘接、转移、增殖等的蛋白质。层粘连蛋白为具有3个不同亚基(α链、β链、γ链)的异源三聚体分子。迄今为止，发现5种α链(α1、α2、α3、α4、α5)、3种β链(β1、β2、β3)及3种γ链(γ1、γ2、γ3)，根据它们的组合的不同，在层粘连蛋白中存在许多异构体。层粘连蛋白家族的成员按照亚基的种类而命名。例如，由α5链、β1链、γ1链构成的层粘连蛋白被称为层粘连蛋白511。
34.本说明书中，“层粘连蛋白的e8片段”(以下，也简称为“层粘连蛋白e8”)是指由从层粘连蛋白α链的c末端片段中除去了球状结构域4及5的片段(以下称为“α链e8”)、β链的c末端片段(以下称为“β链e8”)及γ链的c末端片段(以下称为“γ链e8”)的三聚体构成的片段。该三聚体的分子量为约150～约170kda。α链e8通常由约770个氨基酸构成，n末端侧的约230个氨基酸与三聚体形成有关。β链e8通常由约220～约230个氨基酸构成。γ链e8通常由约240～约250个氨基酸构成，从c末端部至第3位的谷氨酸残基对于层粘连蛋白e8的整合素结合活性是必须的(参照the journal of biological chemistry,2007,282:11144-11154)。
35.哺乳动物的层粘连蛋白的α链、β链、γ链的氨基酸序列及编码它们的基因的核苷酸序列可以从公知的数据库(genbank[www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]等)中取得。表1中示出构成人的层粘连蛋白的各链的genbank登录号。层粘连蛋白例如可以按照由层粘连蛋白高表达细胞精制的方法、作为重组蛋白制造的方法等公知的方法而制造。另外，层粘连蛋白片段可以按照将全长层粘连蛋白用蛋白分解酶进行消化的方法、使层粘连蛋白片段作为重组体直接表达的方法等公知的方法而制造。或者，层粘连蛋白或其片段可以购入市售品。
[0036]
[表1]
[0037] 氨基酸序列核苷酸序列人层粘连蛋白α1链np_005550nm_005559人层粘连蛋白α2链np_000417nm_000426人层粘连蛋白α3链np_000218nm_000227人层粘连蛋白α4链np_002281nm_002290人层粘连蛋白α5链np_005551nm_005560人层粘连蛋白β1链np_002282nm_002291人层粘连蛋白β2链np_002283nm_002292人层粘连蛋白β3链np_000219nm_000228人层粘连蛋白γ1链np_002284nm_002293
人层粘连蛋白γ2链np_005553nm_005562人层粘连蛋白γ3链np_006050nm_006059
[0038]
期望如专利文献1中所记载的从神经嵴干细胞向skps分化诱导中的skps的收率提高。另外，期望作为适合用于再生医学的细胞源的、在无饲养层条件下培养的skps。
[0039]
本发明的发明人发现：在由神经嵴干细胞向skps的分化诱导培养中，通过将特定的层粘连蛋白种用作培养定着材料，可以在无饲养层的条件下进行细胞培养。另外，本发明的发明人发现：在该培养条件下，促进从神经嵴干细胞向skps的分化，skps的收率提高。
[0040]
根据本发明，可以有效地制作可分化为神经细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、毛乳头细胞等的skps。另外，根据本发明，在无饲养层的条件下由多能性干细胞向神经嵴干细胞的分化诱导、以及由神经嵴干细胞向skps的分化诱导成为可能。因此，根据本发明，可以提供适合作为用于再生医学的细胞源的skps。
[0041]
在一个方式中，本发明提供一种皮肤源性多能性前体细胞(skps)的制作方法。在该方法中，将神经嵴干细胞(ncs细胞)向skps进行分化诱导。更详细而言，该方法包括将ncs细胞在层粘连蛋白和/或其片段的存在下进行培养而使其分化为skps的步骤。
[0042]
作为能够用于向该skps的分化诱导培养的层粘连蛋白，可举出选自层粘连蛋白111(α1β1γ1)、层粘连蛋白121(α1β2γ1)、层粘连蛋白332(α3β3γ2)、层粘连蛋白421(α4β2γ1)、层粘连蛋白511(α5β1γ1)和层粘连蛋白521(α5β2γ1)中的至少1种，优选举出选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421和层粘连蛋白511中的至少1种。
[0043]
该层粘连蛋白及其片段可以使用任一种，或者也可以将两者组合使用。因此，能够用于向该skps的分化诱导培养的层粘连蛋白和/或其片段优选可以为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的片段中的至少1种，更优选可以为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421和层粘连蛋白511、以及它们的片段中的至少1种。
[0044]
作为该层粘连蛋白片段的实例，只要是与上述举出的层粘连蛋白种的全长蛋白具有同样的细胞粘接活性的层粘连蛋白的片段即可，其分子量及结构没有特别限定。作为能够用于向该skps的分化诱导培养的层粘连蛋白片段的优选的实例，可举出具有整合素结合活性的上述举出的层粘连蛋白种的片段，作为更优选例，可举出含有上述举出的层粘连蛋白种e8片段的片段，作为进一步优选的实例，可举出上述举出的层粘连蛋白种的e8片段。
[0045]
能够用于向该skps的分化诱导培养的层粘连蛋白和/或其片段可以为人源性层粘连蛋白和/或其片段，也可以为非人哺乳动物源性层粘连蛋白和/或其片段。优选该层粘连蛋白和/或其片段为与所制作的skps同种来源的层粘连蛋白和/或其片段，更优选为人层粘连蛋白和/或其片段。
[0046]
能够用于向该skps的分化诱导培养的层粘连蛋白和/或其片段可以为野生型层粘连蛋白和/或其片段，也可以为其突变体，或者可以为它们的组合。作为该层粘连蛋白和/或其片段的突变体的实例，可举出由在作为亲本的野生型层粘连蛋白或其片段(例如层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、或这些片段)中缺失、取代或附加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成、且具有整合素结合活性的多肽。在此，数个是指例如可以为2～10个，也可以为2～8个，也可以为2～6个，还可以为2～4个。因此，本说明书中，层粘连蛋白包含野生型层粘连蛋白及其突变体。对
层粘连蛋白片段而言也同样。
[0047]
进而，能够用于向该skps的分化诱导培养的层粘连蛋白和/或其片段可以为将上述的层粘连蛋白和/或其片段进一步进行了改性的改性层粘连蛋白和/或其片段。作为该改性层粘连蛋白和/或其片段的实例，可举出结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的该层粘连蛋白和/或其片段(本说明书中也称为“基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段”)(参照专利文献3、5)。从向skps的分化诱导的效率的观点出发，本发明中向skps的分化诱导培养中所使用的该层粘连蛋白和/或其片段优选为基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段。用于该修饰的基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段优选为与层粘连蛋白或其片段同种来源的片段，更优选为含有人基底膜蛋白聚糖(genbank：np_005520、nm_005529)或其增殖因子结合部位的片段。作为基底膜蛋白聚糖的增殖因子结合部位，可举出基底膜蛋白聚糖的结构域i～iii(例如人基底膜蛋白聚糖的氨基酸序列从n末端的第22位的缬氨酸至第1676位的脯氨酸的区域)(the journal of biological chemistry,2003,278：30106-30114)，其中，优选其中的结构域i(gly
25-pro
196
)。该基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段例如可以按照由将其高表达的细胞精制的方法、作为重组蛋白制造的方法等公知的方法而制造。
[0048]
在该基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段中，该基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段只要与层粘连蛋白或其片段的α链的n末端、α链的c末端、β链的n末端和γ链的n末端中的至少1处结合即可。因此，该基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段可具有1个、2个、3个或4个该基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段，其各自可以全部为基底膜蛋白聚糖，也可以全部为含有增殖因子结合部位的基底膜蛋白聚糖片段，或者一部分为基底膜蛋白聚糖、一部分为含有增殖因子结合部位的基底膜蛋白聚糖片段。用于本发明的该基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段优选为在层粘连蛋白或其片段的α链的c末端结合有1个基底膜蛋白聚糖或其增殖因子结合部位，更优选为在层粘连蛋白片段的α链的c末端结合有1个基底膜蛋白聚糖的增殖因子结合部位。该基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段中所含的层粘连蛋白、层粘连蛋白片段、以及基底膜蛋白聚糖及其增殖因子结合部位的优选的实例如上所述。
[0049]
该基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段可以使用公知的基因重组技术、例如按照专利文献3中所记载的步骤来制备。更详细而言，将编码层粘连蛋白或其片段的dna和编码基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的dna进行连结，构建编码基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段和层粘连蛋白或其片段的融合蛋白的dna。通过将含有编码该融合蛋白的dna的载体导入宿主细胞中使其表达，可以制备目标基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段。或者，通过使基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段化学性地结合在层粘连蛋白或其片段的适当的位置上，可以合成目标基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段。
