突变基因及其用途的制作方法

1.本发明属于基因工程领域。具体地，本发明涉及一种slc13a1突变基因。本发明还涉及该突变基因用于构建骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型的用途以及一种骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型的构建方法。


背景技术：

2.小型猪是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因、分子机制以及治疗方法的动物模型。巴马猪为我国特有的地方猪种，主要产自中国广西省，在外观上巴马猪表现为典型的“两头乌”特征，即头部和臀尾部毛发为黑色，而其他部分为白色。近年来，巴马猪因其具有体型较小以及解剖学结构与人类相近的优势，逐渐被广大科学工作者认定为是构建人类疾病医学研究的大动物模型的良好材料，故此具有极高的培育价值。
3.骨骼发育不良、短肢性侏儒症大多是由于硫酸盐代谢异常或硫酸酯酶表达失调所引起的。骨骼发育不良会导致个体产生各种疾病如骨质疏松、关节炎等。在畜牧业生产中，动物出现骨骼发育疾病会导致生产量下降，直接造成经济损失。骨骼发育对于畜牧业生产具有重要意义。
4.硫酸盐的吸收过程首先通过slc13a1硫酸盐转运蛋白转运进小肠或肾上皮细胞内，然后经过slc26a1转运进血液中运送至身体各处，满足机体需求。因此，slc13a1作为转运硫酸盐过程中的第一步，其作用至关重要。
5.现有的硫酸盐转运异常导致的骨骼发育不良模型为小鼠模型。这些小鼠模型能模拟一部分疾病表型和帮助研究病理机制，但是还存在一些不足。小鼠的骨骼发育与人类不尽相同，因此，在研究疾病病理上存在一些局限。所以，亟需在与人类生理结构相近的大型动物中构建该疾病的模型。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种小型猪的slc13a1突变基因。具有本发明所述突变基因的转基因家系小型猪的表型和遗传模式与骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症相符合，可以作为该人类遗传疾病的大动物模型，从而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。
7.一方面，本发明提供了一种小型猪的slc13a1突变基因，所述突变基因与野生型猪slc13a1基因相比，具有p.w47r的突变。
8.优选地，所述slc13a1突变基因的1-50位氨基酸序列如seq id no:27所示；
9.seq id no:27
10.mkvsyvlvyrrlllvvftllfllplpiilgtkeaecaytlfvvamfrlte
11.优选地，所述小型猪为巴马小型猪。
12.根据本发明所述的slc13a1突变基因，其中所述突变基因与野生型猪slc13a1基因相比，具有c.139t》a的突变；
13.优选地，所述slc13a1突变基因的第2号外显子的序列如seq id no:28所示:
14.seq id no:28
15.atgaaagtctcttatgttttagtttaccgccggcttctcttagtagttttcacactgttgtttttattgccattgccaatcatcctcggcaccaaggaagcagaatgtgcctacaccctcttcgttgttgccatgtttaggctgacagaa
16.另一方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包含所述slc13a1突变基因。
17.本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。优选地，所述重组细胞为猪细胞，更优选地为巴马小型猪细胞。
18.根据本发明的一个实施方案，所述重组动物细胞的基因组中具有编码突变型slc13a1的核酸序列，其中，与野生型slc13a1相比，所述突变型slc13a1蛋白发生错义突变，第47位色酰胺(trp)突变为精氨酸(arg)。
19.再另一方面，本发明提供了一种制备骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型的方法，所述方法包括：
20.改变小型猪的slc13a1基因，使slc13a1基因编码蛋白的第47位色酰胺(trp)突变为精氨酸(arg)。
21.在本发明的一些实施方案中，根据实际需要，利用基因工程技术，改变正常猪的slc13a1基因，使slc13a1基因编码蛋白的第47位色酰胺(trp)突变为精氨酸(arg)，或者使其基因的第139位碱基由t变为a，获得骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症猪模型。在另一些实施方案中，也可以利用基因工程技术改变除猪以外的其它动物的slc13a1基因的相应位点，从而获得所需的大型或小型骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症的动物模型，例如骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症猴模型，骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小鼠模型，等等。
22.本发明还提供一种筛选slc13a1基因突变的骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型的方法，所述方法包括以下步骤：
23.1)提取待测生物样品的核酸dna；
24.2)确定所述核酸dna的序列；
25.3)所述核酸的序列或其互补序列，与野生型slc13a1基因相比具有p.w47r突变，更优选地具有c.139t》a突变，所述突变是骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症的指示；
26.所述生物样品选自血液、皮肤、毛发和肌肉中的至少一种。
27.优选地，在步骤2)中，确定所述核酸的序列包括如下步骤：
28.以dna为模板，采用猪slc13a1基因的特异性引物，进行pcr，得到扩增产物，并对扩增产物进行测序。
29.优选地，所述正向引物(f)序列如seq id no:3所示，反向引物(r)序列如seq id no:4所示。
