欧当归内酯A在制备治疗或预防阿尔茨海默病药物中的用途的制作方法

欧当归内酯a在制备治疗或预防阿尔茨海默病药物中的用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及预防或治疗阿尔茨海默病的药物，特别涉及含有欧当归内酯a (levistolide a 或diligustilide, 下文简称la)在制备治疗或预防阿尔茨海默病药物中的用途。


背景技术：

2.阿尔茨海默病（alzheimer's disease，ad）主要发生在老年人群，是以认知能力减退和进行性痴呆为主要临床特征的神经退行性疾病。随着全球人口老龄化的不断加快，ad发病率呈逐年上升趋势。ad病程长，且进展缓慢，严重困扰患者的生活，给家庭和社会均带来沉重的负担。ad主要病理特点包括致病蛋白β-淀粉样蛋白(β-amyloid，aβ) 沉积、tau蛋白过度磷酸化导致神经纤维缠结 (neurofibrillary tangles，nfts) 以及进行性突触功能异常和神经元丢失等。临床上使用的治疗药物主要包括乙酰胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、加兰他敏和石杉碱甲），和改善代谢、微循环药物（银杏叶制剂、灯盏花素、神经节苷脂、奥拉西坦）等，临床使用效果均不理想，目前尚缺乏能够治疗或治愈ad患者的临床药物。因此，寻找抑制和干预ad发生发展的有效治疗手段，将对整个社会特别是我国的医疗卫生及全民健康事业具有重要的意义。
3.appswe/ps1de9（app/ps1）转基因小鼠（ad模型小鼠）过表达突变的人类早老素（deltae9）和人淀粉样蛋白前体蛋白（appswe）基因，该小鼠脑内炎症因子被明显激活，6-7月龄小鼠脑内会形成aβ沉积，被广泛应用于阿尔茨海默病的基础和临床研究中，是目前公认的ad研究动物模型。小鼠的基因组与人类基因组有很高的同源性，组织器官结构和细胞功能与人类相近，因此小鼠模型被广泛应用来研究人类疾病治疗和预防的药物。
4.化合物la(中文名：欧当归内酯a；英文名：levistolide a 或diligustilide）主要分离自伞形科植物当归、川芎和辽藁本中，也可以通过藁本内酯为原料采用有机合成方法获得。研究表明，la具有抗肿瘤和胃粘膜保护等作用。
5.而关于la作用于ad模型小鼠，改善模型动物记忆缺陷和认知障碍，缓解和治疗ad作用未见报道。


技术实现要素：

6.本发明人在研究中意外地发现，la可以作用于预防和治疗ad。la减少appswe/ps1de9（app/ps1）转基因小鼠（ad模型小鼠）aβ聚集和沉积，改善脑组织的病理学变化，缓解app/ps1小鼠记忆缺陷和认知障碍，增强学习记忆能力。证明了la可用于预防和治疗ad疾病，从而完成了本发明。
7.因此，本发明包括以下方面：本发明提供一种药物组合物，该组合物以下列结构式表示的化合物为活性成分：
本发明中所述la可以中药提取物的形式添加，所述中药提取物含有la的重量百分比为15%至99.9%。所述的中药为当归和/或川芎。
8.本发明还提供所述结构通式表示的化合物在制备药物中的用途，所述药物能增强ad 患者的学习记忆能力，改善ad患者的记忆缺陷和认知障碍，延缓ad进程。
9.本发明还提供结构式la表示的化合物在制备药物中的用途，其中，所述药物用于治疗ad疾病。
10.另外，本发明还提供一种治疗疾病的方法，该方法包括给患者施用所述的药物组合物，该药物组合物中的活性成分能改善ad症状。
附图说明
11.图1化合物la的1h nmr (600 mhz, cdcl3)图谱。
12.图2化合物la的1h nmr (600 mhz, cdcl3)图谱低场放大图。
13.图3化合物la的1h nmr (600 mhz, cdcl3)图谱高场放大图。
14.图4化合物la的
13
c nmr (600 mhz, cdcl3)图谱。
15.图5化合物la的
13
c nmr (600 mhz, cdcl3)图谱低场放大图。
16.图6化合物la的
13
c nmr (600 mhz, cdcl3)图谱高场放大图。
17.图7化合物la的esi-ms图谱。
18.图8la改善app/ps1小鼠记忆缺陷和认知障碍。6月龄app/ps1转基因小鼠平均分成两组，每组6只。药物处理组(la)腹腔注射la 2 mg/kg，隔日给药一次，连续4个月。对照组（veh）腹腔注射空白溶剂60% 1,2-丙二醇。(a) 给药组和空白对照组小鼠絮窝实验评分统计结果。(b) 两组小鼠在隐藏平台和可视平台中的逃避潜伏期。 (c) 两组小鼠在隐藏平台和可视平台中的逃跑路径长度。(d) 空间探索实验，两组小鼠在一分钟内穿越原平台位置的次数。
