仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒的合成方法及其在新冠病毒肺炎中的应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒的合成方法及其在新冠病毒肺炎中的应用。


背景技术：

2.新冠病毒肺炎患者以发热、乏力、干咳为主要临床表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状，一般而言新冠肺炎是一种急性自限性疾病，重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征(ards)、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭。对于重型、危重型病例，即使血液净化及人工膜肺等脏器替代医疗技术已非常先进，但依然没能挽救大量危重症患者的生命，该病作为亟待解决的重大公共卫生事件急需寻找安全有效的治疗手段。
3.研究发现在首批确诊的重症感染者中，大量患者出现细胞因子风暴综合征(css)，即机体感染微生物后引起体液中多种炎性因子迅速大量产生的现象，导致靶器官如肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的弥漫性损伤，被认为是引起ards、脓毒症休克和多器官衰竭甚至死亡的重要原因。目前针对css尚无特效药，临床上多以糖皮质激素抑制全身免疫等非特异性治疗为主，效果往往欠佳，且后遗症严重。因此寻找尝试更安全有效的免疫调节方法来抑制css的发生发展对于新冠病毒肺炎治疗具有重大意义。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒。
5.本发明的第二个目的是提供上述巨噬细胞膜纳米载药颗粒的合成方法。
6.本发明的第三个目的是提供上述巨噬细胞膜纳米载药颗粒的应用。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒的合成方法，包括以下步骤：
9.s1、巨噬细胞膜提取；
10.s2、plga载药纳米内核的合成：加入聚(d,l-乳酸-co-乙醇酸)和药物混合，搅拌即得；所述药物为洛匹那韦和利托那韦；
11.s3、将s1的巨噬细胞膜和s2的plga载药纳米内核混合，超声后即得仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒；
12.其中，s1所述巨噬细胞膜和s2所述plga载药纳米的混合质量比为0.125～0.5:1。
13.巨噬细胞为新冠肺炎css始动细胞，病毒以及细胞因子首先刺激巨噬细胞释放细胞因子，这些细胞因子进一步活化包括巨噬细胞本身在内的免疫细胞，释放更多的炎症分子，从而引发炎症因子风暴。通过构建仿生巨噬细胞膜纳米载药系统，一方面巨噬细胞仿生纳米颗粒表面能够中和细胞因子，吸附新冠病毒，减少病毒感染，阻断css发生；另外其仿生
纳米颗粒内核包裹的抗病毒药物洛匹那韦/利托那韦，能够随纳米颗粒归巢到炎症部位，对病毒进行靶向杀伤。
14.优选的，上述合成方法中，s2所述聚(d,l-乳酸-co-乙醇酸)和药物的质量浓度比为10： 0.5～3。
15.优选的，上述合成方法中，s2所述洛匹那韦和利托那韦的质量浓度比为4：1。
16.作为一种优选的技术方案，上述合成方法中，s1巨噬细胞膜的提取包括以下步骤：
17.①
收集长至70％-80％融合的(约108个)thp-1细胞，1000g，5分钟离心，用1
×
pbs 洗3次，最终所得细胞沉淀用3ml低渗缓冲液重悬(1mmol/l nahco3、0.2mmol/l edta、 1mmol/l pmsf)；在4℃条件下裂解过夜；
18.②
取
①
中的细胞重悬液装入dounce杜恩斯匀浆机，将均浆机置于冰上，研磨细胞20次；
19.③
取
②
中的重悬液以3200
×
g，5分钟离心以清除大的碎片，收集上层清液；
20.④
取
③
