基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法与流程

1.本发明属于单克隆抗体检测技术领域，具体涉及一种基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法。


背景技术：

2.单克隆抗体药物发展迅速，在肿瘤、免疫、血液等系统疾病领域应用日益广泛。单克隆抗体药物作为一种大分子蛋白，在生物体内的处置具有特殊性和复杂性，极大地增加了生物检测的难度，因此必须建立专属、灵敏、准确、可重复的测定分析方法。
3.特瑞普利单抗(toripalimab,js001，商品名拓益)是上海君实生物医药科技有限公司自主研发的首个获批上市的国产pd-1抑制剂，作为国内自主研发的创新药，在多种恶性肿瘤中显示出显著的疗效。根据相关报道，多剂量输注时观察到特瑞普利在体内的积累，血清药物谷浓度在大约连续5次给药后稳定下来；分别给予特瑞普利单抗1、3和10mg/kg后，其稳态谷浓度分别为(8.9
±
4.4)、(37.8
±
17.5)和(174.3
±
95.6)μg/ml。
4.目前，单抗药物常用的分析手段有免疫分析法和液相色谱-质谱联用技术(lc-ms/ms)等。免疫分析法为单抗药物分析的主流方法，其灵敏度可达ng级别，但其动态范围有限，易受内源或外源物质干扰，对样品的质量依赖性较强，影响定量的可靠性。同传统的免疫学相比，lc-ms/ms具有线性动态范围宽、抗干扰能力强、灵敏度高、准确度高、可进行多组分同时分析等优点，2020中国药理学会和中日友好医院共同发起并制定《抗肿瘤生物类似药治疗药物监测药学专家共识(2020版》，并推荐建立lc-ms/ms法测定单抗等生物类似药的血药浓度，制订适合患者的个体化给药方案，实现个体化药物治疗。但目前却未见有相关lc-ms/ms法测定特瑞普利单抗血药浓度方法的报道。