19.图9la能够减少app/ps1小鼠大脑内的aβ沉积。 (a-b) app/ps1转基因小鼠脑内aβ斑块免疫组化染色的定量分析。(c-d) app/ps1转基因小鼠大脑皮层aβ聚合物的表达水平。
具体实施方式
20.以下结合附图及实施例详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围包括但是不限于此。
21.本发明提供了la在预防或治疗阿尔茨海默病的实验依据。
22.本发明提供了la在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。本发明含有la的药物组合物中，作为活性成分的la化合物的使用剂量为50微克/公斤体重至10毫克/公斤体重，所述组合物可以任何制剂形式存在，例如可以为口服制剂也可以是注射制剂。
23.根据本发明的实验结果并结合现有技术，可以推论本发明的la化合物符合上述关系，即预防或治疗阿尔茨海默病。
24.1、记忆减退和认知功能障碍是ad最显著的特征，临床表现为学习记忆能力下降、情感障碍和行为失常等。絮窝试验和morris水迷宫（morriswatermaze, mwm）实验是评价ad模型动物（app/ps1转基因小鼠）学习记忆和认知障碍最常用的研究手段。絮窝试验可以反映模型动物非陈述性记忆能力和社会行为能力。morris水迷宫实验主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力，被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、和新药开发等研究。本发明通过实验证明了ad模型小鼠应用la治疗后能够明显修复ad小鼠的社会行为学损伤，显著提高空间学习和记忆能力。
25.2、β淀粉样蛋白沉积形成的老年斑是ad发生的主要病理学特症。aβ可以分为单体、寡聚体和纤维，其中寡聚体aβ (aβ oligomers)是导致ad中认知功能障碍和神经退变的主要因素。本发明通过实验证明了la治疗ad模型小鼠后能够减少小鼠脑组织aβ斑块数量和面积，下调aβ寡聚体水平。因此，la能够明显改善ad病理学症状。
26.本发明通过下列实验证实了la的上述作用。
27.制备例1.川芎饮片5千克（kg）粉碎，用95%乙醇，回流提取三次，每次提取时间分别为2小时（h），1.5 h，1.5 h，每次15升（l）。三次乙醇提取液合并，45摄氏度（℃）减压浓缩，得棕褐色粘稠状浸膏约1.3 kg。所得浸膏加水搅拌捏溶至2.5 l，分别用2.5 l乙酸乙酯萃取3次。合并乙酸乙酯萃取液，45℃减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位230克（g）。再经硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯100：1，10：1，4：1梯度洗脱），sephadex lh20（甲醇洗脱）获得化合物la。通过核磁共振氢谱(图1-图3)、碳谱 (图4-图6) 和esi质谱(图7)等方法鉴定，并与文献对照，确定所分离得到的la为欧当归内酯a (英文名：levistolide a 或diligustilide)纯品。
28.欧当归内酯a，白色粉末。1h nmr (600 mhz, cdcl3) δ ppm: 0.92 (3h, t, j = 7.4 hz, h-11
′
), 0.93 (3h, t, j = 7.4 hz, h-11), 1.30 (1h, m, h-5
′
a), 1.40 (1h, m, h-4
′
a), 1.44 (2h, m, h-10), 1.45 (2h, m, h-10
′
), 1.53 (1h, m, h-5a), 1.88 (1h, m, h-5
′
b), 1.93 (1h, m, h-5b), 2.03 (1h, m, h-4
′
b), 2.08 (1h, m, h-4a), 2.18 (2h, m, h-9
′
), 2.21 (1h, m, h-4b), 2.29 (2h, q, j = 7.8, h-9), 2.55 (1h, t, j = 7.9 hz, h-6), 2.99 (1h, m, h-6
′
), 3.25 (1h, d, j = 8.8 hz, h-7), 5.00 (1h, t, j = 7.5 hz, h-8
′
), 5.07 (1h, t, j = 7.9 hz, h-8), 7.35 (1h, d, j = 6.5 hz, h-7
