与油脂代谢调控相关的GmGRF5蛋白及其编码基因与应用的制作方法

与油脂代谢调控相关的gmgrf5蛋白及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及与油脂代谢调控相关的gmgrf5蛋白及其编码基因与应用。


背景技术：

2.人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位(表1)。
3.表1为世界上主要的产油作物
[0004][0005]
脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。
[0006]
植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰coa和丙二酰coa合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参与脂肪酸合成的酶以可溶的形式存在于质体的胞质中。
[0007]
大多数植物中，油脂都以三酰甘油(triacylglycerols，tag)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，tag的生物合成称之为kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除coa后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物pa。pa去磷酸化产生dag。在tag合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的dag 3
’-
oh位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerol acyltransferase，dgat)催化的，此反应被认为是tag生物合成中唯一的限速步骤。人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。然而，植物中，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍有不少未知。
[0008]
生长调节因子，growth-regulating-factor(grfs)，是一类植物特有的转录因子，在陆地植物中相对保守。已知grfs与grf互作因子，grf-interacting factors(gifs)，形成
复合物，行使转录调控功能。grfs的功能在拟南芥和水稻中研究的比较详尽，大豆grfs的研究相对滞后。一般认为，grfs与细胞增殖相关，其缺失突变体植株矮小、发育迟缓，叶变窄等等。近年来的研究发现，水稻osgrf4参与调控生长和碳、氮代谢。拟南芥中有9个grfs，拟南芥grf7能结合与耐非生物胁迫相关基因dreb2a的启动子，grf5促进叶绿体分化、光合作用和叶的寿命。目前尚未见报道此类蛋白参与植物油脂积累。