[0050]
上述的本发明中可利用的层粘连蛋白和/或其片段可以包含用于它们的构建、分离、精制或与前述的基底膜蛋白聚糖或其片段的结合的序列，例如标签序列、接头序列等。
[0051]
在本发明的skps的制作方法中，在该层粘连蛋白和/或其片段的存在下，培养ncs细胞而使其分化为skps。在本工序中，该层粘连蛋白和/或其片段作为由ncs细胞向skps分化诱导培养时的培养定着材料使用。因此，在本发明的方法中，不需要如以往的skps分化诱
导培养方法那样使用饲养层细胞，在无饲养层的条件下的培养成为可能。
[0052]
本发明的skps的制作方法中所使用的ncs细胞可以利用公知的方法来制备。例如，ncs细胞可以通过从早期胚胎中采集ncs细胞、根据需要使其增殖、由多能性干细胞进行分化诱导等来制备。本发明的方法中所使用的ncs细胞优选为由多能性干细胞进行分化诱导而得到的、源自多能性干细胞的ncs细胞，更优选为由人工多能性干细胞(ips细胞)进行分化诱导而得到的、源自人工多能性干细胞(ips细胞)的ncs细胞。
[0053]
因此，在一个实施方式中，本发明的skps的制作方法可以还包括以下工序：由多能性干细胞分化诱导ncs细胞，制作源自多能性干细胞的ncs细胞。在优选的实施方式中，制作源自该多能性干细胞的ncs细胞的工序包括在层粘连蛋白和/或其片段的存在下培养多能性干细胞而使其分化为ncs细胞的步骤。
[0054]
进而，根据需要，在进行上述向ncs细胞的分化诱导之前，可以对多能性干细胞进行前培养。该前培养也另外优选在层粘连蛋白和/或其片段的存在下进行。该前培养之后，可以将维持多能性的干细胞用于向该ncs细胞的分化诱导。
[0055]
作为该ncs细胞的制作工序中所使用的层粘连蛋白和/或其片段的种类，没有特别限定，可举出：能够用于上述的向skps的分化诱导培养的层粘连蛋白和/或其片段；专利文献2～5中所记载的用于多能性干细胞的培养的层粘连蛋白、层粘连蛋白片段及改性层粘连蛋白等。优选本工序中所使用的层粘连蛋白和/或其片段可以为能够用于上述的向skps的分化诱导培养的选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种。本工序中所使用的层粘连蛋白和/或其片段可以为与用于上述的skps的分化诱导的层粘连蛋白和/或其片段相同的种类，也可以为不同的种类。在优选的实施方式中，该ncs细胞的制作工序中所使用的层粘连蛋白和/或其片段为能够用于上述的向skps的分化诱导培养的基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段。通过使用基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段，可以提高向ncs细胞的分化诱导的效率。在本发明的优选的实施方式中，在能够用于上述的向skps的分化诱导培养的基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段的存在下，培养多能性干细胞而使其分化为ncs细胞之后，继续将该ncs细胞进行培养而使其分化为skps。
[0056]
在该ncs细胞的制作工序中，该层粘连蛋白和/或其片段被用作由多能性干细胞向ncs细胞的分化诱导培养时的培养定着材料。因此，在本工序中，不需要如以往的多能性干细胞的培养方法那样使用饲养层细胞，在无饲养层的条件下的培养成为可能。
[0057]
本发明中的多能性干细胞的前培养、由多能性干细胞向ncs细胞的分化诱导培养以及由ncs细胞向skps的分化诱导培养优选在体外(ex vivo)进行，不包括在有生命的人或动物的个体上或个体内的培养。因此，本发明中用作培养定着材料的该层粘连蛋白和/或其片段优选在体外(ex vivo)用，而不用于在有生命的人或动物的个体上或个体内的培养。
[0058]
本发明中，该层粘连蛋白和/或其片段只要发挥作为培养定着的作用，则可以在任何方法中被使用。例如，可以在含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材上培养细胞。作为含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材的实例，可举出具有含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层的培养基材(例如培养板、培养网、培养皿等)，作为其实例，可举出通过利用含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层剂进行涂层而吸附该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材。这种培养基材中的该层粘连蛋白和/或其片段的含量优选为：该培养基材与培养物接触的面积每1cm2为0.05～50μg，更优选为0.1～10μg即可。例如，利用涂层的面积每1cm2含
有该层粘连蛋白和/或其片段优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg的涂层剂，将该培养基材进行涂层处理，使该层粘连蛋白和/或其片段吸附于该培养基材即可。
[0059]
或者，在本发明中，可以在添加有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基中进行细胞培养。在该培养基中添加该层粘连蛋白和/或其片段时，可以在接种细胞之前，在培养基中添加该层粘连蛋白和/或其片段，或者也可以在培养基中与细胞一起添加该层粘连蛋白和/或其片段。以作为每1ml培养基的最终浓度成为优选0.1～100μg、更优选0.2～20μg的方式调整该培养基中的该层粘连蛋白和/或其片段的含量即可。
[0060]
在含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材或涂层剂、培养基中，可以含有该层粘连蛋白和/或其片段以外的定着材料或细胞粘附分子。作为该定着材料或细胞粘附分子的实例，可举出：明胶、胶原蛋白、基质胶、纤维粘连蛋白、聚-l-赖氨酸等。
[0061]
在用于由ncs细胞向skps分化诱导培养的培养基以及用于由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的培养基中，均可以使用通常用于干细胞的分化诱导的分化培养基。另外，在多能性干细胞的前培养中可以使用通常用于干细胞的维持培养的维持培养基。这些培养基的基础培养基可以从通常用于干细胞培养的基础培养基中适当选择，且也可以使用市售品。作为该基础培养基的实例，可举出：mem培养基(minimum essential medium)、bme培养基(basal medium eagle)、imdm培养基(iscove’s modified dulbecco’s medium)、dmem培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium)、ham培养基、rpmi培养基(roswell park memorial institute medium)、fischer’s培养基、以及它们的混合培养基。其中，优选dmem/ham’s f12培养基(以下，也简称为“dmem/f12培养基”)。在以无饲养层的条件下培养时，可以从用于干细胞的无饲养层培养所制备的基础培养基中适当选择，也可以使用市售品。作为其实例，可举出stemfit(注册商标)ak02n(味之素(株))等。
[0062]
该培养基可以为含血清的培养基，也可以为无血清培养基，还可以为含有血清代替物的培养基，优选为含有无血清培养基或血清代替物的培养基。该血清代替物为含有作为血清中所含的成分的白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、骨胶原前体、微量元素(例如铅、硒等)、营养因子(egf(表皮生长因子)、bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)等)等成分的组合物，只要具有细胞增殖能力，其组成就没有限定。作为具体的实例，可举出b-27(商标)添加剂、n2添加剂、knockout血清替代物等。进而，根据需要可以在培养基中含有维生素、缓冲剂、无机盐类、抗生物质(例如青霉素、卡纳霉素、链霉素)、2-巯基乙醇等通常用于干细胞培养基的成分。优选该培养基为相对于培养的细胞不含有异种生物来源成分的无异源物人多能诱导干细胞培养基。其中，只要可以实现无饲养层、优选进一步无异源物中的培养，该培养基也可以使用市售品。
[0063]
用于由该ncs细胞向skps分化诱导培养的分化培养基优选含有选自血清代替物、egf和bfgf中的至少1种营养因子，更优选含有血清代替物、egf和bfgf。作为血清代替物，优选上述的b-27(商标)添加物、n2添加物或knockout血清替代物，更优选b-27(商标)添加物。这些营养因子可以按照常规方法来制备，或者也可以使用市售品。该分化培养基中的该营养因子的含量可以根据培养条件、使用的多能性干细胞的种类、抑制剂的种类等而适当设定。例如，该培养基中的血清代替物的浓度优选为0.5质量％以上，更优选1质量％以上，且优选20质量％以下，更优选5质量％以下，或者优选浓度范围0.5～20质量％，更优选1～5质量％。另外，例如该培养基中的egf和bfgf的浓度分别优选1ng/ml以上，更优选10ng/ml以
上，且优选100ng/ml以下，更优选50ng/ml以下，或者浓度范围优选1～100ng/ml，更优选10～50ng/ml。
[0064]
进而，通过在该分化培养基中含有wnt信号激动剂，能够促进ncs细胞向skps的分化诱导，skps的收率提高。本发明中所使用的wnt信号激动剂如上述中定义的那样，作为优选的实例，可举出上述的活化β-连环蛋白通路的因子和gsk-3抑制剂等抑制细胞内β-连环蛋白分解的因子。优选gsk-3抑制剂。
[0065]
作为gsk-3抑制剂的实例，可举出：氨基嘧啶化合物(例如gsk-3inhibitor xvi、商品名chir99021等；cas 252917-06-9)、双-吲哚(靛玉红)化合物(以下，也称为“bio”)(例如，(2’z,3’e)-6-溴靛玉红-3
’‑
肟；cas 667463-62-9)、bio的丙酮肟化合物(以下，也称为“bio-丙酮肟”)(例如，(2’z,3’e)-6-溴靛玉红-3
’‑
丙酮肟)、噻二唑烷(tdzd)化合物(例如，4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、氧代噻二唑烷-3-硫酮化合物(例如，2,4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮)、噻吩基α-氯甲基酮化合物(例如，2-氯-1-(4,4-二溴-噻吩-2-基)-乙酮)、苯基α溴甲基酮化合物(例如，α-4-二溴苯乙酮)、含噻唑的脲化合物(例如，n-(4-甲氧基苄基)-n