中的上清液20000g，25分钟离心，丢弃沉淀，收集上层清液，100000g
×
35分钟离心，离心后，丢弃上层清液,收集白色沉淀(即细胞膜)，用500μl 1
×
pbs重悬；
21.⑤
取
④
中的重悬液检测膜蛋白含量。
22.作为一种优选的技术方案，上述合成方法中，s3具体操作包括以下步骤：
23.①
取一定质量的巨噬细胞膜材料和plga载药纳米内核不同比例混合并搅拌均匀；
24.②
将
①
中混合物100w水浴超声3min，既得仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒。
25.本发明上述仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒能够中和细胞因子，吸附新冠病毒，减少病毒感染，阻断css发生；另外其仿生纳米颗粒内核包裹的抗病毒药物洛匹那韦/利托那韦，能够随纳米颗粒归巢到炎症部位，对病毒进行靶向杀伤。
26.因此，本发明还提供一种用于治疗或/和预防新型冠状病毒肺炎的药物，包括所述方法得到的仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒。
27.本发明上述仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒能够阻断新冠假病毒感染的肺上皮细胞培养液活化巨噬细胞，因此，本发明还提供上述仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒在制备降低新型冠状病毒肺炎病人血清中的炎症因子的含量的药物中的应用。
28.本发明上述仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒能够阻断新冠病毒肺炎病人血清活化中性粒细胞，因此，本发明还提供上述仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒在制备阻断激活新型冠状病毒肺炎病人巨噬细胞的药物中的应用。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明提供了一种仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒的合成方法，包括以下步骤：s1、巨噬细胞膜提取；s2、plga载药纳米内核的合成：加入聚(d,l-乳酸-co-乙醇酸)和药物混合，搅拌即得；所述药物为洛匹那韦和利托那韦；s3、将s1的巨噬细胞膜和s2的plga载药纳米内核混合，超声后即得仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒；(1)其生物膜的表面能够增强纳米颗粒的生物隐蔽性，防止其在体内被迅速清除；(2)该载药颗粒能够中和对巨噬细胞膜有作用的多种细胞因子，阻断细胞因子风暴进程，在新冠肺炎治疗中起到免疫调理作用；(3)表面的含有丰富的趋化因子受体，能够携带药物在病变部位聚集，达到靶向用药效果；(4)表面的ace ii受体，能够靶向新冠病毒，一定程度上阻止病变部位扩增的病毒进一步感染宿主细胞。
31.本发明制备的仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒合成简单，原料为生物性膜和可降解的 plga，生物相容性高，适用于新冠肺炎临床病人综合性治疗，填补了新冠肺炎抗炎抗病毒纳米靶向药物治疗领域的空白。
附图说明
32.图1为plga@m在新型冠状病毒肺炎中的应用原理图；
33.图2为plga@m的表征，其中图2a为透射电镜图；图2b为粒径分布图；图2c为电位分布图；
34.图3为plga和膜蛋白的质量比对plga@m制备的影响；
35.图4为plga@m表面受体蛋白表征；
36.图5显示plga@m阻断新型冠状病毒感染的肺上皮细胞培养液活化巨噬细胞；
37.图6显示plga@m阻断新型冠状病人血清活化中性粒细胞。
具体实施方式
