一种α-淀粉酶基因amy1及其编码的蛋白与应用的制作方法

一种
α-淀粉酶基因amy1及其编码的蛋白与应用
技术领域
1.本发明属于酶学工程领域，具体涉及一种α-淀粉酶基因amy1及其编码的蛋白与应用。


背景技术：

2.环境以及资源问题是当今社会中人类所面临的最重要且严峻的危机之一。农业生产过程中所产生的固体废弃物，主要包括各种秸秆和规模化养殖所产生的畜禽粪便。各种农业废弃物的种类比较复杂，如果不经处理直接堆放到土壤上，会对土壤的稳定性和生产力产生不良影响。农村地区所产生的各种生活垃圾，如果得不到妥善有效的处理，会导致很多有害物质和致病原进入土壤中。农作物生长会通过根系吸收多种有害物质，很容易造成多种病害的传播蔓延，甚至因为生物放大严重危害人体健康。随着现代科技的不断发展，过去的农业固体废弃物技术已经不能够适应现阶段固体废物的实际处理。从长远角度出发，酶解法拥有低能耗、反应条件温和、环境友好等优点，使之逐渐成为各国研究人员关注热议的焦点。淀粉是是农业固体废弃物中的主要成分之一。
3.α-淀粉酶是酶制剂中应用很广的产品，应用历史早，产量大，约占酶制剂市场25％的比例，主要应用于纺织物退浆、啤酒和酒精生产、淀粉加工、食品加工、发酵工业、医药行业以及石油开采工业等方面。α-淀粉酶以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开α-1,4葡萄糖苷键，使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。目前在国内工业化生产上所使用的α-淀粉酶菌株大多数是野生菌株经过诱变得到的突变菌株。通常从自然界直接分离的α-淀粉酶野生型菌株产酶能力低下，不能满足工业生产的需要，因此如何获得具有较高产酶能力的菌株已成为当前解决淀粉酶制剂工业的关键。
4.为了解决这些问题，现部分研究者试图利用基因工程技术设计木霉菌株，以增加所需求的酶含量的比例，人工干涉控制从而取得预期的效果。随着基因工程技术的不断应用和发展，外源表达各类酶受到重视。重组蛋白表达系统主要有：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因植物或动物表达系统和体外翻译系统。但因为真核生物生长快、培养容易、遗传操作简单，同时还可以对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，酵母表达系统越来越受到重视和利用。其中巴斯德毕赤酵母表达系统是几年发展起来的较为完善的、应用最广泛的甲醇营养型酵母表达系统。
5.本专利通过构建重组毕赤酵母实现α-淀粉酶基因amy1的高效表达，对于提高农业固体废弃物的综合利用具有重要的意义，并为实际生产提供理论依据。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的第1个目的是提供一种α-淀粉酶基因amy1；
7.本发明的第2个目的是提供上述基因编码的蛋白；
8.本发明的第3个目的是提供含有上述α-淀粉酶基因amy1的重组表达载体；
9.本发明的第4个目的是提供含有上述上述α-淀粉酶基因amy1的基因工程菌；
10.本发明的第5个目的是提供上述α-淀粉酶基因amy1、蛋白、重组表达载体以及基因工程菌的应用。本发明实现了α-淀粉酶基因在毕赤酵母中的表达，构建优良的基因工程菌，更进一步促进成果的产业化，创造良好的社会效益和经济效益。
11.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
12.一种α-淀粉酶基因amy1，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
13.本发明还保护前文所述的α-淀粉酶基因amy1编码的蛋白，即α-淀粉酶amy1。
14.优选的，所述α-淀粉酶amy1的氨基酸序列如seq id no.2所示。
