一种原子力探针测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置与流程

1.本发明涉及一种原子力探针测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置，属于工程技术领域。


背景技术：

2.生命科学是本世纪的前沿领域之一，细胞是生命体的基本单位，在人体内有许多不同种类的细胞，每种细胞都有其独特的尺寸、形状、结构和功能。近年来的研究表明，细胞形状在细胞生长、分化、发育、死亡和肿瘤生长等许多生理过程中影响细胞的命运。因此，研究生物细胞的形貌将有助于人们更清晰、准确、全面的了解生物细胞的生理状态和过程，还可使人们更好的了解细胞群体中不同细胞的个体差异和一些特殊细胞的功能，对于揭示生命的奥秘具有重要意义。在对细胞的三维动态形貌的研究中，心肌细胞这种搏动的细胞则成为该领域的主要研究对象。研究这种搏动细胞的三维动态形貌对心脏可以有更深刻的了解。
3.随着纳米科技的飞速发展，超高分辨率、非侵入式的成像检测技术在生物、材料等科学领域中将发挥重要的作用。原子力显微镜(atomic force microscope，简称afm)的出现为观察活细胞表面超微结构提供了可能。afm利用一根集成到悬臂梁末端的尖锐针尖对样本进行光栅扫描来获取样本表面形貌。afm可以在溶液环境下工作且具有纳米级的空间分辨率,这种独特的优势使得其十分适合于研究活细胞表面纳米尺度的生理活动。应用afm研究自然状态下的生物样本(活细胞、天然态膜蛋白)给细胞生物学带来了大量新的认识，包括在纳米尺度理解细胞膜的组织和动态行为、观测细胞器的结构及活动，以及解析蛋白质分子的动态结构等。由于afm所具有的强大功能，afm已经成为细胞生物学的重要实验手段，是对传统光学显微镜、电子显微镜和x射线结晶术的重要补充。然而当前在搏动心肌细胞成像研究中主要采用光学成像，其成像分辨率低、精确度差，无法实现在纳米尺度上对样品性质的精细观察分析，不利于生物研究。扫描探针显微镜具备纳米甚至原子量级的实空间分辨能力，但传统的扫描探针显微镜技术仅能对固态样品表面特性进行观测，而无法得到活细胞样品信息。
4.在申请人之前的研究中张思微等人利用原子力纳米成像技术结合电生理特性测量方法、力学特性测量方法测量单个搏动心肌细胞搏动时的电生理特性及力学特性，测量获得新生乳鼠单个搏动心肌细胞动作电位，成功实现了两种测量模式(恒力跟踪测量模式、非恒力接触测量模式)下单个搏动心肌细胞动作电位和收缩力信号的记录，并以此实验为基础申请了名为一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法的专利，该专利无法精确测得细胞膜表面所有点的电生理特性及力学特性，无法实现单个搏动心肌细胞的三维动态形貌的测量，本发明介绍的测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置较现有测量方法，能够实现单个搏动心肌细胞搏动周期内细胞表面一点在任意时刻的空间位置和形貌，实现动态测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
(参见张思微.机器人纳米操纵活细胞及电学特性检测技术的研究[d].长春理工大学,2016)。
[0005]
在现代生物医学研究和应用中，往往需要对单个搏动心肌细胞进行三维动态成像。细胞形态可以体现细胞表面分子和细胞骨架及细胞器等信息，反映细胞的生理状态，因此对单个搏动心肌细胞进行成像观测和纳米结构的研究，有可能解决细胞功能、细胞个体与群体的生理行为、细胞变异及细胞通讯的生物化学、化学生物学和医学等悬而未决的问题。2007年齐浩等人基于afm研究细胞的最佳成像条件，通过对不同处理条件和测试条件下人肝癌细胞smmc-7721的afm图像的分析和研究，得到了在大气环境和溶液环境中肝癌smmc-7721细胞的最佳成像条件，同时建立了用afm观测活细胞的实验方法(参见齐浩,刘颖,庄乐南,朱杰,孙润广.细胞的原子力显微镜最佳成像条件研究[j].光子学报,2007)。2005年王莉娟等人应用afm分别对1％戊二醛轻微固化的cho细胞以及生理溶液环境中不同成像条件进行研究。实验结果表明选择弹性系数为0.06n/m的探针对生理环境下细胞进行扫描可获得较好效果，并且扫描速度以2-3hz为宜。为活细胞最佳成像条件提供部分依据(参见王莉娟,张英鸽,张飒等.原子力显微镜对生理溶液中活细胞成像条件的研究[j].电子显微报,2005)afm已达原子级和分子级的分辨能力，能在天然条件或生理条件下工作，可以动态观测细胞的生理活动，是当今最适合对单细胞进行成像观测的技术和方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种原子力探针测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置，根据原子力显微成像系统及其力反馈系统、闭环反馈系统获取原子力探针针尖与样品作用力的反馈信息，精确定位细胞位置，通过以恒定力单点按时间顺序多次采集模式确定单个搏动心肌细胞在搏动周期内细胞表面一点在任一时刻的空间位置和形貌，实现三维动态形貌的测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