’‑
(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)、1h-吡唑并[3,4-b]喹喔啉-3-胺：商品名nsc693868(cas 40254-90-8)、(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮：商品名sb216763(cas 280744-09-4)、3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮：商品名sb415286(cas 264218-23-7)、gsk-3βinhibitor xii：商品名tws119(cas 601514-19-6)、gsk-3β肽抑制剂(例如h-keappappqspp-nh2)等。其中，优选选自gsk-3inhibitor xvi(cas 252917-06-9)、(2’z,3’e)-6-溴靛玉红-3
’‑
肟(cas 667463-62-9)、1h-吡唑并[3,4-b]喹喔啉-3-胺(cas 40254-90-8)、(2,4二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮(cas 280744-09-4)、3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮(cas 264218-23-7)和gsk-3βinhibitor xii(cas 601514-19-6)中的至少1种，进一步优选gsk-3 inhibitor xvi。
[0066]
上述举出的wnt信号激动剂可以按照常规方法来制备，或者也可以使用市售品。分化培养基中所含的wnt信号激动剂的含量可以根据培养条件、使用的wnt信号激动剂的种类等而在wnt信号被活化且细胞增殖不停止的范围内适当设定。例如，使用gsk-3 inhibitor xvi作为wnt信号激动剂的情况下，培养基中的该wnt信号激动剂的浓度优选为0.5μm以上，更优选2μm以上，且优选5μm以下，更优选4μm以下。或者，培养基中的该wnt信号激动剂的浓度范围优选0.5～5μm，更优选2～4μm。进一步优选培养基中的该wnt信号激动剂的浓度为3μm。
[0067]
另一方面，用于由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的分化培养基优选含有tgfβ信号抑制剂和/或bmp信号抑制剂。由此，促进向ncs细胞的分化诱导，结果使目标skps的收率提高。作为该tgfβ信号抑制剂的实例，可举出4-[4-(1,3-苯并二噁唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺(例如，sb431542(商品名)；cas 301836-41-9)等。作为该bmp信号抑制剂的实例，可举出noggin、ldn193189(cas 1062368-24-4)等。这些tgfβ信号抑制剂和bmp信号抑制剂可以按照常规方法来制备，或者也可以使用市售品。用于该ncs细胞制作的分化培养基中的该tgfβ信号抑制剂和bmp信号抑制剂的含量可以根据培养条件、使用的多能性干细胞的种类、抑制剂的种类等而适当设定。例如，该培养基中的sb431542的浓度优选为1μm以上，更优选5μm以上，且优选为30μm以下，更优选20μm以下，或者浓度范围
优选1～30μm，更优选5～20μm。另外，例如，该培养基中的noggin的浓度优选10ng/ml以上，更优选100ng/ml以上，且优选1000ng/ml以下，更优选700ng/ml以下，或者浓度范围优选10～1000ng/ml，更优选100～700ng/ml。
[0068]
用于由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导的培养条件可以根据使用的细胞的种类等而适当设定。例如，在使用ips细胞作为多能性干细胞的情况下，用于向ncs细胞分化诱导的培养期间优选为1～20天。用于由ncs细胞向skps分化诱导的培养条件也可以另外适当设定。例如，通过在含有wnt信号激动剂的分化诱导培养基中优选培养ncs细胞3～5天，可以使细胞有效地分化为skps。本发明中，细胞的培养方法可以为贴壁培养和悬浮培养的任一种，但优选选择贴壁培养。
[0069]
在优选的实施方式中，对上述进行了分化的skps进行1次或2次以上的传代培养。通过进行传代培养，可以作为纯度高的细胞团块得到skps。skps的传代方法和传代次数可以根据培养条件等从通常的传代方法中适当选择。例如，关于贴壁培养系细胞，利用酶等剥离细胞后通过稀释培养而进行传代，关于悬浮培养系细胞，通过稀释培养而进行传代。
[0070]
进行了分化的ncs细胞或skps可以基于对上述各自的细胞标记蛋白或标记基因的表达而进行鉴定。或者可以基于显微镜观察下的细胞形态等而确认细胞向ncs细胞或向skps的分化。
[0071]
在本发明的skps的制作方法中，由ncs细胞向skps的分化以高概率产生，因此，不一定需要从培养后的细胞分离回收skps。另一方面，为了进一步提高skps的纯度，也可以进行从培养物分离回收skps。skps的分离回收可以利用常规方法来进行，例如，可以通过使用细胞分选仪的方法、使用磁珠的方法等来进行。
[0072]
如上所述，在本发明中，该层粘连蛋白和/或其片段在由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养以及由ncs细胞向skps分化诱导培养中作为培养定着材料使用。因此，在另一个实施方式中，本发明提供一种以该层粘连蛋白和/或其片段为有效成分的、用于ncs细胞向skps分化诱导培养的定着材料。进而，本发明提供一种以该层粘连蛋白和/或其片段为有效成分的、用于多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的定着材料。在优选的实施方式中，用于该多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的定着材料中所含的层粘连蛋白和/或其片段为上述的基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段。
[0073]
在一个实施方式中，该本发明的定着材料以如下的方式被提供：含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材，例如具有含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层的培养基材(例如培养板、培养网、培养皿等)，更具体而言，通过利用含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层剂进行涂层而吸附该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材；含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层剂；含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基等。含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材、涂层剂和培养基可以含有上述的该层粘连蛋白和/或其片段以外的定着材料或细胞粘附分子。另外，该涂层剂也可以含有通常的培养基材的涂层剂中所含有的其它成分(例如作为溶剂为缓冲液)。另外，该培养基也可以含有通常的培养基中所含有的其它成分(例如，如上所述的基础培养基、血清、血清代替物、营养因子等)。在由ncs细胞向skps分化诱导培养中使用该培养基的情况下，该培养基优选含有上述的wnt信号激动剂，更优选含有该wnt信号激动剂和血清代替物、egf和bfgf。另一方面，在由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养中使用该培养基的情况下，该培养基优选含有上述的tgfβ信号抑制剂和/或
bmp信号抑制剂。
[0074]
在一个实施方式中，该本发明的定着材料可以由该层粘连蛋白和/或其片段构成。该情况下，该本发明的定着材料优选通过添加在培养基材的涂层剂中或添加在培养基中而被使用。
[0075]
本发明的定着材料为含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材的情况下，该培养基材与培养物接触的面积每1cm2，该培养基材中的该层粘连蛋白和/或其片段的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg即可。本发明的定着材料为含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层剂的情况下，该涂层剂涂层的面积每1cm2，该涂层剂中的该层粘连蛋白和/或其片段的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg即可。本发明的定着材料为含有该层粘连蛋白和/或其片段的培养基的情况下，作为该培养基每1ml的最终浓度，该培养基中的该层粘连蛋白和/或其片段的含量为优选0.1～100μg、更优选0.2～20μg即可。将该本发明的定着材料添加在培养基材的涂层剂中而使用的情况下，以该涂层剂中的该层粘连蛋白和/或其片段的含量成为上述的范围的方式调整其使用量即可。或者，将该本发明的定着材料添加在培养基中而使用的情况下，以该培养基每1ml的该层粘连蛋白和/或其片段的最终浓度成为上述的范围的方式调整其使用量即可。
[0076]
进而，在另一个实施方式中，本发明提供一种含有该本发明的定着材料的、用于由ncs细胞向skps分化诱导培养的培养基材。另外，本发明提供一种含有该本发明的定着材料、用于从ncs细胞向skps的分化诱导培养的细胞培养试剂盒。
[0077]
进而，在另一个实施方式中，本发明提供一种含有该本发明的定着材料的、用于由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的培养基材。另外，本发明提供一种含有该本发明的定着材料的、用于由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的细胞培养试剂盒。在优选的实施方式中，用于由该多能性干细胞向ncs细胞分化诱导培养的培养基材或细胞培养试剂盒中的本发明的定着材料中所含的层粘连蛋白和/或其片段为上述的基底膜蛋白聚糖修饰-层粘连蛋白/片段。