技术实现要素：

5.基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法，利用商品化的稳定同位素标记的通用单克隆抗体作为内标，并采用琼脂糖基质磁性微球实现人血清样品中的特瑞普利单抗的富集，酶解获得特征性肽段，通过内标法定量特征性肽段从而准确定量人血清中特瑞普利单抗的含量，具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强的优点。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法，使用同位素标记的单克隆抗体作为内标，先采用琼脂糖基质磁性微球富集人血清样品中的特瑞普利单克隆抗体，再酶解富集后的单克隆抗体以获得特征性肽段，最后使用液相色谱-质谱检测平台通过内标法定量特征性肽段从而准确定量人血清中特瑞普利单克隆抗体的含量。
8.根据以上方案，所述的基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法包括以下详细步骤：
9.步骤s1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；
10.步骤s2，按校准品溶液、质控品溶液、空白血清和待测样本的总数量分别取磁珠悬浮液并使用磷酸缓冲盐溶液清洗，并去掉清洗液；
11.步骤s3，分别向对应的磁珠中添加空白血清、系列浓度的校准品溶液、质控品溶液及待测样本，再加入内标工作液和磷酸缓冲盐溶液，室温孵育25-35min，孵育完成后使用磷酸缓冲盐溶液清洗孵育完的磁珠，去掉清洗液并分别收集磁珠；
12.步骤s4，往步骤s3中收集到的磁珠中加入碳酸氢铵溶液，95℃，反应5.0min；
13.步骤s5，再往步骤s4中的混合物中加入二硫苏糖醇溶液，100.0℃反应10.0min；
14.步骤s6，再往步骤s5中的混合物中加入碘乙酰胺溶液，室温避光反应30.0min；
15.步骤s7，再往步骤s6中的混合物中加入胰蛋白酶，37℃酶解2.5h，再加入甲酸水溶液终止酶解反应；
16.步骤s8，取步骤s7中的上清液进行lc-ms/ms分析。
17.根据以上方案，所述的步骤s1中配制系列浓度的校准品溶液是采用空白人血清配制系列浓度的特瑞普利单抗混合标准品溶液，浓度包括：2、5、25、50、100、200、300μg/ml。
18.根据以上方案，所述的步骤s1中配制质控品溶液是采用空白人血清配制低、中、高浓度的特瑞普利单抗混合质控品溶液，低、中、高浓度包括：6、80、250μg/ml。
19.根据以上方案，所述的步骤s1中配制内标工作液是采用0.1％甲酸水溶液配制内标工作液，内标工作液中含稳定同位素标记的通用单克隆抗体10μg/ml。
20.根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
21.流动相：a相：含0.1％甲酸的水溶液；b相：含0.1％甲酸的乙腈溶液；
22.洗脱梯度：
[0023][0024][0025]
柱温：40℃；检测时长：5.5min。
[0026]
根据以上方案，所述的质谱的离子源参数如下，离子源：电喷雾离子源；气帘气：35psi；碰撞气：10psi；喷雾毛细管电压：5500v；离子源温度：600℃；离子源雾化气：55psi；离子源加热辅助气：55psi。
[0027]
根据以上方案，所述的质谱的化合物mrm扫描参数如下：
[0028][0029]
采用esi离子源、正离子模式分段扫描分析。
[0030]
本发明的有益效果是：与传统的免疫方法相比，本方案只需取用30μl人血清就能够满足特瑞普利在人血清中血药浓度的检测。定量下限可低至2μg/ml，完全可以满足临床上的检测需要。依附于液相串联质谱平台，又具有特异性高、高通量、灵敏度高、抗干扰能力强的等诸多优点。
附图说明
[0031]
图1是特瑞普利的lloq(2μg/ml)色谱图。
[0032]
图2是特瑞普利的内标(silutmmab)色谱图。
[0033]
图3是特瑞普利的标准曲线。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行说明。
[0035]
本发明提供一种基于液相色谱-质谱检测血清中特瑞普利单抗的方法，使用同位素标记的单克隆抗体作为内标，先采用琼脂糖基质磁性微球富集人血清样品中的特瑞普利单克隆抗体，再酶解富集后的单克隆抗体以获得特征性肽段，最后使用液相色谱-质谱检测平台通过内标法定量特征性肽段从而准确定量人血清中特瑞普利单克隆抗体的含量，其包括以下详细步骤：
[0036]
步骤s1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；
[0037]
步骤s11，采用空白人血清配制系列浓度的特瑞普利单抗混合标准品溶液，包括：2、5、25、50、100、200、300μg/ml；
[0038]
步骤s12，采用空白人血清配制低、中、高浓度的特瑞普利单抗混合质控品溶液，包括：6、80、250μg/ml；
[0039]
步骤s13，采用0.1％甲酸水溶液配制内标工作液，含稳定同位素标记的通用单克隆抗体(silutmmab)10μg/ml；
[0040]
步骤s2，按校准品溶液、质控品溶液、空白血清和待测样本的总数量取1.5ml ep管，再分别取磁珠悬浮液于1.5ml ep管中，每个ep管添加12μl磁珠悬浮液，配合磁力架，每个ep管使用500μl磷酸缓冲盐溶液清洗磁珠2次，并去掉清洗液；
[0041]
步骤s3，分别向对应的含磁珠悬浮液的1.5ml ep管中添加30μl空白血清、系列浓度的校准品溶液、质控品溶液及待测样本，再加入20μl内标工作液和200μl磷酸缓冲盐溶
液，室温孵育30min，孵育完成后配合磁力架使用磷酸缓冲盐溶液清洗孵育完的磁珠2次，并去掉清洗液；
[0042]
步骤s4，往步骤s3中所有含磁珠ep管中各加入125.0μl 50.0mm碳酸氢铵溶液，95℃，反应5.0min。；
[0043]
步骤s5，再往步骤s4中所有含磁珠ep管中各加入12.0μl 135.0mm二硫苏糖醇溶液，100.0℃反应10.0min；
[0044]
步骤s6，再往步骤s5中所有含磁珠ep管中各加入18.0μl 250.0mm碘乙酰胺溶液，室温避光反应30.0min；
[0045]
步骤s7，再往步骤s6中所有含磁珠ep管中各加入1.875μg胰蛋白酶，37℃酶解2.5h，再加入3.0μl 10％甲酸水溶液终止酶解反应；
[0046]
步骤s8，取步骤s7中的上清液进行lc-ms/ms分析。
[0047]
其中，所述的液相色谱的条件如下：
[0048]
色谱柱型号：phenomenex jupiter proteo c12 5μm 2.0
×
150mm；
[0049]
柱温：40℃；
[0050]
检测时长：5.5min；
[0051]
进样量：10μl；
[0052]
洗脱梯度：
[0053]
时间(min)流速(ml/min)流动相a(％)流动相b(％)0.000.6090.010.00.500.6090.010.03.200.6057433.500.605.095.04.500.605.095.04.510.6090.010.05.500.6090.010.0
[0054]
流动相：a相：含0.1％甲酸的水溶液；b相：含0.1％甲酸的乙腈溶液。
[0055]
所述的质谱的离子源参数如下，
[0056]
离子源(ion soruce)turbo spray气帘气(curtain gas(cur))35psi碰撞气(collision gas(cad))10psi喷雾毛细管电压(ionspray voltage(is))5500v离子源温度(temperature(tem))600℃离子源雾化气(ion source gas1(gs1))55psi离子源加热辅助气(ion source gas2(gs2))55psi
[0057]
化合物mrm参数如下表所示：
[0058][0059]
采用esi离子源、正离子模式分段扫描分析。
[0060]
采用analyst软件采集数据并对色谱峰进行积分，计算，处理；以混合标准工作液中特瑞普利单抗和通用单克隆抗体峰面积比为纵坐标(y)，浓度为坐标(x)，用加权进行曲线回归运算，回归方程为：y＝ax b。将待测样品中的特瑞普利单抗和通用单克隆抗体面积比代入标准曲线方程，计算血清样品中特瑞普利单抗的浓度。
[0061]
采用内标法建立标准曲线，结果表明:
[0062]
特瑞普利在2-300μg/ml范围内线性关系良好，r2均大于0.99，定量下限及标准曲线示例如图1-3所示。
[0063]
三天验证的方法性能指标：
[0064][0065]
以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的相关技术人员应当理解：可以对本发明进行修改或者同等替换，但不脱离本发明精神和范围的任何修改和局部替换均应涵盖在本发明的权利要求范围内。