[0007]
本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种原子力探针测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置，其特征在于：通过程序控制实现原子力探针与单个搏动心肌细胞表面以恒定力单点按时间顺序多次采集模式接触，确定单个搏动心肌细胞在搏动周期内细胞表面一点在任一时刻的空间位置和形貌，通过这种模式对单个搏动心肌细胞进行扫描，实现三维动态形貌的测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌，包括以下步骤：
[0008]
(1)控制纳米位移平台在x、y、z轴方向进行移动，寻找单个搏动心肌细胞，移动原子力探针、样品台以及原子力显微成像系统及其力反馈系统、闭环反馈系统，使得原子力探针精确定位到待测单个搏动心肌细胞上；
[0009]
(2)在光学显微镜下，观察单个搏动心肌细胞状态，移动原子力探针将其尖端放到待测的单个搏动心肌细胞的正上方；
[0010]
(3)设定测量参数，使得原子力探针和细胞表面接触采用恒定力单点按时间顺序多次采集模式，确定细胞表面一点在任意时刻的空间位置，通过这种采集模式对单个搏动心肌细胞进行扫描，实现三维动态形貌的测量，精确定位单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的位置和形貌，实现动态测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动
态形貌。
[0011]
所述原子力探针为氮化硅探针，微悬臂形状为三角形，针尖为圆锥形，针尖尖端半径为5-10nm，微悬臂弹性常数为0.2-0.4n/m，微悬臂长度为90-100μm。
[0012]
所述恒定力单点按时间顺序多次采集模式通过设定测量参数使原子力探针以恒定力在细胞表面一点按时间顺序对单个搏动心肌细胞在z轴上进行表面高度信息测量，从而获得单个搏动心肌细胞在搏动周期内细胞表面一点在任一时刻的空间位置，再移动到下一位置重复进行上面的操作，通过这种模式对单个搏动心肌细胞进行扫描，精确定位单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的位置和形貌，实现三维动态形貌的测量，具体包括以下步骤：
[0013]
(1)根据测量要求，设定以恒定力在细胞表面一点按时间顺序对单个搏动心肌细胞在z轴上进行表面高度信息测量，并给出在细胞表面一点测量次数的设定值；
[0014]
(2)通过闭环反馈系统判断在细胞表面一点测量次数是否达到设定值，若达到设定值，通过分析获得单个搏动心肌细胞在搏动周期内细胞表面一点在任一时刻的空间位置，并移动原子力探针至下一位置继续进行测量；
[0015]
(3)通过这种方式对单个搏动心肌细胞进行扫描，精确定位单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的空间位置，并分析获得单个搏动心肌细胞的三维动态形貌，实现三维动态形貌的测量。
[0016]
所述步骤(3)中的测量参数设定，设定原子力探针进针精度，具体实施方式为原子力探针粗进针以30nm的步长逐渐接近待测单个搏动心肌细胞，待针尖与单个搏动心肌细胞膜间距为5nm时，停止粗进针，同时启动原子力显微成像系统的恒定力单点按时间顺序多次采集模式，原子力探针以0.02nm的步长进行细进针，以恒定力按时间顺序多次采集模式实时跟踪测量单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的空间位置和形貌，实现三维动态形貌的测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
[0017]