[0078]
在优选的实施方式中，该本发明的培养基材为具有含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层的培养基材(例如培养板、培养网、培养皿等)，更优选为通过利用含有该层粘连蛋白和/或其片段的涂层剂进行涂层而吸附该层粘连蛋白和/或其片段的培养基材。在优选的实施方式中，该本发明的细胞培养试剂盒除该层粘连蛋白和/或其片段之外，根据需要也可以含有培养基材、用于由多能性干细胞向ncs细胞分化诱导或由ncs细胞向skps分化诱导的分化培养基或其添加剂、用于多能性干细胞的维持培养的培养基或其添加剂等。该本发明的细胞培养试剂盒中所含的该层粘连蛋白和/或其片段可以涂布在培养基材上，或者也可以在用于涂布培养基材的涂层剂或培养基中含有。
[0079]
另外，作为例示的实施方式，本发明包含以下的物质、制造方法、用途、方法等。但是，本发明并不限定于这些实施方式。
[0080]
[1]一种皮肤源性多能性前体细胞的制作方法，其中：
[0081]
包括在选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种存在下培养神经嵴干细胞，使其分化为皮肤源性多能性前体细胞的步骤，
[0082]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0083]
[2]根据[1]所述的方法，其中，优选还包括制作所述神经嵴干细胞的工序，
[0084]
该工序包括在选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种存在下培养多能性干细胞，使其分化为神经嵴干细胞的步骤，
[0085]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0086]
[3]根据[2]所述的方法，其中，优选还包括预先在选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种存在下对所述多能性干细胞进行维持培养的步骤。
[0087]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述层粘连蛋白片段优选为具有整合素结合活性的层粘连蛋白片段，
[0088]
更优选为含有层粘连蛋白e8片段的层粘连蛋白片段。
[0089]
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种优选包含结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的所述层粘连蛋白或其片段，
[0090]
更优选为结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的所述层粘连蛋白或其片段。
[0091]
[6]根据[5]所述的方法，其中，所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i～iii的任一种的片段，
[0092]
更优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i的片段。
[0093]
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，优选在选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的存在下的神经嵴干细胞的培养包括：在含有该选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基材上培养该细胞、或在含有该选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基中培养该细胞的步骤。
[0094]
[8]根据[2]～[7]中任一项所述的方法，其中，优选在选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的存在下的多能性干细胞的培养包括：在含有选自该层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基材上培养该细胞、或在含有该选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基中培养该细胞的步骤。
[0095]
[9]根据[7]或[8]所述的方法，优选所述培养基材与培养物接触的面积每1cm2，选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的使用量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg，或作为所述培养基每1ml的最终浓度为优选0.1～100μg、更优选0.2～20μg，或者，
[0096]
将选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种添加在所述培养基材的涂层剂中而使用的情况下，涂层的面积每1cm2，该涂层剂中的该选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg。
[0097]
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，优选所述神经嵴干细胞的培养包括在含有wnt信号激动剂的分化培养基中培养该细胞的步骤。
[0098]
[11]根据[10]所述的方法，其中，所述wnt信号激动剂优选为活化β-连环蛋白通路的因子，
[0099]
更优选为β-连环蛋白的磷酸化酶抑制剂，
[0100]
进一步优选为gsk-3抑制剂，
[0101]
进一步优选为选自氨基嘧啶化合物、双-吲哚(靛玉红)化合物(bio)或其丙酮肟化
合物、噻二唑烷(tdzd)化合物、氧代噻二唑烷-3-硫酮化合物、噻吩基α-氯甲基酮化合物、苯基α溴甲基酮化合物、含噻唑的脲化合物、1h-吡唑并[3,4-b]喹喔啉-3-胺、(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮、3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮、gsk-3βinhibitor xii和gsk-3β肽抑制剂中的至少1种，
[0102]
进一步优选为选自gsk-3inhibitor xvi、(2’z,3’e)-6-溴靛玉红-3
’‑
肟(cas 667463-62-9)、1h-吡唑并[3,4-b]喹喔啉-3-胺、(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮、3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮和gsk-3βinhibitor xii中的至少1种，
[0103]
进一步优选为gsk-3inhibitor xvi。
[0104]
[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中，所述分化培养基中的所述wnt信号激动剂的浓度优选0.5～5μm、更优选2～4μm。
[0105]
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，优选所述神经嵴干细胞的培养包括在含有营养因子的分化培养基中培养该细胞的步骤，
[0106]
该营养因子优选为选自血清代替物、egf和bfgf中的至少1种，
[0107]
更优选为血清代替物、egf和bfgf。
[0108]
[14]根据[13]所述的方法，其中，所述分化培养基中的所述血清代替物的浓度为优选0.5～20质量％、更优选1～5质量％，
[0109]
所述分化培养基中的所述egf和bfgf的浓度分别为优选1～100ng/ml、更优选10～50ng/ml。
[0110]
[15]根据[2]～[14]中任一项所述的方法，其中，优选培养所述多能性干细胞而使其分化的工序包括在含有选自tgfβ信号抑制剂和bmp信号抑制剂中的至少1种的分化培养基中培养该细胞的步骤。
[0111]
[16]根据[15]所述的方法，其中，优选所述tgfβ信号抑制剂为4-[4-(1,3-苯并二噁唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，所述bmp信号抑制剂为noggin。
[0112]
[17]根据[1]～[16]中任一项中任一项所述的方法，其中，优选所述皮肤源性多能性前体细胞共表达巢蛋白和纤维粘连蛋白。
[0113]
[18]根据[1]～[17]中任一项所述的方法，其中，优选所述神经嵴干细胞为人源性神经嵴干细胞。
[0114]
[19]根据[1]～[18]中任一项所述的方法，其中，优选所述神经嵴干细胞为源自多能性干细胞的神经嵴干细胞。
[0115]
[20]根据[1]～[19]中任一项所述的方法，其中，优选不使用饲养层细胞而进行所述神经嵴干细胞的培养。
[0116]
[21]根据[1]～[20]中任一项所述的方法，其中，优选在不存在异种源性成分下进行所述神经嵴干细胞的培养。
[0117]
[22]一种神经嵴干细胞的制作方法，其中，
[0118]
包括在选自结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种的存在下，培养多能性干细胞，使其分化为神经嵴干细胞的步骤，
[0119]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋
白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0120]
[23]根据[22]所述的方法，其中，优选还包括在选自结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种存在下，将所述多能性干细胞预先进行维持培养的步骤。
[0121]
[24]根据[22]或[23]所述的方法，其中，所述层粘连蛋白片段优选为具有整合素结合活性的层粘连蛋白片段，
[0122]
更优选为含有层粘连蛋白e8片段的层粘连蛋白片段。
[0123]
[25]根据[22]～[24]中任一项所述的方法，其中，所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i～iii的任一种的片段，
[0124]
更优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i的片段。
[0125]