15.经测试，本发明的α-淀粉酶amy1的最佳水解温度为40℃，但是在30-50℃具有60-80％的酶活；α-淀粉酶amy1的最佳ph在7，但在ph6-8能维持90％的酶活。
16.本发明还保护含有前文所述的α-淀粉酶基因amy1的重组表达载体。
17.优选的，所述重组表达载体为重组质粒ppiczαa-amy1。
18.优选的，首先扩增获得α-淀粉酶基因amy1的编码区序列，接着运用双酶切和酶连的方法构建重组质粒ppiczαa-amy1。
19.具体的，以稻草堆肥样品为原料提取总rna，反转录获取α-淀粉酶基因amy1的cdna；以cdna为模板，利用pcr扩增法获得的amy1基因的完整序列；采用双酶切和酶连的方法，将完整的amy1基因插入到ppiczαa表达载体上，获得重组表达质粒ppiczαa-amy1。
20.本发明还保护含有前文所述的α-淀粉酶基因amy1的重组工程菌。所述工程菌可以为大肠杆菌、酵母、乳酸菌、乳杆菌等；优选为酵母，更优选为毕赤酵母。
21.具体的，将前文所述的重组质粒ppiczαa-amy1转化进入毕赤酵母，获得能表达前文所述的α-淀粉酶基因amy1的工程菌。
22.优选的，在诱导培养基条件下可以获得高产量的蛋白α-淀粉酶amy1。
23.具体的，选用前文所述的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组工程菌，再培养重组工程菌，诱导淀粉酶表达。
24.更具体的，采用电击转化法将重组表达质粒ppiczαa-amy1转化到毕赤酵母感受态中，筛选高效的工程菌转化子；工程菌经过液体发酵培养基诱导培养后，可大量分泌α-淀粉酶amy1，再回收及纯化即可。
25.本发明还保护前文所述的α-淀粉酶基因amy1、前文所述的蛋白、前文所述的重组表达载体在降解淀粉或其他糖原中的应用。
26.有益效果
27.本发明提供的一种α-淀粉酶基因amy1及其编码的蛋白与应用，与现有技术相比，具有如下有益效果：
28.(1)本发明实现了α-淀粉酶基因amy1在毕赤酵母中的表达，构建优良的基因工程菌，更进一步促进成果的产业化，创造良好的社会效益和经济效益；
29.(2)本发明的α-淀粉酶amy1的最佳水解温度为40℃，amy1水解可溶性淀粉每分钟产生的还原糖含量为0.55μg/ml；在30-50℃具有60-80％的酶活；α-淀粉酶amy1的最佳ph在7，但在ph6-8能维持90％的酶活，amy1水解可溶性淀粉每分钟可产生的还原糖含量最高值为0.78μg/ml；
30.(3)本发明是为全面提高淀粉的分解效率，通过合适的基因工程技术，建立一个效率高效化的重组蛋白表达系统，并获得该酶的基因工程菌株，通过提高α-淀粉酶活性从而
提高α-淀粉的降解，对于改善农业固体废弃物资源化利用具有重要意义。
附图说明
31.图1为不同温度对α-淀粉酶amy1的影响；
32.图2为不同ph对α-淀粉酶amy1的影响；
33.图3为α-淀粉酶amy1的热稳定性；
34.图4为不同金属离子对α-淀粉酶amy1的影响；其中，1：未加金属离子处理；2：co
2
3：fe
3
；4：ca
2
；5：k

；6：zn
2
；7：cu
2
；8：mg
2
；9：mn
2
；
35.图5为纯化的α-淀粉酶amy1的sds-page电泳图；其中，1为amy1粗酶液，2为纯化后的amy1。
具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
37.实施例1amy1基因的克隆与表达
38.1、表达质粒的构建
39.引物设计：根据α-淀粉酶基因已知的本体信号肽基因序列信息，与α-淀粉酶基因的表达载体上已知的不相同多克隆定位点以及基因特点相结合，设计在毕赤酵母中可以异源表达该基因的引物序列，序列见表1。
40.表1：在毕赤酵母中异源表达的α-淀粉酶基因amy1引物序列
[0041][0042]