所述步骤(3)中通过设定测量参数，根据原子力显微成像系统及其力反馈系统、闭环反馈系统，原子力探针与单个搏动心肌细胞之间以恒定力接触，当单个搏动心肌细胞收缩或舒张时，原子力探针跟随单个搏动心肌细胞在z轴方向进行移动，在单个搏动心肌细胞的博动周期内，原子力探针与单个搏动心肌细胞始终以恒定力按时间顺序多次采集模式接触，使得原子力探针与单个搏动心肌细胞膜表面的接触稳定，通过这种测量方法测量获得单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的空间位置和形貌，构建接触稳定的测量模式，实现三维动态形貌的精确测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
[0018]
压电陶瓷纳米位移平台控制器驱动压电陶瓷纳米位移平台上方的样品台在x、y、z轴方向进行移动，使得原子力探针针尖在样品表面移动时，原子力探针因针尖与单个搏动心肌细胞之间力的相互作用而使微悬臂产生形变,利用激光器把激光光束聚焦在原子力探针背面末端上，由此激光光束反射到四象限光电探测器上，由于原子力探针产生形变导致光斑在四象限光电探测器上产生偏移量，四象限光电探测器把光变化信号转换成电学信号，在力反馈系统中会将此电学信号当作反馈信号，作为内部的调整信号，并驱使压电陶瓷纳米位移平台做适当的移动，以使得样品与针尖之间保持恒定的作用力，从而形成调节作用力大小的系统称为力反馈系统。
[0019]
将测量获得的电学信号，经过四象限光电检测器电压采集模块进行采集、放大和
a/d转换器转换后传送到计算机终端控制系统，设定以恒定力在细胞表面一点按时间顺序对单个搏动心肌细胞在z轴上进行表面高度信息测量，且给出在细胞表面一点测量次数的设定值，并判断是否达到设定值，再将与设定值对比后的反馈信号发送到d/a数据转换器经转换后发传至压电陶瓷纳米位移平台控制器，调节压电陶瓷纳米位移平台上方的样品台在z轴方向进行移动，从而形成闭环参与控制的系统称为闭环反馈系统。
[0020]
本发明与现有方法和系统相比有以下优点：
[0021]
(1)光学成像的分辨率受衍射极限的限制，在测量时它的分辨率不可能小于入射光波长的一半，因此本发明介绍的测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置较光学成像而言，具有纳米级的空间分辨率、精确度好。能够实现在纳米尺度上对样品形貌的精细观察分析，有利于对细胞尺寸、形状、结构和功能的研究。
[0022]
(2)电子显微镜中样本必须在真空环境下观测，因此无法对活细胞进行观测。电子显微镜的电子对生物样品损伤极大，染料的保护则破坏了样品本身的形态。本发明介绍的测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置，可以在生理环境下对活体细胞进行高分辨率成像，成像分辨率已达到原子级和分子级。通过这种模式测量获得的样品形貌更加清晰，能够实现对活细胞进行无损测量，对样品的损伤程度大大减小。
[0023]
(3)本发明介绍的测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置与传统的原子力显微镜(afm)相比，能够精确定位细胞位置，在操作上具有高度灵活性，能够确定单个搏动心肌细胞搏动周期内细胞表面一点在任意时刻的空间位置和形貌，实现动态测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
[0024]
(4)在申请人之前的研究中张思微等人利用原子力纳米成像技术结合电生理特性测量方法、力学特性测量方法测量单个搏动心肌细胞搏动时的电生理特性及力学特性，并以此实验为基础申请了名为一种原子力显微镜测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法的专利，在该专利中采用恒力/非恒力跟踪模式测量单点处的电生理特性及力学特性，该专利无法精确测量获得细胞膜表面所有点的电生理特性及力学特性，无法实现单个搏动心肌细胞的三维动态形貌的测量，本发明介绍的测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置较现有测量方法，能够实现单个搏动心肌细胞搏动周期内细胞表面一点在任意时刻的空间位置和形貌，实现动态测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
附图说明
[0025]
图1为本发明使用原子力探针测量单个搏动心肌细胞三维动态形貌的方法及装置；
[0026]
图2为本发明原子力探针跟踪收缩状态下的单个搏动心肌细胞测量原理图；
[0027]
图3为本发明原子力探针跟踪舒张状态下的单个搏动心肌细胞测量原理图；
[0028]
图4为本发明原子力探针原理图，其中(a)为原子力探针的悬臂，(b)为原子力探针的针尖。
具体实施方式
[0029]
如图1所示，为本发明原理框图，其中原子力探针测量细胞模块1，包括原子力探