[26]根据[22]～[25]中任一项所述的方法，其中，优选在选自结合有所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种的存在下的细胞的培养包括：在含有选自结合有该基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基材上培养该细胞；或在含有选自结合有该基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基中培养该细胞的步骤。
[0126]
[27]根据[26]所述的方法，其中，优选所述培养基材与培养物接触的面积每1cm2，选自结合有所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的层粘连蛋白及其片段中的至少1种的使用量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg，或作为所述培养基每1ml的最终浓度为优选0.1～100μg、更优选0.2～20μg，
[0127]
或者，
[0128]
将选自结合有所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种添加在所述培养基材的涂层剂中使用的情况下，涂层的面积每1cm2，该涂层剂中的选自结合有该基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg。
[0129]
[28]根据[22]～[27]中任一项所述的方法，其中，优选培养所述多能性干细胞使其分化的工序包括在含有选自tgfβ信号抑制剂和bmp信号抑制剂中的至少1种的分化培养基中培养该细胞的步骤，
[0130]
更优选该tgfβ信号抑制剂为4-[4-(1,3-苯并二噁唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，所述bmp信号抑制剂为noggin。
[0131]
[29]根据[22]～[28]中任一项所述的方法，优选所述多能性干细胞为人源性多能性干细胞。
[0132]
[30]根据[22]～[29]中任一项所述的方法，其中，优选不使用饲养层细胞而进行所述多能性干细胞的培养。
[0133]
[31]根据[22]～[30]中任一项所述的方法，其中，优选在不存在异种源性成分下进行所述多能性干细胞的培养。
[0134]
[32]一种定着材料，其以选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种为有效成分，用于由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞的分化诱导培养，其中，
[0135]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋
白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0136]
[33]一种定着材料，其以选自结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种为有效成分，用于由多能性干细胞向神经嵴干细胞的分化诱导培养，其中，
[0137]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0138]
[34]根据[32]或[33]所述的定着材料，其中，所述层粘连蛋白片段优选为具有整合素结合活性的层粘连蛋白片段，
[0139]
更优选为含有层粘连蛋白e8片段的层粘连蛋白片段。
[0140]
[35]根据[32]～[34]中任一项所述的定着材料，其中，选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种优选包含结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的所述层粘连蛋白或其片段，
[0141]
更优选为结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的所述层粘连蛋白或其片段。
[0142]
[36]根据[33]～[35]中任一项所述的定着材料，其中，所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i～iii的任一种的片段，
[0143]
更优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i的片段。
[0144]
[37]根据[32]～[36]中任一项所述的定着材料，其中，优选为含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基材、或为具有含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的涂层的培养基材、或为含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的涂层剂、或为含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基。
[0145]
[38]根据[37]所述的定着材料，其中，该培养基材与培养物接触的面积每1cm2，所述培养基材中的选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg，
[0146]
或作为该培养基每1ml的最终浓度，所述培养基中的选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.1～100μg、更优选0.2～20μg，或者，
[0147]
该涂层剂涂层的面积每1cm2，所述涂层剂中的选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg。
[0148]
[39]一种用于由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞分化诱导培养的培养基材，其含有上述[32]、[34]～[38]中任一项所述的定着材料。
[0149]
[40]一种用于由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞分化诱导培养的细胞培养试剂盒，其含有上述[32]、[34]～[38]中任一项所述的定着材料。
[0150]
[41]一种用于由多能性干细胞向神经嵴干细胞分化诱导培养的培养基材，其含有上述[33]～[38]中任一项所述的定着材料。
[0151]
[42]一种用于由多能性干细胞向神经嵴干细胞分化诱导培养的细胞培养试剂盒，其含有上述[33]～[38]中任一项所述的定着材料。
[0152]
[43]选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种在制造由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞分化诱导培养的定着材料中的应用，其中，
[0153]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0154]
[44]选自结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、层粘连蛋白及其片段中的至少1种在制造由多能性干细胞向神经嵴干细胞分化诱导培养的定着材料中的应用，其中，
[0155]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0156]
[45]选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种用作由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞分化诱导培养的定着材料的应用，其中，
[0157]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0158]
[46]结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种用作由多能性干细胞向神经嵴干细胞分化诱导培养的定着材料的应用，其中，
[0159]
该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0160]
[47]根据[43]～[46]中任一项所述的应用，其中，所述层粘连蛋白片段优选为具有整合素结合活性的层粘连蛋白片段，
[0161]
更优选为含有层粘连蛋白e8片段的层粘连蛋白片段。
[0162]
[48]根据[43]～[47]中任一项所述的应用，其中，选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种优选包含结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的所述层粘连蛋白或其片段，
[0163]
更优选为结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的该层粘连蛋白或其片段。
[0164]
[49]根据[44]、[46]～[48]中任一项所述的应用，其中，所述基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i～iii的任一种的片段，
[0165]
更优选为含有基底膜蛋白聚糖的结构域i的片段。
[0166]
[50]根据[43]～[49]中任一项所述的应用，其中，优选所述定着材料为含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基材、或为具有含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的涂层的培养基材、或为含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的涂层剂、或为含有选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的培养基。
[0167]
[51]根据[50]所述的应用，其中，该培养基材与培养物接触的面积每1cm2，所述培养基材中的选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg，或
[0168]
作为该培养基每1ml的最终浓度，所述培养基中的选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.1～100μg、更优选0.2～20μg，或
[0169]
该涂层剂涂层的面积每1cm2，所述涂层剂中的选自所述层粘连蛋白及其片段中的至少1种的含量为优选0.05～50μg、更优选0.1～10μg。