采用qiagen公司trizol试剂，提取堆肥样品中的总rna，cdna第一链的合成采用rt-pcr试剂盒(takara公司提供)。以上述反转录合成的cdna为模板，以表1中的引物进行pcr扩增获得完整的amy1基因片段，测序后获得不含信号肽序列的amy1基因，pcr所用程序如表2所示。
[0043]
表2：pcr程序
[0044][0045][0046]
将amy1基因的dna胶块用eb染色10min后用水洗净，吸除水分干燥，在紫外灯照射
下切割下含amy1基因部分的胶块，转移至1.5ml离心管，称量胶块重量，并根据公式：1ml＝1g为一个凝胶体积，计算凝胶体积；
[0047]
添加与凝胶相同体积的binding buffer，于65℃条件下水浴至胶体完全融解；溶解完全后，把混合液分多次转移至带dna柱的离心管中，在12000rpm的转速下离心1min，将滤液弃去；在dna柱中加300μl的binding buffer，在12000rpm的转速下离心1min，将滤液弃去；在dna柱中加700μl的washer buffer，在12000rpm的转速下离心1min，将滤液弃去，重复此步骤一遍；在12000rpm的转速下空柱离心1min；将dna柱转移到新的1.5ml离心管中，加入35μl灭菌的ddh2o到dna柱基质上，室温静置2min，在12000rpm的转速下离心1min。
[0048]
2、转化与筛选
[0049]
毕赤酵母异源表达α-淀粉酶基因amy1分别与载体质粒进行限制性内切酶xbai和ecori分步双酶切操作，设计酶切总体系为20μl。总体系包括2μl的10x缓冲液，1μl的xbai，1μl的ecori，切胶回收清洁的目的基因6.75μl以及9.25μl的ddh2o。用对应的限制性内切酶对质粒ppiczαa与已回收的切胶cdna进行双酶切；使用pcr回收试剂盒对双酶切后的酶切产物进行清洁回收；对回收产物进行第二次酶切操作，方法依照之前设计的酶切反应总体系，酶切温度控制保持37℃；使用pcr回收试剂盒对再次双酶切后的酶切产物进行清洁回收。将克隆载体和双酶切产物α-淀粉酶基因amy1进行酶连操作，其中酶连反应体系参见表4，体系中基因片段与载体的摩尔比以10：1比例设计。
[0050]
表3：酶连反应体系
[0051][0052][0053]
100μl毕赤酵母感受态细胞和5μg线性化后的dna均匀混合，转至事先-20℃预冷的2mm灭菌电转杯中，在条件1500v，200ω，20μf下电转4-10ms。电转完成后立即在超净工作台上加入1ml在4℃冰箱中预冷的1m山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，不要有气泡产生，混匀后将混合液转移至2ml离心管中。摇床中30℃，100rpm条件下复苏1h。吸取100μl悬液涂布在含有100μg
·
ml-1
zeocin的ypds平板上，置于30℃培养箱中避光培养，至出现单菌落后可停止培养。从长出单菌落的培养基中选择适宜单菌落用于制备pcr反应模板。另外，pcr验证还需α-淀粉酶基因amy1引物的配合一同进行。
[0054]
3、产酶与电泳分析
[0055]
获取的酵母转化子单菌落接种至内含1l bmgy的2.5l锥形瓶中，在30℃、180rpm下振荡培养至od
600
为1.0左右后，定时每间隔24h向2.5l锥形瓶中加入培养基总体积1％体积(10ml)的甲醇诱导蛋白表达，培养5-7天。使用贝克曼离心机在4℃、10000rpm转速下离心
5min，弃去沉淀、收集上清液，获得粗酶液后测定粗酶液酶活，取部分粗酶液-80℃保存。在200μl离心管中将粗酶液和sds-page蛋白上样缓冲液以5：1的比例混合后摇匀，进行沸水浴5min进一步利用蛋白质电泳技术分析蛋白的产量与溶度。
[0056]
4、淀粉酶amy1的提取与纯化
[0057]