30.本发明还提供一种筛选slc13a1基因突变骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型的试剂盒，包括液态的或粉末状的猪slc13a1基因的特异性引物。所述试剂盒可以包括pcr所需的其它试剂，如缓冲液、dntp、聚合酶；还可以包括回收pcr产物所需的试剂和耗材，如溶胶液、收集管、洗涤液等。以待测样品的dna为模板，利用所述试剂盒和
本发明提供的筛选slc13a1基因突变骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症猪的方法进行检测，操作简便，能快速鉴别大量样品。
31.本发明还提供了本发明的突变基因、构建体、重组细胞或试剂盒在制备用于筛选治疗和/预防骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症的动物模型中的用途；优选地，所述动物模型为哺乳动物模型；更优选地，所述哺乳动物为小鼠、猴或小型猪。
32.为获得骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症的大型动物模型，本发明对巴马小型猪进行enu(n-乙基-n-亚硝基脲)化学诱变，向野生型雄性小型猪注射enu，得到f0代小型猪；然后将其与同品种的野生型雌性小型猪交配，获得f1代小型猪；将得到的f1代雄性小型猪与同品种的野生型雌性小型猪交配，获得f2代小型猪；所述的f1代雄性小型猪与f2代雌性小型猪交配，获得f3代小型猪，所述的f3代小型猪进行表型筛选，获得具有骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型的家系小型猪。
33.本发明的家系小型猪的骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症性状遗传模式符合常染色体单基因隐性遗传的孟德尔遗传定律。所述确定遗传模式是通过下述方法实现的：统计g3代中野生型个体和突变表型个体的数量，并进行比对，由于野生型：突变型比例约为3:1，符合孟德尔显性遗传3:1的分离定律；同时，在突变体中既有雌性与雄性的比例接近1:1，表明该突变表型与性别无关，从而确定所述突变表型是常染色体隐性遗传的。
34.在根据本发明的一个实施方案中，所述enu的注射剂量为50～100mg/kg；更优选地，所述enu的注射剂量为60～70mg/kg；进一步优选地，所述enu的注射剂量为65mg/kg。
35.在根据本发明的一个实施方案中，还包括：检测enu注射后的野生型雄性小型猪的精液品质，当注射后的野生型雄性小型猪的精液品质回复正常水平后，再使注射后的野生型雄性小型猪与同品种野生型雌性小型猪交配。
36.本发明的具有骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型的家系小型猪的表型筛选是通过表型观测实现；骨骼短小和软骨发育不全通过x光拍摄实现。
37.通过全基因组关联分析，确定了骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型的致病基因为slc13a1基因，对slc13a1基因的外显子及外显子边界全测序。结果显示，所述突变基因的突变位点位于第2号外显子，能够导致蛋白质发生错义突变。具体而言，所述突变基因导致第47位色酰胺(trp)突变为精氨酸(arg)。根据数据检索得知，slc13a1基因在人类、猴、猪、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠、大鼠等哺乳动物中十分保守，因此，利用本发明提供的slc13a1突变基因制备大型骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症猪模型，研究骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症的发病机理，对于临床预防、诊断和治疗骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症具有重大的指导意义。
38.本发明提供的带有slc13a1基因突变的小型猪，其表型与人类骨发育不全和软骨发育不全综合症十分相似，从而提供了一种非常好的动物模型，可用于病因病理研究，治疗方式研究及药物筛选。另外，本发明提供的方法避免了巴马猪与其他白色的猪种杂交，不会引入外源遗传信息，因而不会增加巴马猪遗传背景的复杂度，这有助于下一步纯化遗传背景和近交系的建立。
附图说明
39.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
40.图1为本发明的骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型的小型猪模型(19105)和野生型广西巴马小型猪(19107)的全身表型；
41.图2a为野生型广西巴马小型猪的基因型鉴定结果；
42.图2b为本发明的骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型的小型猪模型的基因型鉴定结果，箭头所示为基因编码区的突变位点；
43.图3为野生型广西巴马小型猪的骨骼和本发明的骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型的小型猪的骨骼的x射线照片。
具体实施方式
44.下面结合附图和实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
45.广西巴马小型猪购自第三军医大学，在中国科学院动物研究所北方大动物研究基地繁育。
46.enu(n-乙基-n-亚硝基脲)购自sigma(n8509 bulk package)。
47.实施例1骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症巴马小型猪遗传家系的建立
48.1)向15头广西巴马小型猪公猪注射enu，注射剂量为65mg/kg，注射频率为每周一次，连续三周。
49.2)精液品质检测
50.对诱变后公猪精液进行品质检测。检测指标包括公猪精液体积、精子密度、精子存活率和畸形率。在公猪精液品质回复到正常水平后，与野生型母猪交配，产生f1代。
51.3)将步骤2)所述的f1代雄性小型猪共147头分别与同品种的野生型雌性小型猪交配，获得f2代小型猪；