[0170]
[52]用于用作用于由神经嵴干细胞向皮肤源性多能性前体细胞分化诱导培养的定着材料的、选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种，在此，该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0171]
[53]用作用于由多能性干细胞向神经嵴干细胞分化诱导培养的定着材料的、结合有基底膜蛋白聚糖或含有其增殖因子结合部位的片段的、选自层粘连蛋白及其片段中的至少1种，其中，该层粘连蛋白为选自层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白332、层粘连蛋白421、层粘连蛋白511和层粘连蛋白521、以及它们的突变体中的至少1种。
[0172]
[54]根据[1]～[31]中任一项所述的方法，其为体外(ex vivo)方法。
[0173]
[55]根据[1]～[31]中任一项所述的方法，其中，所述培养不包括在有生命的人或动物的个体上或个体内的培养。
[0174]
[56]根据[43]～[51]中任一项所述的应用，其为体外(ex vivo)法中的应用。
[0175]
[57]根据[43]～[51]中任一项所述的应用，其中，所述应用不包括在有生命的人或动物的个体上或个体内的应用。
[0176]
实施例
[0177]
以下，使用实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明的技术的范围并不限定于这些实施例。
[0178]
参考例1层粘连蛋白的制备
[0179]
作为定着材料用的层粘连蛋白片段，按照国际公开公报第2014/103534号中记载的方法制备层粘连蛋白111的e8片段(lm111e8)、层粘连蛋白121的e8片段(lm121e8)、层粘连蛋白332的e8片段(lm332e8)、层粘连蛋白421的e8片段(lm421e8)、层粘连蛋白511的e8片段(lm511e8)和层粘连蛋白521的e8片段(lm521e8)。
[0180]
参考例2基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白的制备
[0181]
(1)基底膜蛋白聚糖修饰lm511e8(p-lm511e8)的制备
[0182]
按照国际公开公报第2014/199754号中记载的方法，通过下述的步骤制备人基底膜蛋白聚糖的结构域i(gly
25-pro
196
)(以下也称为pln-d1)片段融合于人层粘连蛋白α5链e8片段的c末端部而成的层粘连蛋白511e8片段(以下也称为基底膜蛋白聚糖修饰lm511e8、或p-lm511e8)。
[0183]
(1-1)人层粘连蛋白α5链、β1链、γ1链的各e8片段表达载体的制作
[0184]
首先，将克隆用质粒pbluescript ks( )(stratagene)作为模板，使用以下的3种引物组进行pcr，分别制作了在质粒的多克隆部位内的ecorv的5’侧插入有编码6
×
his标签(hhhhhh)的dna序列、编码ha(血凝素)标签(vpvdvpdva)的dna序列、或编码flag标签(dvkddddk)的dna序列的3种pbluescript ks( )。
[0185]
(i)6
×
his标签导入用引物
[0186]5’‑
atgatgatgaagcttatcgataccgt-3’(正向、序列号1)
[0187]5’‑
catcatcatgatatcgaattcctgca-3’(反向、序列号2)
[0188]
(ii)ha标签导入用引物
[0189]5’‑
atcatatggataaagcttatcgataccgt-3’(正向、序列号3)
[0190]5’‑
gtgccagattatgcagatatcgaattcct-3’(反向、序列号4)
[0191]
(iii)flag标签导入用引物
[0192]5’‑
atccttgtaatcaagcttatcgataccgt-3’(正向、序列号5)
[0193]5’‑
gatgatgataaggatatcgaattcct-3’(反向、序列号6)
[0194]
接着，将含有人层粘连蛋白α5链、β1链、γ1链的全长核苷酸序列的质粒(the journal of biological chemistry,2004,279:10946-10954)作为模板，使用以下的引物进行pcr，将相当于α5链e8片段(ala
2534-ala
3327
)、β1链e8片段(leu
1561-leu
1786
)和γ1链e8片段(asn
1362-pro
1609
)的区域进行扩增。
[0195]
(iv)α5链e8片段扩增用引物
[0196]5’‑
gctgccgaggatgctgctggccagg-3’(正向、序列号7)
[0197]5’‑
ctaggcaggatgccgggcgggctga-3’(反向、序列号8)(v)β1链e8片段扩增用引物
[0198]5’‑
cttcagcatagtgctgctgacattg-3’(正向、序列号9)
[0199]5’‑
ttacaagcatgtgctatacacagcaac-3’(反向、序列号10)
[0200]
(vi)γ1链e8片段扩增用引物
[0201]5’‑
aatgacattctcaacaacctgaaag-3’(正向、序列号11)
[0202]5’‑
ctagggcttttcaatggacggggtg-3’(反向、序列号12)
[0203]
将扩增的dna片段插入附加有标签序列的pbluescript ks( )的多克隆部位的ecorv部位之后，用制限酶ecori和hindiii切出含有编码5’侧标签序列的扩增dna片段，插入哺乳细胞用表达载体psectag2b(invitrogen、包含编码小鼠ig-κ链v-j2-c信号肽的dna序列)，分别制作了人α5链e8片段(在n末端侧含有6
×
his标签)、人β1链e8片段(在n末端侧含有ha标签)和人γ1链e8片段(在n末端侧含有flag标签)的表达载体。
[0204]
(1-2)基底膜蛋白聚糖结构域融合层粘连蛋白α5链e8片段表达载体的制作
[0205]
将人层粘连蛋白α5链e8片段表达载体作为模板，使用以下的引物进行pcr，将编码人层粘连蛋白α5链e8片段的c末端部分(leu
570-pro
772
)和人层粘连蛋白α1链g3-g4结构域间接头序列(daedskllpeprafp、序列号13)的dna片段进行扩增。
[0206]
(vii)用于导入接头序列的扩增用引物
[0207]5’‑
cctcaagcggctgaacacgacaggcg-3’(正向、序列号14)
[0208]5’‑
atatggatcctggaaaagcccggggctctggcaagagcttgctgtcctctgcatcaggccccaggcccgg-3’(反向、序列号15、含有制限酶bamhi识别序列)
[0209]
将得到的dna片段用制限酶asci(该制限酶的识别序列存在于编码人层粘连蛋白α5链e8片段的c末端部分的dna序列内)和bamhi进行消化，制成dna片段1。
[0210]
将人基底膜蛋白聚糖表达载体(journal of biological chemistry,2010,285(47):36645-36655)作为模板，使用以下的引物进行pcr，将编码人基底膜蛋白聚糖的结构域i(pln-d1)(gly
25-pro
196
)的c末端附加有his标签序列的dna片段进行扩增。
[0211]
(viii)pln-d1序列扩增用引物
[0212]5’‑
atatatatggatccgggctgagggcatacgatggcttgtctctg-3’(正向、序列号16、含有制限酶bamhi识别序列)
[0213]5’‑
atatatatgcggccgcctaatgatgatgatgatgatgtgggaactggggcactgtgcccag-3’(反向、序列号17、含有制限酶noti识别序列)
[0214]
将得到的dna片段用制限酶bamhi和noti进行消化，制成dna片段2。
[0215]
在含有将人层粘连蛋白α5链e8片段表达载体用制限酶asci和noti进行消化而得到的人层粘连蛋白α5链e8片段的n末端部分(met
1-asp
610
)的表达载体片段中插入上述的dna片段1和2，制作了pln-d1融合人层粘连蛋白α5链e8片段表达载体。
[0216]
(1-3)pln-d1融合层粘连蛋白片段的表达和精制
[0217]
将pln-d1融合人层粘连蛋白α5链e8片段表达载体与人β1链e8片段(在n末端侧含有ha标签)表达载体及人γ1链e8片段(在n末端侧含有flag标签)表达载体进行混合，转染源自人肾脏的293f细胞，进行72小时培养之后，回收培养液，利用使用ni-nta agarose和anti-flag m2 affinity gel(sigama)的亲和色谱法，精制了pln-d1融合的层粘连蛋白511的e8片段(p-lm511e8)。
[0218]
(2)基底膜蛋白聚糖修饰lm111e8(p-lm111e8)的制备
[0219]
除了将α5链e8变更为α1链e8之外，按照与(1)同样的步骤制备了pln-d1融合的层粘连蛋白111的e8片段(p-lm111e8)。
[0220]
(3)基底膜蛋白聚糖修饰lm121e8(p-lm121e8)的制备
[0221]
将α5链e8变更为α1链e8，并将β1链e8变更为β2链e8，除此之外，按照与(1)同样的步骤制备了pln-d1融合的层粘连蛋白121的e8片段(p-lm121e8)。
[0222]
(4)基底膜蛋白聚糖修饰lm332e8(p-lm332e8)的制备
[0223]
除了α链、β链和γ链使用α3链、β3链和γ2链之外，按照与(1)同样的步骤制备了pln-d1融合的层粘连蛋白332的e8片段(p-lm332e8)。
[0224]
(5)基底膜蛋白聚糖修饰lm421e8(p-lm421e8)的制备
[0225]
除了α链、β链和γ链使用α4链、β2链及γ1链之外，按照与(1)同样的步骤制备了pln-d1融合的层粘连蛋白421的e8片段(p-lm421e8)。
[0226]
(6)基底膜蛋白聚糖修饰lm521e8(p-lm521e8)的制备
[0227]
除了将β1链e8变更为β2链e8之外，通过与(1)同样的步骤制备了pln-d1融合的层粘连蛋白521的e8片段(p-lm521e8)。
[0228]
实施例1层粘连蛋白定着材料的构建
[0229]
(1)层粘连蛋白定着材料的构建
[0230]
