法匹拉韦在制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物治疗领域，具体涉及法匹拉韦在制备预防或治疗冠状病毒感染疾病药物中的应用。


背景技术：

2.1999年，法匹拉韦被首次报道。2014年3月，法匹拉韦(favipiravir)作为一种新型广谱抗rna病毒药物，在日本被批准上市，用于甲型、乙型流感的抗病毒治疗。
3.冠状病毒属于套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。
4.常见的人冠状病毒包括hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63和hcov-hku1四类，在全球，10％～30％的上呼吸道感染由上述四类冠状病毒引起，在造成普通感冒的病因中占第二位，仅次于鼻病毒。感染呈现季节性流行，每年春季和冬季为疾病高发期，潜伏期2-5天，人群普遍易感。
5.人冠状病毒hcov-229e是正链rna冠状病毒，在临床上除引起流鼻涕、头痛、咳嗽、咽喉痛、发热等上呼吸道疾病感染症状外；还会引起肺炎或支气管炎等下呼吸道疾病，胃肠道疾病及神经系统症状，尤其在心肺疾病患者、免疫力低下人群、婴儿和老年人中较为常见，研究表明，当hcov-229e感染肺部时，会释放促炎细胞因子，引起肺炎。但对于法匹拉韦用于治疗人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病，目前还没有这方面的报道，且对于无自主吸入能力的婴幼儿童及主动呼吸困难患者的问题，也没有特效的给药方式。