38.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
39.下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
40.实施例1plga@m的制备
41.包括以下步骤：
42.一、巨噬细胞膜提取
43.(1)收集长至70％-80％融合的(约108个)thp-1细胞，1000g，5分钟离心，用1
×
pbs 洗3次，最终所得细胞沉淀用3ml低渗缓冲液(1mmol/l nahco3、0.2mmol/l edta、1 mmol/l pmsf)重悬；在4℃条件下裂解过夜；
44.(2)取(1)中的细胞重悬液装入dounce杜恩斯匀浆机，将均浆机置于冰上，研磨细胞 20次；
45.(3)取(2)中的重悬液以3200
×
g，5分钟离心以清除大的碎片，收集上层清液；
46.(4)取(3)中的上清液20000g，25分钟离心，丢弃沉淀，收集上层清液，100000g
×
35 分钟离心，离心后，丢弃上层清液，收集白色沉淀(即细胞膜)，用500μl 1
×
pbs重悬；
47.(5)取(4)中的重悬液检测膜蛋白含量。
48.二、plga载药纳米内核的合成
49.(1)将洛匹那韦和利托那韦按照质量浓度比4:1溶于1ml丙酮中；
50.(2)往(1)中加入聚(d,l-乳酸-co-乙醇酸)，药物和聚(d,l-乳酸-co-乙醇酸)质量浓度比为3:10；
51.(3)将(2)中的混合液用1ml注射器快速打入高速旋转的3ml ddh2o中；
52.(4)将(3)中的混合液于搅拌器上自然蒸发4h(使丙酮完全蒸发)，则获得plga载药纳米内核。
53.三、plga@m的制备优化及评估
54.本发明仿生巨噬细胞纳米颗粒的构建体系的关键点在于plga纳米内核稳定支持其表面膜材料，发明人设置了不同的膜蛋白和plga质量比，通过检测其在1xpbs和水中的粒径，对比在不同质量比下的材料的稳定性，确定膜包裹plga最佳比例。
55.首先，发明人设置了不同的plga和膜蛋白质量比，plga：膜蛋白质量＝1:0、1:0.125、 1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、0:1，合成后，分别溶于水或1xpbs中，将在二者粒径中进行了对比(实验结果如图3所示)，单独的plga纳米内核在1xpbs中粒径较水中大，随着膜质量增加，膜附着在其表面趋向完整，到质量比1:0.5时，水粒径和pbs中的粒径相似，材料稳定性最高。当质量比大于1：0.5后，膜包plga在pbs中失去平衡，粒径再次变大。因此，本发明将plga：膜蛋白质量比＝1:0.5作为最佳的质量比。
56.四、仿生巨噬细胞膜纳米载药系统的合成
57.(1)取步骤一中的巨噬细胞膜提取物和步骤二中plga载药纳米内核液混合在一起(膜蛋白和plga纳米颗粒质量比为1：2)；
58.(2)将(1)中混合物100w水浴超声3min，即得仿生巨噬细胞膜纳米载药颗粒。
59.由图2a可见，合成的仿生巨噬细胞膜纳米颗粒在电镜下较为均一，粒径约为50nm左右，其纳米颗粒表面有明显的完整双分子层结构，证明其生物膜覆盖。单独的plga纳米颗粒水合粒径约为80nm，电位为-35mv，单独的膜囊泡95nm左右，电位为-15mv，膜包裹plga内核后，和单独膜相比水合粒径降低至90nm，电位降低到-20mv，侧面证明膜修饰在 plga纳米内核表面，膜包裹纳米颗粒制备较为完整(图2b，图2c所示)。
60.实施例2plga@m的膜受体蛋白及载药表征
61.为了验证本发明仿生巨噬细胞纳米颗粒的可行性，发明人对仿生巨噬细胞纳米颗粒表面膜蛋白及其相关受体蛋白进行了表征。发明人首先对仿生巨噬细胞纳米颗粒表面蛋白进行检测，通过蛋白电泳检测，实验结果显示，单独的plga内核没有蛋白条带，而仿生巨噬细胞纳米颗粒的条带和巨噬细胞膜囊泡以及巨噬细胞裂解液蛋白条带一致，进一步证明其表面覆盖的保存原有蛋白的巨噬细胞膜。与此同时，发明人对仿生巨噬细胞纳米颗粒il-6，il-1β细胞因子受体，以及新冠病毒进入细胞的ace ii受体进行了表征，实验结果如图4所示，仿生巨噬细胞膜纳米颗粒，及巨噬细胞膜囊泡都有明显的il-6，il-1-β，ace ii受体条带，由此证明了本发明利用仿生巨噬细胞膜中和细胞因子及病毒的原理的可行性。