将参考例1中准备的各种层粘连蛋白或参考例2中制备的基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白预先涂层在培养基材上，或与细胞同时添加在培养基中。在预先涂层的情况下，使各种层粘连蛋白溶解于dulbecco’s phosphate-buffered saline(dpbs)(life technologies公司制造、商品目录编号：14190-250)，将得到的层粘连蛋白溶液(含有层粘连蛋白2.5μg/ml)在培养基材(35mm直径培养皿)的表面扩展(层粘连蛋白最终浓度：约0.5μg/涂层面积cm2)，在37℃下静置1小时后，用dpbs清洗，在该培养基材上形成涂层。在添加在培养基中的情况下，以培养基中的最终浓度成为1.25μg/ml的范围的方式调整向培养基添加的各种层粘连蛋白量。在含有这些层粘连蛋白定着材料的培养环境下，进行以下实施例中的细胞培养。
[0231]
实施例2皮肤源性多能性前体细胞(skps)的制作
[0232]
(1)ips细胞的培养
[0233]
作为多能性干细胞，使用人源性ips细胞(克隆名：1231a3、从京都大学ips研究所cira购入)。其中，1231a3株为在非裔美国人(african american)女性的末梢血单核细胞中
使用附加型载体导入pce-hoct3/4、pce-hsk、pce-hul、pce-mp53dd和pcxb-ebna1而得到的ips细胞。ips细胞按照获得机构推荐的培养方法进行维持培养。即，作为人ips细胞用培养基，使用stemfit(注册商标)(ak02n、味之素(株))，在37℃下用5％co2的孵箱，按照sci.rep,4,2014,3594；doi:10.1038/srep03594中记载的方法培养细胞。作为定着材料用的层粘连蛋白片段，使用lm111e8、lm121e8、lm332e8、lm421e8、lm511e8和lm521e8(按照实施例1记载的步骤预先涂层于培养皿上)。
[0234]
(2)源自人ips细胞的神经嵴干(ncs)细胞的制备
[0235]
基于nature protocols,2010,5:688-701或cell reports,2013,3:1140-1152中记载的方法，使(1)中培养的ips细胞分化为ncs细胞。通过将该ips细胞在含有noggin(r&d systems公司制造、商品目录编号：6057-ng-100/cf、500ng/ml)和/或sb431542(tocris公司制造、商品目录编号：1614、10μm)的stemfit(注册商标)ak02n(添加剂c无添加)培养基中培养5天～2周，诱导向ncs细胞的分化。其中，作为分化诱导培养中的定着材料，在由ips细胞向ncs细胞分化诱导时不进行传代，因此，在ips细胞培养时，涂层的层粘连蛋白片段仍旧存在。
[0236]
(3)由ncs细胞向skps分化诱导
[0237]
利用含有b-27(商标)添加物(life technologies公司制造、商品目录编号：17504-044、2质量％)、egf(r&d systems公司制造、商品目录编号：336-eg-200、20ng/ml)、bfgf(wako公司制造、商品目录编号：064-04541、40ng/ml)、青霉素/链霉素(life technologies公司制造、商品目录编号：15140-122、50u、50μg/ml)和chir99021(cayman公司制造、商品目录编号：13122、3μm)的dmem/f12培养基(life technologies公司制造、商品目录编号：10565-018)，将(2)中制备的ncs细胞培养3～5天，诱导ncs细胞向skps分化。其中，作为分化诱导培养中的定着材料，在从ncs细胞向skps的分化诱导时不进行传代，因此，在ips细胞培养时，涂层的层粘连蛋白片段仍旧存在。接着，使用培养细胞分离/分散溶液(商品名：accutase、bd biosciences公司制造、商品目录编号：561527)，将分化为skps的细胞在无层粘连蛋白片段定着材料下进行传代培养，接着，在含有b-27(商标)添加物(2质量％)、egf(20ng/ml)、bfgf(40ng/ml)、青霉素/链霉素(life technologies公司制造、商品目录编号：15140-122、50u、50μg/ml)的dmem/f12培养基中进一步进行培养。
[0238]
(4)标记蛋白的表达
[0239]
对(3)中进行了分化诱导的细胞中的标记蛋白的表达进行了研究。对在层粘连蛋白存在下进行了分化诱导的传代培养后的细胞(ips-skps p1)，通过免疫组织荧光染色研究了skps所特有的标记蛋白(巢蛋白和纤维粘连蛋白)的表达。将细胞用d-pbs(-)清洗，用4％多聚甲醛固定15分钟。将固定的细胞用d-pbs(-)清洗后，以triton x-100(0.5质量％)的pbs溶液处理5分钟，再次用d-pbs(-)清洗后，用10％山羊血清(nichirei公司制造、商品目录编号：426041)在室温下封闭1小时。其后，用表2所示的一次抗体(室温、2小时)和二次抗体(室温、1小时)对细胞进行处理，用hoechst33258(同仁化学研究所制、商品目录编号：h341)进行核染色后，包埋于fluoromount g(southern biotech公司制造、商品目录编号：0100-01)，在荧光显微镜下观察标记蛋白的表达。
[0240]
[表2]
[0241][0242]
(5)结果
[0243]
将表示由ncs细胞向skps分化的诱导的显微镜照片示于图1。ips-ncs(图1、第1段)表示分化诱导开始之前的细胞的显微镜照片，ips-skps p0(图1、第2段)表示分化诱导4天后(传代前)的细胞的显微镜照片，ips-skps p1(图1、第3段)表示传代培养后的细胞的显微镜照片(倍数全部为40倍)。另外，在荧光显微镜下观察到所得到的细胞中的skps的标记蛋白(巢蛋白和纤维粘连蛋白)的表达。其中，通过同时进行的hoechst染色，确认在观察到标记表达的位置上存在活细胞(图1、第4段)(倍数全部为50倍)。如图1所示，在含有层粘连蛋白111、121、332、421、511和521的片段的培养环境下，观察到由nsc向skps的分化。特别是在层粘连蛋白111、332、421和511的片段的存在下，高效率地诱导向skps的分化。
[0244]
实施例3修饰层粘连蛋白片段存在下的skps的制作
[0245]
(1)skps的制作
[0246]
按照与实施例2的(1)～(3)同样的步骤，由ips细胞制备ncs细胞，由所得到的ncs细胞分化诱导skps。向skps分化诱导的培养基中的chir99021的浓度设为3μm。向skps分化诱导的培养期间设为4天。作为ips细胞的维持培养、向ncs细胞的分化诱导以及向skps的分化诱导中的定着材料用的层粘连蛋白片段，使用lm111e8、lm121e8、lm332e8、lm421e8、lm511e8和lm521e8、以及基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段p-lm111e8、p-lm121e8、p-lm332e8、p-lm421e8、p-lm511e8和p-lm521e8(均按照实施例1记载的步骤预先涂层于培养皿上)。进行了分化诱导的skps在无层粘连蛋白片段定着材料下进行传代培养。从ips细胞至得到skps的培养的总天数为9天。
[0247]
将显示(1)的步骤中得到的skps的显微镜照片示于图2。如图2所示，在基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段的存在下，与非修饰层粘连蛋白片段存在下的培养相比，可看到从nsc向skps的分化诱导效率的上升。
[0248]
(2)标记基因的表达
[0249]
对(1)中分化诱导的细胞中的标记基因的表达进行了研究。对在基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段(p-lm111e8)的存在下进行了分化诱导的细胞，通过pcr法研究了分化诱导后且传代培养前(ips-skps p0)以及传代培养后(ips-skps p1)的表3所示的标记基因的表达。表3所示的标记中的nestin(巢蛋白)基因、slug基因、sox9基因、dermo-1基因、bmp-4基因和wnt-5a基因为skps标记(nat cell biol,2004,6:1082-1093,stem cell,2005,23,:727-737)，versican(多功能蛋白聚糖)基因和cd133基因为毛乳头细胞标记(j dermatol sci,39,2005,147-154)。gapdh基因用作对照。
[0250]
使用rneasy mini kit(qiagen公司制造、商品目录编号：74104)从细胞样品中提取总rna。测定提取的总rna的浓度，使用一定量的总rna，利用high capacity rna-to-cdna kit(applied biosystems公司制造、商品目录编号：4387406)进行逆转录反应。将得到的
cdna样品1μl作为模板，使用表3所示的引物组，在50μl的体系中进行pcr反应。酶使用kod-plus-ver.2(tovobo公司制造、商品目录编号：kod-211)。pcr按照[94℃、2min
→
(98℃、10秒；63℃、30秒；68℃、30秒)
×
25～35个循环]的反应程序实施。使用1.5％琼脂糖凝胶(takara bio公司制造、商品目录编号：50071)/tbe缓冲剂(关东化学株式会社制造、商品目录编号：46510-78)，将反应液5μl以100v进行电泳。
[0251]
[表3]
[0252][0253]
将电泳的结果示于图3。如图3所示，在分化诱导后的细胞中检测出skps标记基因的表达。这些skps标记的大部分在p0和p1中表达没有变化，或在p1中表达增加。因此，确认(1)中进行了分化诱导的细胞为skps。
[0254]
(3)标记蛋白的表达
[0255]
对(1)中进行了分化诱导的细胞中的标记蛋白的表达进行了研究。对在基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段(p-lm111e8)的存在下进行了分化诱导的传代培养后的细胞(ips-skps p1)，按照与实施例2
[0256]
(4)同样的步骤，通过免疫组织荧光染色研究了skps所特有的标记蛋白(巢蛋白、纤维粘连蛋白和αsma)的表达。使用的一次抗体和二次抗体如表4所示。
[0257]
[表4]
[0258][0259]
将结果示于图4。其中，图4(a)、(b)和(c)为分别表示巢蛋白、纤维粘连蛋白和αsma
的表达的荧光显微镜照片。如图4所示，在几乎所有传代培养后的细胞中均可看到skps所特有的标记蛋白的表达。因此，确认(1)中进行了分化诱导的细胞为skps。
[0260]
实施例4由skps向组织细胞的分化诱导
[0261]
对在实施例3中得到的基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段(p-lm111e8)的存在下进行了分化诱导的传代培养后的skps，研究了向组织细胞的分化诱导能。