′
)
13
c nmr (150 mhz, cdcl3) δ: 168.48 (c-1), 164.92 (c-1
′
), 155.00 (c-3a), 150.42 (c-3
′
), 147.97 (c-3), 142.07 (c-7
′
), 134.15 (c-7
′
a), 126.51 (c-7a), 112.19 (c-8), 108.63 (c-8
′
), 47.57 (c-3
′
a), 41.54 (c-6
′
), 41.44 (c-7
′
), 38.29 (c-6), 31.02 (c-4
′
), 28.94 (c-5), 27.98 (c-9), 27.46 (c-9
′
), 25.75 (c-5
′
), 22.32 (c-10), 22.27 (c-10
′
), 19.73 (c-4), 13.97 (c-11), 13.85 (c-11
′
).esi ms m/z:：[m h]
381.3, [m na]
403.3 (化合物分子式：c
24h28
o4)。
[0029] 将以上制备的化合物进行app/ps1转基因小鼠动物模型的体内实验，以测定药效。在下述实验例中，6月龄app/ps1转基因小鼠按照2 mg/kg剂量给药，隔日注射一次，连续给药4个月。在下述实验中使用的la纯品由制备例1获得。
[0030]
实验例1.la对6月龄app/ps1转基因小鼠行为学改善作用考察1.实验材料和方法1.1.供试品溶液制备：la纯品1.00 mg溶于100 ul 乙醇中制成储备液，取该储备液加入60%丙二醇水溶液配制成合适浓度的la供试品溶液。取相同体积的乙醇，加入60%丙二醇水溶液中配制成空白溶剂。每次使用前按上述方法配制。
[0031]
1.2.实验动物和方法1.2.1. app/ps1小鼠分组及给药6月龄app/ps1转基因雌性小鼠平均分成2组，每组6只。给药方式：给药组按照2 mg/kg剂量腹腔注射la。对照组腹腔注射空白溶剂，频率为隔天一次，连续注射4个月。
[0032]
1.2.2.絮窝实验给药结束前三周，将每个小鼠放入一只笼子中，絮窝实验开始前，使用玉米芯垫料饲养小鼠一周。絮窝实验持续一周，第一天，在每个笼子中放入8片5 cm
×
5 cm的a4纸以供小鼠絮窝，随后每天固定时间范围内观察小鼠的絮窝情况并拍照，对小鼠的絮窝能力按照4分评价系统进行评价并统计。4分评价系统：1分，纸片没有可观察到的撕咬情况，并且没有明确可辨的絮窝位置；2分，纸片没有可观察到的撕咬情况，但有明确可辨的絮窝位置；3分，纸片有部分可观察到的撕咬情况，并且有明确可辨的絮窝位置；4分，纸片有大量可观察到的撕咬情况，并且有明确可辨的絮窝位置。
[0033]
1.2.3. morris水迷宫实验给药结束前一周，实验使用的水迷宫直径为120 cm，高50 cm的圆形水池，水深30 cm。根据东、南、西、北将水池分为4个象限，水池壁上沿等距离放置四个白色标记点。在池中某一象限中央放一个顶部直径为8 cm，高29 cm的圆形平台。在水迷宫正上方安置数字摄像机与计算机相连，视野覆盖整个水池。实验在隔音、人工照明房间内进行，实验水温控制在22～25 ℃，每日更换池水，实验前禁食4小时（h）。
[0034]
前三天进行定位航行试验，随机在平台象限外选两个与平台距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水到爬上平台所需的时间，即上台潜伏期，然后让小鼠在平台上停留10 秒（s）。如果60 s内找不到平台，潜伏期记为60 s，并将小鼠置于平台上休息10 s。学习训练每天重复四次，每次间隔1 h，四次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。定位航行试验结束24 h后，撤除平台，行空间探索实验。任选一相同入水点将鼠放入水中，让小鼠自由游泳60 s寻找平台，记录小鼠入水后60 s内的池中游泳路径，并分别计算小鼠在靶象限穿越原平台次数，并将其作为评价小鼠记忆成绩的指标。
[0035]
2. 实验结果2.1.絮窝实验：絮窝实验的结果表明（图8a），与对照组小鼠比较，la给药组小鼠的絮窝能力明显增强，说明化合物la能够明显修复app/ps1小鼠的社会行为学损伤。
[0036]
2.2.morris水迷宫实验：morris水迷宫测试结果显示（图8b-d），与对照组小鼠相
比，在可见平台实验中，la给药组小鼠的逃避潜伏期和逃脱距离未表现出明显的差异，而在隐藏平台实验中，给药组小鼠的逃避潜伏期和逃脱距离明显下降，具有统计学意义。另外，在空间探索实验中，与对照组小鼠相比，给药组小鼠穿过平台中心区域（原平台所在位置）的次数显著增加。说明化合物la能够显著提高app/ps1小鼠的空间学习和记忆能力。