针、单个搏动心肌细胞、样品台、激光器和四象限光电检测器组成的光杠杆系统，压电陶瓷纳米位移平台2，四象限光电检测器电压采集模块3，包括信号放大器和a/d转换器，光学显微镜模块4，包括物镜，适配器和变焦镜头，d/a数据转换器5，压电陶瓷纳米位移平台控制器6，计算机终端控制系统7，样品形貌图像显示器8。
[0030]
计算机终端控制系统7控制压电陶瓷纳米位移平台2上方的样品台在x、y、z轴方向进行移动，寻找单个搏动心肌细胞，移动原子力探针、压电陶瓷纳米位移平台2、样品台以及根据力反馈系统，将原子力探针精确定位到目标压电陶瓷纳米位移平台2上方的样品台上的单个搏动心肌细胞上，通过光学显微镜模块4，调节适配器和变焦镜头从而清晰的观察单个搏动心肌细胞状态，移动原子力探针将其尖端放到待测单个搏动心肌细胞的正上方。在原子力探针测量细胞模块1中原子力探针作为一个能够检测微弱力探测传感器，当原子力探针针尖逼近单个搏动心肌细胞表面到数纳米，甚至更小时，原子力探针因针尖与单个搏动心肌细胞之间力的相互作用而产生形变，利用激光器把激光光束聚焦在原子力探针背面末端上，由此激光光束反射到四象限光电探测器上，由于原子力探针产生形变导致光斑在四象限光电探测器上产生偏移量，四象限光电探测器把光变化信号转换成电学信号，再经过四象限光电检测器电压采集模块3进行采集、放大和a/d转换器转换后传送到计算机终端控制系统7，根据测量要求，设定以恒定力在细胞表面一点按时间顺序对单个搏动心肌细胞在z轴上进行表面高度信息测量，并给出在细胞表面一点测量次数的设定值，并判断是否达到设定值，再通过闭环反馈系统将反馈信号发送到d/a数据转换器5经转换后发传至压电陶瓷纳米位移平台控制器6，调节压电陶瓷纳米位移平台2上方的样品台在z轴方向进行移动，若达到设定值，通过分析获得单个搏动心肌细胞在搏动周期内细胞表面一点在任一时刻的空间位置，并移动原子力探针至下一位置继续进行测量，通过这种方式对单个搏动心肌细胞进行扫描，精确定位单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的空间位置，并分析获得单个搏动心肌细胞的三维动态形貌，通过计算机终端控制系统7将全部测量数据传送至样品形貌图像显示器8上进行显示，从而实现三维动态形貌测量的系统称为原子力显微成像系统。
[0031]
如图2、3所示，为本发明原子力探针跟踪单个搏动心肌细胞搏动的原理图，其中，激光器11，四象限光电探测器12，原子力探针13，样品台14，为收缩状态下的单个搏动心肌细胞15，为舒张状态下的单个搏动心肌细胞16。原子力探针13作为一个能够检测微弱力探测传感器，当13原子力探针针尖逼近舒张状态下的单个搏动心肌细胞16或收缩状态下的单个搏动心肌细胞15表面到数纳米，甚至更小时，原子力探针13因针尖与舒张状态下的单个搏动心肌细胞16或收缩状态下的单个搏动心肌细胞15之间力的相互作用而产生形变。利用激光器11把激光光束聚焦在原子力探针13背面末端上，由此激光光束反射到四象限光电探测器12上，由于13原子力探针产生形变导致光斑在四象限光电探测器12上产生位移量，四象限光电探测器12把光变化信号转换成电学信号，再经过放大以及计算处理后，获得样品的形貌信息。
[0032]
如图1所示，本发明实现为：
[0033]
(1)控制压电陶瓷纳米位移平台2上方的样品台在x、y、z轴方向进行移动，寻找单个搏动心肌细胞，移动原子力探针1、压电陶瓷纳米位移平台2上方的样品台以及根据原子力显微成像系统及其力反馈系统、闭环反馈系统，将原子力探针1精确定位到目标压电陶瓷
纳米位移平台2上方的样品台的单个搏动心肌细胞上；
[0034]
(2)在光学显微镜模块5下，观察单个搏动心肌细胞状态，移动原子力探针1将其尖端放到待测单个搏动心肌细胞的正上方；
[0035]
(3)设定测量参数，使原子力探针1与单个搏动心肌细胞在恒定力单点按时间顺序多次采集模式下接触，以恒定力按时间顺序多次采集模式实时测量单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的空间位置和形貌，实现三维动态形貌的测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。
[0036]
如图4所示，为本发明采用的原子力探针为氮化硅探针，微悬臂形状为三角形，针尖为圆锥形，针尖尖端半径为7nm，微悬臂弹性常数为0.35n/m，微悬臂长度为95μm。原子力探针针尖设计为圆锥形可以用来在高湿度条件下用较小的力对细胞表面进行高分辨率地成像。对样品的破坏相对更小。因此采用此种探针能够减小探针在溶液中测量时的阻力，提高探针在溶液中测量时的移动速度，能够提高探针针尖与单个搏动心肌细胞的接触稳定性，提高成像精度，从而可以稳定的获得更为精确的单个搏动心肌细胞在搏动周期内任一时刻的空间位置和形貌，实现三维动态形貌的测量，从而在纳米尺度上获取单个搏动心肌细胞三维动态形貌。