[0262]
(1)向脂肪细胞的分化诱导
[0263]
将传代培养后的skps以3
×
105cells播种于35mm直径培养皿。培养24小时后，更换为含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：i7018、0.45nm)、胰岛素(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：i3536、2.07μm)、地塞米松(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：d4902、100nm)、兔血清(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：r4505、15％)、青霉素/链霉素(life technologies公司制造、商品目录编号：15140-122、100u、100μg/ml)的mem培养基(life technologies公司制造、商品目录编号：42360-032)，进一步培养2周。其后，使用oil red o staining kit(sciencell research laboratories公司制造、商品目录编号：0843)，按照添加的说明书进行细胞的oil red o染色。
[0264]
(2)向骨细胞的分化诱导
[0265]
将传代培养后的skps以3
×
105cells播种于35mm直径培养皿。培养24小时后，更换为含有地塞米松(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：d4902、100nm)、β-甘油磷酸盐(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：g9422、10mm)、l-抗坏血酸-2-磷酸盐(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：a8960、50μm)、牛血清(hyclone公司制造、商品目录编号：sh30070.03、10质量％)、青霉素/链霉素(life technologies公司制造、商品目录编号：15140-122、100u、100μg/ml)的mem培养基(life technologies公司制造、商品目录编号：42360-032)，进一步培养2周。其后，使用alkaline phosphatasee substrate kit(vector laboratories公司制造、商品目录编号：sk-5300)，按照添加的说明书进行细胞的碱性磷酸酶染色。
[0266]
(3)向雪旺细胞的分化诱导
[0267]
将传代培养后的skps使用含有skps培养用培养基[2％b-27(商标)添加物(life technologies公司制造、商品目录编号：17504-044)、20ng/ml egf(r&d systems公司制造、商品目录编号：336-eg-200)、40ng/ml bfgf(wako公司制造、商品目录编号：064-04541)、50u青霉素、50μg/ml链霉素(life technologies公司制造、商品目录编号：15140-122)的dmem/f12培养基(life technologies公司制造、商品目录编号：10565-018)]，以4.8
×
104cells播种于用预先稀释了25倍的层粘连蛋白111(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：l4544)和0.1mg/ml多聚-l-赖氨酸(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：p4707)进行了涂层的培养皿(35mm直径培养皿)。培养24小时后，更换为含有5μm forskoline(sigma aldrich公司制造、商品目录编号：f3917)、50ng/ml heregulin-1β(peprotech公司制造、商品目录编号：100-03)、2％n2添加物(life technologies公司制造、商品目录编号：17502-048)、1％牛血清(hyclone公司制造、商品目录编号：sh30070.03e)的dmem/f12培养基(life technologies公司制造、商品目录编号：10565-018)，进一步培养2～3周。培养中，培养基每2～3天交换1次。将得到的细胞用d-pbs(-)清洗，用4％多聚甲醛固定15分钟。将固
定好的细胞用d-pbs(-)清洗后，以0.5％triton x-100的pbs溶液处理5分钟，再次用d-pbs(-)清洗后，用10％山羊血清(nichirei公司制造、商品目录编号：426041)在室温下封闭1小时。接着，用一次抗体(抗s100β抗体、sigma aldrich公司制造、商品目录编号：s2532、室温、2小时)和二次抗体(alexa fluor 488山羊抗小鼠igg(h l)、life technologies公司制造、商品目录编号：a11029、室温、1小时)对细胞进行处理。其后，用dapi(dojindo公司制造、商品目录编号：fk045)进行核染色后，包埋于fluoromount g(southern biotech公司制造、商品目录编号：0100-01)，在荧光显微镜下观察雪旺细胞所特有的标记蛋白(s100β)的表达。
[0268]
(4)显微镜观察
[0269]
将进行了染色的细胞的显微镜观察像示于图5。图5(a)中，观察到在细胞中被染色的脂质，显示skps分化为脂肪细胞。图5(b)中，可看到碱性磷酸酶阳性细胞，显示skps分化为骨细胞。图5(c)中，可看到s100β阳性细胞，显示skps分化为雪旺细胞。因此，确认实施例3中得到的细胞是可分化为脂肪细胞、骨细胞和雪旺细胞等神经胶质细胞的skps。
[0270]
实施例5无异源物条件下的skps的制作
[0271]
在与实施例2的(1)～(3)同样步骤的无异源物条件下，由ips细胞制备ncs细胞，由得到的ncs细胞分化诱导skps。作为无异源物试剂，使用noggin(sigma公司制造、商品目录编号：h66416-10ug、500ng/ml)、b-27(商标)添加物xenofree cts(life technologies公司制造、商品目录编号：a14867-01、2质量％)、egf(higeta酱油株式会社制造、商品目录编号：reg100ug、20ng/ml)、bfgf(reprocell公司制造、商品目录编号：rcheot005，006、40ng/ml)。向skps的分化诱导培养基中的chir99021的浓度设为3μm。向skps的分化诱导的培养期间设为4天。作为ips细胞的维持培养、向ncs细胞的分化诱导和向skps的分化诱导中的定着材料用的层粘连蛋白片段，使用lm111e8、lm511e8以及基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段p-lm111e8和p-lm511e8(均按照实施例1记载的步骤预先涂层于培养皿上)。
[0272]
将表示由得到的ncs细胞向skps的分化诱导的显微镜照片示于图6。ips-ncs(图6上)表示分化诱导开始之后的细胞的显微镜照片，ips-skps p0(图6中)表示分化诱导4天后(传代前)的细胞的显微镜照片，ips-skps p1(图6下)表示传代培养后的细胞的显微镜照片(倍数全部为40倍)。如图6所示，在层粘连蛋白片段和基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段的存在下，在无异源物条件下也可以进行向skps的分化。
[0273]
实施例6源自人ips细胞的神经嵴干(ncs)细胞的鉴定
[0274]
对在实施例2的(1)～(2)的步骤中得到的层粘连蛋白片段和基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段(lm111e8及p-lm111e8)的存在下进行了分化诱导的ncs的性质进行了研究。按照实施例2(2)的步骤，使用从向ncs细胞的分化培养之前(分化0天、0d)至8天培养后(8d)的细胞，按照与实施例3(2)同样的步骤，将cdna样品2μl作为模板，使用表5所示的引物及探针，在20μl的体系中进行了pcr反应。在pcr中使用taqman fast universal pcr master mix(applied biosystems公司制造、商品目录编号：4352042)。作为向ncs分化的指标，检测出神经生长因子受体(nerve growth factor receptor：p75)的基因表达。作为内部标准，使用rplp0。就基因表达的变化而言，基于按内部标准进行了标准化的表达量，作为将分化0天(0d)中的各基因的表达量设为1时的相对的表达量表示。
[0275]
[表5]
[0276]
基因名称引物
ribosomal protein lateral stalk subunit p0(rplp0)hs99999902_m1nerve growth factor receptor(p75)hs00609976_m1
[0277]
将结果示于图7。随着分化诱导的进行，可看到作为ncs细胞的标记基因的p75的表达上升。因此，可知在层粘连蛋白片段和修饰层粘连蛋白片段上可以进行向ncs细胞的分化诱导。
[0278]
实施例7在层粘连蛋白片段存在下的skps的分化诱导率
[0279]
按照与实施例3(1)同样的步骤进行skps分化诱导。作为定着材料用的层粘连蛋白片段，使用作为层粘连蛋白片段的lm111e8、lm121e8、lm332e8、lm421e8、lm511e8和lm521e8、以及作为基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段的p-lm111e8、p-lm121e8、p-lm332e8、p-lm421e8、p-lm511e8和p-lm521e8。将进行了分化诱导的skps(传代培养前：ips-skps p0)以同稀释率在48孔板中进行传代(ips-skps p1)。传代培养在无层粘连蛋白片段定着材料下进行。使用cell counting kit-8(dojindo laboratories、商品目录编号：347-07621)测定传代3天后的培养物的细胞数。在培养物中加入试剂盒的试剂溶液，在37℃下用5％co2的孵箱培养一定时间(1～3小时)之后，用酶标仪测定450nm的吸光度，由此评价培养物的呼吸活性(活细胞数)。
[0280]
将结果示于图8。对于所有种类的层粘连蛋白片段，与非修饰片段相比，使用基底膜蛋白聚糖修饰层粘连蛋白片段的分化诱导的细胞数在统计学上明显更多(t检验、p《0.0005)。