[0037]
实验例2.la对app/ps1转基因小鼠脑组织病理变化的作用1.实验材料和方法1.1.app/ps1转基因小鼠分组及给药：同实验实例1，给药时间4个月。
[0038]
1.2.组织取材：小鼠行为学实验结束后，取小鼠脑进行形态学检测。首先用8%水合氯醛麻醉（0.5 ml/100 g）小鼠，打开胸腔，充分暴露心脏，剪开心包膜，找到左心室，将灌注针插入左心室，止血钳固定针尖，剪开右心耳，打开灌流器，先慢慢灌注30 ml生理盐水，待生理盐水完全灌完后，继续灌注4%多聚甲醛，灌注甲醛小鼠四肢颤抖，尾巴抖动，肝脏发白，说明灌注成功。灌注完成后，剥离脑壳暴露全脑，取出鼠脑并将其分为两部分，一半放入-80 ℃冰箱；另一半放入4%多聚甲醛内固定24 h后于20%蔗糖中脱水，待组织下沉后放入30%蔗糖中继续脱水。完全脱水后组织下沉到底部。
[0039]
1.3.石蜡切片免疫组织化学染色1.3.1.石蜡包埋及切片将脑组织从4%多聚甲醛中取出，放入70%乙醇中4 ℃过夜，梯度酒精脱水。通风厨中二甲苯透明（2 min
ꢀ-ꢀ
2 h时间不等）。软蜡浸泡1.5 h，硬蜡浸泡1.5 h，石蜡包埋固定。包埋好的组织利用石蜡切片机5 μm厚度的组织切片，随后采用烤片机对切片进行烘干，保存待用。
[0040]
1.3.2.免疫组化染色石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱蜡至水。切片热抗原修复并阻断内源性过氧化物酶后，组画笔画圈，切片置于室温下暗盒中血清封闭1 h，倾去血清。滴加一抗（小鼠抗aβ抗体，1:500），4℃孵育过夜。0.01 mol/l pb缓冲液洗片3次，每次5 min，避光，滴加二抗（生物素标记的山羊抗小鼠igg，1:200），室温孵育1 h。0.01 mol/l pb缓冲液洗片3次，每次5 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，室温孵育30 min，0.01 mol/l pb缓冲液洗片3次，每次5 min。
[0041]
切片于dab/ h2o2显色液中染3 min，浸泡于蒸馏水中终止反应，苏木素复染1-3 s，水洗以除去苏木素，盐酸酒精分化15-30 s，流水冲洗15-30 min返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明。中性树胶封片，风干；显微镜下观察并拍照。利用image-pro plus 6.0软件分析阳性表达区域的面积及数量。
[0042]
1.4.免疫印迹实验（western blot）1.4.1.组织蛋白提取称取适量大脑皮层组织，加入组织重量3倍量的ripa裂解液，超声破碎，4℃冰箱中冰上裂解2 h，13000 rpm，4℃，离心30 min，取上清。bca法测定蛋白浓度，将组织蛋白定量，蛋白于沸水浴中煮6 min进行变性，结束后放于-80℃保存备用。
[0043]
1.4.2.凝胶电泳分析
电泳和转膜：配制4%浓缩胶和10%分离胶，上样后电泳，凝胶中出现目的条带（根据marker判断），停止电泳；用电转移法将电泳分离出的蛋白条带转印到pvdf膜上。pvdf膜在1
×
tbst中漂洗1~2 min后放入5%脱脂牛奶，室温条件下封闭1 h。
[0044]
孵育抗体：1
×
tbst将pvdf膜上的牛奶去掉，加入特异性一抗（小鼠抗aβ抗体，1:3000），置于4
˚
c冰箱孵育过夜。1
×
tbst洗3次，5 min/次，室温下孵育二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg）1 h，1
×
tbst洗6次，5 min/次。
[0045]
化学发光和数据分析：ecl发光液a、b液按1:1比例混合，滴加于pvdf膜上，利用凝胶成像仪进行图像采集并保存。应用image j软件对蛋白条带进行分析。
[0046]
2.实验结果2.1.免疫组化实验：结果表明，与对照组小鼠比较，la给药组小鼠脑组织aβ斑块面积缩小（图 9a），数量减少（图 9b），说明la能够减少app/ps1小鼠大脑内的aβ沉积。
[0047]
2.2.免疫印迹实验：结果表明，与对照组小鼠比较，la给药组小鼠脑组织内aβ寡聚体（aβ oligomers）的表达明显下调（图 9c, 9d），说明la能够降低app/ps1小鼠大脑内的aβ寡聚体水平，减少app/ps1小鼠大脑内的aβ沉积，起到神经保护的作用。