技术实现要素：

[0009]
本发明一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。
[0010]
本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在调控植物组织油脂含量中的应用；
[0011]
1)蛋白gmgrf5；
[0012]
2)编码蛋白gmgrf5的核酸分子；
[0013]
3)含有编码蛋白gmgrf5的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；
[0014]
上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015]
所述蛋白gmgrf5为如下(1)或(2)或(3)：
[0016]
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0017]
(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；
[0018]
(3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。
[0019]
上述应用中，所述编码蛋白gmgrf5的核酸分子是如下1)-3)中任一种的dna分子：
[0020]
1)编码区为序列表中序列1所示的dna分子；
[0021]
2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
[0022]
3)与1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
[0023]
上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2
×
ssc,0.1％sds和1
×
ssc,0.1％sds各洗膜一次。
[0024]
含有上述蛋白gmgrf5编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0025]
所述重组表达载体具体运用同源重组将序列表中序列1的自5’末端的第1-1038位脱氧核苷酸插入植物载体pgwb411，得到的pgwb411-gmgrf5。
[0026]
可用现有的植物表达载体构建含有gmgrf5基因的重组表达载体。
[0027]
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植
物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0028]
使用gmgrf5构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0029]
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0030]
携带有本发明gmgrf5的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等，也可以是双子叶植物，如大豆、烟草、拟南芥或棉花等。
[0031]
在本发明的实施例中，应用invitrogen公司生产的gateway系统的/gw/ta cloning试剂盒,入门载体topo和目的载体pgwb411都带有壮观霉素抗性标记，可高效筛选大肠杆菌，二者都有同源重组位点attl1和attl2，连有目的基因的载体topo与载体pgwb411在重组酶的作用下进行同源重组，构建植物表达载体pgwb411-gmgrf5。
[0032]
上述应用中，所述调控植物组织油脂含量为提高植物组织油脂含量。
[0033]
上述物质在培育组织高油脂含量植物或培育高油脂植物品种中的应用。
[0034]
上述物质在培育组织油脂含量提高的植物中的应用。
[0035]
上述应用中，所述组织为籽粒或种子，所述植物为双子叶植物；具体可以为大豆、百脉根、苜蓿、水黄皮、油菜、向日葵；在本发明的实施例中采用的是模式植物拟南芥。
[0036]
本发明另一个目的是提供一种培育组织油脂含量提高的转基因植物的方法。
[0037]
本发明提供的方法，为如下1)或2)：
[0038]
1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中蛋白gmgrf5的含量和/或活性，得到转基因植物；
[0039]
2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白gmgrf5的核酸分子的表达，得到转基因植物；
[0040]
所述转基因植物的组织油脂含量高于所述目的植物；
[0041]
所述蛋白gmgrf5为如下(1)或(2)或(3)：
[0042]
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0043]
(2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；
[0044]
(3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。
[0045]
上述方法中，所述提高目的植物中蛋白gmgrf5的含量和/或活性，或，所述提高目的植物中编码蛋白gmgrf5的核酸分子的表达，均是将所述编码蛋白gmgrf5的核酸分子导入所述目的植物中。
[0046]
上述油脂含量为总油脂含量。
[0047]
上述中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
[0048]
本发明的实验证明，本发明提供了一种与植物组织油脂含量相关的生长调控因子gmgrf5及其编码基因，在模式植物拟南芥过表达该转基因提高了种子中的油脂含量。说明生长调控因子gmgrf5及其编码基因可以正调控植物种子中油脂含量。该基因对提高和改良作物油脂成份、特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。
[0049]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
[0050]
图1为克隆载体结构示意图(a)和植物表达载体pgwb411
–
gmgrf5部分结构示意图(b)。
[0051]
图2为转gmgrf5纯系的分子鉴定。
[0052]
图3为转gmgrf5植株种子油脂含量。
具体实施方式
[0053]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0054]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055]
下述实施例中所用引物均由三博生物公司合成。
[0056]
大豆材料：大豆黑农44(hn44)记载在如下文献中：满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：cna20020216.2，审定号为：黑审豆2002003。
[0057]
表达载体pgwb411记载在如下文献中：department of molecular and functional genomics,shimane university,aatsue,shimane 690-8504,japan,e.mail:tnakagaw@life.shimane-u.ac.jp isuyoshi nakagawa,et al.,gatway vectors for plant transformation,plant biotechnology,2009,26,275-284。由tsuyoshi nakagawa博士提供，公众得到tsuyoshi nakagawa博士同意后可从中科院遗传与发育生物学研究所获得。
[0058]