采用硫酸铵沉淀法，称取(nh4)2so4粉末，使用研磨机将(nh4)2so4研磨至更细的粉末状，便于溶解。其中，每100ml粗酶液添加52g(nh4)2so4粉末。在冰浴状态下，以少量多次的原则，将(nh4)2so4粉末缓慢加入粗酶液中，并不停搅拌，直至所有(nh4)2so4粉末溶解完全。放置4℃冰箱静置8-12h。混合液在4℃、10000rpm转速下离心10min以获取蛋白沉淀。将上清液倒净，使用ph 8的tris-hcl缓冲液重悬蛋白沉淀。本发明的α-淀粉酶基因带有组氨酸标签，由于ni柱中的镍离子可与含有组氨酸标签的蛋白结合，但其与咪唑有更强的亲和力。可将粗酶液先过ni柱，使其吸附在ni柱上，后再通过不同浓度的咪唑将其洗脱下来，从而达到纯化目的。
[0058]
实施例2不同条件对α-淀粉酶amy1的酶活特性的影响
[0059]
1、不同金属离子对α-淀粉酶amy1酶活力的影响
[0060]
在2ml离心管中加入100μl含1μm酶量的纯化后的稀释酶液、0.5％200μl可溶性淀粉、600μl磷酸缓冲液(ph 7.0)以及100μl浓度为100mm的不同金属离子溶液，不同金属离子为：co
2
，fe
3
，ca
2
，k

，zn
2
，cu
2
，mg
2
，mn
2
，混匀，40℃水浴处理1h，每个梯度处理设置三个重复实验。使用dns法测定酶活，用酶标仪测定od值。测定数据并做出图表分析。结果如图4所示，mn
2
对α-淀粉酶amy1的酶活有明显促进作用；fe
3
、zn
2
、cu
2
对α-淀粉酶amy1的酶活有明显抑制作用，fe
3
抑制作用最为显著。
[0061]
2、α-淀粉酶amy1对不同温度的响应
[0062]
在2ml离心管中加入100μl含1μm酶量的纯化后的稀释酶液、0.5％200μl可溶性淀粉溶液和700μl磷酸缓冲液(ph 7.0)，混匀，在不同温度下水浴处理1h，温度处理设定为：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。使用dns法测定酶活，用酶标仪测定od值，每种实验设计进行三次重复。测定数据并做出图表分析。结果如图1所示，α-淀粉酶amy1的最佳水解温度为40℃，但是在30-50℃具有60-80％的酶活；在50℃后酶活力急剧下降，在70℃时酶活力基本消失。
[0063]
3、α-淀粉酶amy1对不同ph的响应
[0064]
在2ml离心管中加入100μl含1μm酶量的纯化后的稀释酶液、0.5％200μl可溶性淀粉与700μl不同ph的缓冲液，不同ph缓冲液为：ph 4.0，5.0，6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液以及ph 7.0，8.0，9.0，10.0的tris-hcl缓冲液，混匀，40℃水浴处理1h，每个梯度处理设置三个重复实验。使用dns法测定酶活，用酶标仪测定od值，每种实验设计进行三次重复。测定数据并做出图表分析。结果如图2所示，α-淀粉酶amy1的最佳ph在7，但在ph6-8能维持90％的酶活；过酸和过碱条件下都会导致该酶活力急剧下降乃至失活。
[0065]
4、α-淀粉酶amy1热稳定性分析
[0066]
将酶液分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下水浴1h，在2ml离心管中加入0.5％200μl可溶性淀粉与700μl磷酸缓冲液(ph 7.0)，再分别加入100μl在各个温度下预热含1μm酶量的纯化后的稀释酶液，混匀，40℃水浴处理1h，每个梯度处理设置三个重复实验。使用dns法测定酶活，用酶标仪测定od值。测定数据并做出图表分析。结果如图3所示，α-淀
粉酶amy热稳定性不佳，在40-50℃的时候，热稳定性急剧下降。
[0067]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。