62.实施例3plga@m降低新冠假病毒感染的肺上皮细胞培养液活化巨噬细胞作用
63.新冠病毒进入人体后，首先感染肺上皮细胞，感染的肺上皮细胞通过释放细胞因子招募并活化巨噬细胞，被活化的巨噬细胞进一步释放细胞因子，招募并活化更多的免疫细胞，从而导致炎症因子风暴。因此阻断感染的肺上皮细胞释放的细胞因子作用于巨噬细胞，对于减少新冠肺炎的炎症因子风暴具有实质性作用。本发明首先使用新冠假病毒在体外构建了肺上皮细胞病毒感染模型，通过收集其感染后释放的细胞因子培养液，模拟体内活化巨噬细胞系统，验证本发明的关键点——plga@m在新冠肺炎治疗中的抗炎作用。
64.实验过程如下：
65.(1)收集新冠假病毒感染的肺上皮细胞培养液
66.①
肺上皮细胞(a549细胞)铺板：将状态良好的a549细胞铺于12孔板中，5
×
105个细胞每孔；
67.②
新冠假病毒刺激a549细胞：往
①
中每孔加入1
×
106个新冠假病毒颗粒，37℃培
养箱共孵育，2h后，弃去上清更换成10％fbs dmem培养基，继续培养24h；
68.③
收集
②
孔上清，-30℃保存。
69.(2)plga@m阻断新冠假病毒感染的肺上皮细胞培养液活化巨噬细胞
70.①
plga@m处理新冠假病毒感染的肺上皮细胞培养液：将100ul新冠假病毒感染的肺上皮细胞培养液与700ug/ml的plga@m混合，每管加入10ul的pmsf防止蛋白降解，加入一定量含10％fbs的1
×
pbs，使每管终体积为210ul，37℃共孵育2h；
71.②
巨噬细胞(thp1细胞)铺板：将状态良好的thp1细胞铺于12孔板中，2
×
105个细胞每孔；
72.③
将
①
中的孵育液18000g离心15min取上清，加入
②
的thp1细胞孔板中共孵育24h；
73.④
收集
③
中thp1提rna，利用qpcr检测巨噬细胞il-6和il-1β细胞因子的mrna表达水平。
74.结果如图5所示，和未处理的培养液相比，plga@m处理组巨噬细胞表达的il-6及il-1β显著下降，抑制肺上皮细胞病毒感染培养液对于巨噬细胞的活化作用，揭示plga@m在新冠肺炎中用于抗炎治疗的潜力。
75.实施例4plga@m抑制新冠病人血清活化中性粒细胞
76.部分临床新冠病人血清含有大量炎性因子，可以持续激活机体免疫器官和血液细胞，造成血栓，器官损伤，免疫失调等。本发明对plga@m抑制临床新冠病人血清刺激中性粒细胞进行了分析评估。将健康人血清，新冠病人血清，plga@m处理后的新冠病人血清，分别刺激原代中性粒细胞，实验过程如下：
77.①
plga@m处理新冠血清：将50ul新冠病人血清与700ug/ml的plga@m混合，每管加入10ul的pmsf防止蛋白降解，37℃共孵育2h；
78.②
原代中性粒细胞铺板：将新鲜的原代中性粒细胞铺于24孔板中，每孔含有3
×
105个中性粒细胞，培养液体积400μl；
79.③
将
①
中的孵育液18000g离心15min取上清，加入
②
的中性粒细胞孔板中，补足培养基，使每孔培养液终体积为500μl，血清含量为10％；
80.④
待
③
中的中性粒细胞刺激4h后，使用中性粒心外陷阱(nets)核酸染料picogreen染色5min；
81.⑤
弃去
④
中picogreen染色液，1
×
pbs轻柔洗一遍，加入4％多聚甲醛固定10min；
82.⑥
弃去
⑤
中的固定液，换液成1
×
pbs，倒置荧光显微镜观察，ex/em＝480nm/520nm。
83.结果发现(图6)，新冠病人血清过度活化中性粒细胞，导致大量中性粒细胞死亡并产生大量nets，经plga@m处理后的新冠病人血清，活化程度明显下降，产生少量nets，效果接近健康人血清刺激。plga@m能够中和临床新冠病人血清炎性因子，发挥抗炎作用，由此表示本发明在新冠肺炎临床病人治疗中的可行性。