农杆菌gv3101，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载在如下文献中：lee cw等，agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in arabidopsis thaliana,plant cell,2009,21(9),2948-62。
[0059]
实施例1、gmgrf5编码基因的cdna克隆
[0060]
提取黑农44幼苗的总rna，将rna用逆转录酶反转录合成cdna，用如下引物gmgrf5-f和gmgrf5-r进行pcr扩增,得到约1.0kb的pcr产物。
[0061]
引物序列：
[0062]
gmgrf5-f:atgatgagtgcaagtgcaagaaat
[0063]
gmgrf5-r:tcattcatcggtttggattctggagtt
[0064]
将上述pcr产物送去测序，该pcr产物为1038bp,具有序列表中序列1第1-1035位所示的核苷酸，该核苷酸所示的基因为gmgrf5，该基因编码的蛋白命名为gmgrf5，该蛋白包含345个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0065]
实施例2、转gmgrf5拟南芥的获得
[0066]
一、重组载体的制备
[0067]
重组载体pgwb411-gmgrf5为将序列表中序列1所示gmgrf5基因同源重组到pgwb411载体的重组位点attl1和attl2之间，且保持pgwb411载体的其他序列不变后得到的载体，其部分结构示意图如图1b所示。
[0068]
上述同源重组采用的试剂盒为invitrogen公司提供的gateway系统，载体3
′-
t突出端，用于直接连接taq酶扩增的pcr产物。
[0069]
具体如下：
[0070]
1)将实施例1制备的序列表中序列1所示gmgrf5基因的pcr产物通过ta连接在克隆载体/gw/topo(/gw/topo ta cloning kit，catalog number：k2500-20，invitogen corporation，carlsbad，ca，usa)上(图1a)，得到中间载体/gw/topo-gmgrf5；
[0071]
2)再将中间载体/gw/topo-gmgrf5与过表达载体pgwb411在重组酶的作用下进行lr重组反应，/gw/topo载体和过表达载体pgwb411上均带有重组位点attl1和attl2，因此，中间载体/gw/topo-gmgrf5与过表达载体pgwb411发生同源重组，最终目的基因成功构建到过表达载体pgwb411上，命名为pgwb411-gmgrf5(图1)。
[0072]
重组反应体系如下：1ul/gw/topo-gmgrf5，1ul pgwb411，1ul lr buffer，1ul lr enzyme mix，1ul te buffer ph8.0。25℃反应6h，加0.5ul蛋白酶k后，37℃反应10min，得到重组载体pgwb411-gmgrf5。
[0073]
二、重组农杆菌的获得
[0074]
将上述重组载体pgwb411-gmgrf5用电击法导入农杆菌gv3101,挑取重组农杆菌(提取质粒，gmgrf5-f和gmgrf5-r扩增验证阳性)，将该重组农杆菌命名为gv3101/gmgrf5。
[0075]
三、转gmgrf5拟南芥的获得及鉴定
[0076]
将上述重组农杆菌gv3101/gmgrf5培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0，以下称为野生型拟南芥)中,种子购自arabidopsis biological resource center(abrc)。经培育后收获种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/l)的ms筛选培养基上，待筛选得到的t1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获t1代单株，各单株种子分别播种，用相同的ms筛选培养基继续筛选以观察t2代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，获得9个过表达gmgrf5的t2代转gmgrf5拟南芥纯系。
[0077]
采用同样的方法将空载体pgwb411转入野生型拟南芥中，得到t2代转空载体拟南芥。
[0078]
提取上述t2代转gmgrf5拟南芥纯系oe2、oe20、oe25和oe3株系苗rna，反转录得到cdna作为模板，引物为：f:atgatgagtgcaagtgcaagaaat和r:ttcatcggtttggattctggagtt，进行real time-pcr鉴定。
[0079]
以拟南芥atactin2基因为内标，所用引物为primer-tf：5
’-
atgcccagaagtcttgttcc，和primer-tr：5
’-
tgctcatacggtcagcgata-3’。
[0080]
以t2代转空载体拟南芥和野生型拟南芥为对照。
[0081]
结果如图2所示，可以看出，与野生型拟南芥对照相比，oe2、oe20、oe25和oe3中gmgrf5的相对表达量分别约为0.065、0.052、0.105和0.015，对照中未能检测出gmgrf5的表达量。
[0082]
t2代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0083]
四、转gmgrf5拟南芥的表型分析
[0084]
测定野生型拟南芥(对照)、t2代转空载体拟南芥、t2代转gmgrf5拟南芥纯系oe2、oe20、oe25和oe3种子中总油脂含量，具体方法如下：
[0085]
彻底干燥待测籽粒，研磨成粉，取10mg加入螺口的2ml离心管中，每份样品平行称取四份。加入10μl的17:0脂肪酸(10mg/ml)做内标。加含体积百分含量2.5％浓硫酸的甲醇水溶液1ml，85℃水浴中保温1小时，期间晃动数次。自然冷却后，取上清500μl到新管中，加入600μl的0.9％nacl水溶液、300μl正己烷，震荡混匀几分钟，4000转离心10分钟，取上清至新管中。通风橱中过夜使正己烷挥发完全，然后加入50μl乙酸乙酯溶解甲酯化的脂肪酸。
[0086]
将上述获得的甲酯化的脂肪酸样品用气相色谱质谱联用仪测(perkin-elmer turbomass)各个组分的相对含量，然后各个成分的脂肪酸与加入的17:0内标比较得出相对含量，各个组分的含量相加，得到提取的脂类重量(具体方法参考：shen,b.,et al.,the homeobox gene glabra2 affects seed oil content in arabidopsis,plant mol.biol.,60,377-387,2006.)。
[0087]
总油脂量(％)的计算公式如下：总油脂量(％)＝提取的脂类重量/种子总重量
×
100％。
[0088]
提取的脂类重量为:上述各个脂肪酸相对含量之和。
[0089]
每个株系取30株的种子，实验重复三次，结果取平均值
±
标准差。
[0090]
结果如图3所示，野生型拟南芥籽粒总油脂量为39.1
±
1.5％；t2代转gmgrf5拟南芥纯系oe2、oe20、oe25和oe3种子总油脂量分别为42.5
±
2.5％、42.1
±
0.5％、42.3
±
0.2和41.8
±
1.4％；可以看出，4个转基因株系种子中的油脂含量明显高于对照。
[0091]
t2代转空载体拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。
[0092]
上述实验表明，大豆生长调控因子gmgrf5对种子中油脂的合成呈正调控作用，其编码基因gmgrf5的过量表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量。