52.4)将步骤2)所述的f1代小型猪与步骤3)所述的f2代母猪交配，获得f3代小型猪,
53.5)对步骤4)所述的f3代小型猪进行表型筛选，获得具有骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型的家系小型猪
54.6)将步骤4)所述的f3代小型猪中野生型个体和突变型个体的数目进行统计，并进行比对，确定遗传模式；
55.具体地，统计f3代中野生型个体和突变表型个体的数量，并进行比对，由于野生型：突变型为38:12，比例约为3:1，符合孟德尔隐性遗传3:1的分离定律；同时，在突变体中雌性与雄性的比例为5:7，接近1:1，表明该突变表型与性别无关，从而确定所述突变表型是常染色体隐性遗传的。
56.如图1所示，为本发明的骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型和野生型广西巴马小型猪的全身表型；表型分析结果显示骨骼短小。野生型的广西巴马小型猪，其表型为两头乌。
57.实施例2骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症巴马小型猪遗传家系的基因突变定位
58.通过对f3代猪进行遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置，提取f3代猪耳组织的dna，并通过设计引物进行pcr反应，对pcr产物进行电泳分离，得到与slc13a1基因位点
紧密连锁的突变位点。
59.1.dna提取和质量检测
60.①
取适量耳组织装入1.5ml离心管，用小剪刀剪碎，加入500μl的snet溶液和10μl蛋白酶k，在摇床中55℃，200rmp震荡过夜消化；
61.②
待组织消化完全，12000rmp离心1min使毛发沉淀，将上清转移到新的1.5ml ep管；
62.③
加入500μl苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，在常温下震荡30min；
63.④
将溶液在12000rmp下离心15min，小心吸取200μl上清转移至新的离心管，避免中间蛋白层荡起；
64.⑤
在上清中加入200μl的异丙醇，轻轻上下颠倒约1min，12000rmp离心15min；
65.⑥
在离心管底部可见少量白色沉淀，倒掉溶液，注意不要倒掉沉淀，加入1ml 70％乙醇轻弹离心管底部使沉淀浮起；
66.⑦
12000rmp离心5min，保留dna沉淀，将乙醇吸出，室温晾干dna；
67.⑧
加入100μl te，静置10min，用枪轻轻吹打溶液使dna溶解；
68.⑨
使用nano drop对dna溶液进行浓度和质量检测，dna浓度应＞100ng/μl，a260/280在1.8-2.0之间，a260/230＞2；
69.⑩
将dna溶液稀释至100ng/μl，吸取2μl dna溶液混合1μl10
×
loading buffer，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，120v，20min。质量合格的dna样品应为主带清晰无断裂，无蛋白和rna污染。
70.2.引物设计
71.针对ncbi数据库中目标基因slc13a1基因的外显子的序列，利用primer5软件进行引物设计，设计好的引物序列(表1)送至invitrogen进行引物合成。
72.表1引物序列
[0073][0074]
3.pcr扩增
[0075]
使用天根2
×
taq pcr mix进行pcr，25μl体系
[0076][0077]
使用如下pcr扩增程序：
[0078]
在94℃下，预变性3min；94℃变性30s，50-65℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃温育10min。
[0079]
得到的pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中电泳检测产物，并用pcr产物纯化试剂盒去除引物二聚体，进行下步测序或酶切。
[0080]
4.测序
[0081]
将pcr产物用sanger法进行测序。
[0082]
如图2a和图2b所示，图2a为本发明的巴马小型猪模型的基因型鉴定结果，箭头所示为基因编码区的突变位点，而图2b为野生型广西巴马小型猪的基因型鉴定结果，箭头所示为与图2a所示的突变位点对应的正常基因位点。
[0083]
实施例3骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症巴马小型猪遗传家系的特征分析
[0084]
本发明的具有骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症小型猪模型是通过表型观测和x射线检测实现的。
[0085]
表型分析结果显示本发明的小型猪骨骼短小。
[0086]
x射线检测皮结果如图3所示，通过与野生型巴马小猪比较显示突变短腿猪组前肢和后肢的骨骼明显变短，表现出四肢短小的特征。
[0087]
实施例4骨骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症巴马小型猪遗传工程疾病动物模型制备
[0088]
通过crispr/cas9系统介导的高效遗传修饰，将slc13a1基因突变位点(p.w47r t》a(c.139t》a)靶向导入正常猪slc13a1基因相应序列，阳性猪表现为骼发育不良、软骨发育不全或短肢性侏儒症表型并呈隐性遗传。
[0089]
1.设计grna，以2号外显子为模板，设计可以打靶突变位点(p.w47r t》a(c.139t》a)附近序列的grna；
[0090]
2.体外切割实验鉴定步骤1中的grna打靶效率；
[0091]
3.将cas9质粒和步骤2中筛选到的grna质粒转染胎儿成纤维细胞之后，对阳性细胞进行筛选和鉴定。将筛选到的含有p.w47r t》a(c.139t》a突变的细胞进行扩繁和冻存；
[0092]
4.以步骤3中胎儿成纤维细胞作为核供体，进行体细胞核移植和胚胎移植，从而获得动物模型。
[0093]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通
过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。