技术实现要素：

6.本发明旨提供一种法匹拉韦在治疗冠状病毒中的新用途，同时提供一种给药途径方便、剂量范围明确、给药量低且安全有效的药物应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.一种法匹拉韦在制备治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用；
9.所述冠状病毒感染性疾病为人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病；
10.所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病通过hcov-229e病毒感染balb/c类小鼠模型构建；
11.所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病包括：上呼吸道疾病感染疾病、下呼吸道疾病感染疾病、胃肠道疾病、神经系统疾病、肾炎和肝炎；所述上呼吸道感染疾病包括：普通感冒、病毒性咽炎和喉炎、疱疹性咽颊炎、咽结膜炎和扁桃体炎；所述下呼吸道感染疾病包括：支气管炎和肺炎；
12.预防或治疗冠状病毒感染性疾病药物是指含有法匹拉韦的药物制剂，具体为吸入制剂、注射剂、口服制剂或鼻喷剂；
13.所述吸入制剂的人日给药剂量包含法匹拉韦为27.3mg/60kg-272.7mg/60kg；
14.所述吸入制剂为法匹拉韦吸入溶液；
15.所述法匹拉韦吸入溶液，包含活性成分法匹拉韦、葡甲胺、渗透压调节剂和溶剂，所述溶液的ph为6-8；
16.优选地，所述法匹拉韦含量为1-50mg/ml；
17.优选地，所述葡甲胺的含量为3-110mg/ml；
18.优选地，所述渗透压调节剂选自氯化钠，其用量使所述吸入溶液的摩尔渗透压为270-330mosmol/kg；
19.优选地，所述溶剂为注射用水。
20.所述法匹拉韦吸入溶液的制备方法为：
21.向配液器中加入所需制备溶液总量80％的溶剂，加入处方量的法匹拉韦，搅拌至其充分分散于溶液中，逐量加入葡甲胺和氯化钠，搅拌至其充分溶解，用葡甲胺调节ph值至6-8，补加溶剂定容至处方总量，过滤，分装灌装。
22.法匹拉韦在人冠状病毒hcov-229e感染balb/c类小鼠模型中的应用的试验中，将法匹拉韦吸入溶液按0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml浓度给药10min；采用雾化方式进行小鼠给药，采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，检测药物法匹拉韦在小鼠肺指数及抑制率的有效性。
23.有益效果
24.通过人冠状病毒hcov-229e的小鼠治疗试验验证法匹拉韦的新用途，同时进行了法匹拉韦吸入溶液在治疗由hcov-229e病毒感染引起的肺炎的疗效试验，试验结果显示，法匹拉韦吸入溶液在对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺指数及抑制率中表现出了良好的药效，能降低小鼠肺指数。
具体实施方式
25.采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，从肺指数及抑制率2个方面评价法匹拉韦吸入溶液对人冠状病毒hcov-229e小鼠肺炎模型的治疗作用。
26.1试验材料
27.1.1受试药物
28.表1：法匹拉韦吸入溶液规格及批号
[0029][0030]
表2：法匹拉韦吸入溶液处方组成
[0031][0032][0033]
制备方法：
[0034]
向配液器中加入所需制备溶液总量80％的溶剂，加入处方量的法匹拉韦，搅拌至其充分分散于溶液中，逐量加入葡甲胺和氯化钠，搅拌至其充分溶解，用葡甲胺调节ph值至6-8，补加溶剂定容至处方总量，分别制得浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml的法匹拉韦吸入溶液。
[0035]
对上述批号200701、200702、200703、200704、200705、200706、200707、200708和200709制备的法匹拉韦吸入溶液，进行稳定性测定，冷藏(2-8液)，10天后测定结果见3。
[0036]
表3：法匹拉韦吸入溶液稳定性考察
[0037]
[0038]
由表3可知，制备的法匹拉韦吸入溶液冷藏放置10天后，性状、ph值及有关物质均无明显变化，即实施例中制备的法匹拉韦吸入溶液的稳定性较好。
[0039]
1.2阳性药物
[0040]
重组人干扰素α2b注射液，天津未名生物医药有限公司生产。批号：r0191201，生产日期2019.11.26，有效期至2021.11.25。规格300万iu/1ml，无色透明液体。用法用量：参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案第七版》推荐临床用法，500万iu/加入灭菌注射用水2ml，2次/日，雾化吸入。
[0041]
1.3实验动物
[0042]
表4：实验动物信息
[0043][0044]
1.4毒株及细胞
[0045]
1.4.1病毒毒株：人冠状病毒229e(hcov-229e)，由中国学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
[0046]
1.4.2细胞株：小鼠单核巨噬细胞raw264.7，购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室传代，液氮保存备用。
[0047]
1.5试验试剂
[0048]
试验试剂为乙醚，批号为20150417，国药集团化学试剂有限公司生产，用于小鼠麻醉。
[0049]
1.6试验仪器
[0050]
表5：试验仪器信息
[0051][0052]
2、试验方法
[0053]
2.1药物剂量设计及配制
[0054]
2.1.1重组人干扰素α2b注射液
[0055]
用法用量参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案第七版》推荐临床用法，500万iu/加入
灭菌注射用水2ml，2次/日，雾化吸入。即20万iu/kg/d。试验时小鼠采用440万iu/kg/d，相当于人用量的2倍。
[0056]
药液配制：经前期测量，每只小鼠10min吸入量为0.25ml，所以试验前用生理盐水将药物配制成26.4万iu/ml浓度的药液，按15g小鼠每次吸10min计时，1次/日，连续4天。
[0057]
2.1.2法匹拉韦吸入溶液规格
[0058]
法匹拉韦吸入溶液的日给药量为5.45mg/60kg-27.27mg/60kg，按照小鼠系数11和人体重60kg计算为批号200701、200702、200703、200704、200705、200706、200707、200708和200709中的9种规格。分别按照上述9种规格，雾化吸入给药10min，每日一次，一次5ml，连续4天。
[0059]
2.2病毒传代
[0060]
取已长成单层raw264.7细胞的25cm2培养瓶，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持液5ml，再加入hcov-229e病毒液200μl，置370 5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于病毒滴度测定。
[0061]
2.3病毒滴度测定
[0062]
取已长成单层raw264.7细胞的96孔板，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞3遍后，按10倍倍比(10-1
～10-8
)稀释接种不同滴度的hcov-229e病毒液，共8个稀释度，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。96孔板置37置、5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，并记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench法计算50％细胞病变浓度(tcid
50
)。
[0063]
2.4人冠状病毒肺炎小鼠模型构建及给药
[0064]
icr小鼠96只，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、干扰素α2b阳性药组、法匹拉韦0.5mg/ml组、法匹拉韦1mg/ml组、法匹拉韦2mg/ml组、法匹拉韦5mg/ml组、法匹拉韦10mg/ml组、法匹拉韦20mg/ml组、法匹拉韦40mg/ml组、法匹拉韦50mg/ml组和法匹拉韦60mg/ml组，共12组，每组8只，雌雄各半。除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，用100tcid
50
hcov-229e滴鼻感染，50μl/只。感染当天，各给药组雾化吸入，每次10min，每日1次，连续4天。末次给药后一天称量体重后，解剖取肺并称量肺重，计算肺指数和肺指数抑制率。
[0065]
2.5小鼠肺指数及抑制率计算
[0066]
小鼠称量体重后解剖取肺组织并称量肺重，计算小鼠肺指数及抑制率，具体计算公式如下：
[0067]
肺指数＝肺湿重(g)
×
100/体重(g)
[0068][0069]
2.6统计分析
[0070]
数据采用(mean
±
sd)表示，组间差异采用t检验，p《0.05为差异具有统计学意义。
[0071]
3实验结果
[0072]
表6受试药物对人冠状病毒肺炎小鼠模型的影响(肺指数及抑制率)
[0073][0074]
注：与正常对照组比较
##
p《0.01；与模型对照组比较
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0075]
表1结果显示：模型对照组小鼠肺指数显著增加，与正常对照组比较有显著性差异(p《0.01)；7种受试药物进行雾化吸入给药，每次10min，每天1次，连续4天后，结果如下：
[0076]
法匹拉韦吸入溶液：0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml七个规格组小鼠肺指数均降低，与模型对照组比较除0.5mgmg/ml均有显著性差异(p《0.05，p《0.01)，结合肺指数抑制率综合考量，60mg/ml时肺指数抑制率明显降低。因此，法匹拉韦吸入溶液的优选给药范围为1mg/ml-50mg/ml。