包含新型共刺激结构域的嵌合抗原受体及其用途的制作方法

1.本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及包含新型共刺激结构域的嵌合抗原受体，以及包含此类嵌合抗原受体的工程化免疫细胞及其用途。


背景技术：

2.近几年，癌症免疫治疗技术发展迅速，尤其是嵌合抗原受体t细胞(car-t)相关的免疫疗法在血液瘤的治疗上获得了优异的临床效果。car-t细胞免疫疗法是将t细胞在体外进行基因改造，使其能够识别肿瘤抗原，在扩增到一定数量后回输至病人体内，进行癌细胞杀伤，从而达到治疗肿瘤的目的。
3.目前，随着技术的发展，已经出现了四代不同的car结构。第一代car的胞内信号传导结构域仅包含初级信号传导结构域，例如cd3ζ，因此携带car的细胞(例如car-t细胞)活性差，体内存活时间短。第二代car引入了共刺激结构域，例如cd28或4-1bb，使得细胞能够持续增殖，增强抗肿瘤活性。第三代car则包含两个共刺激结构域(例如cd28 4-1bb)，第四代car则加入了细胞因子或共刺激配体以进一步增强t细胞应答，或加入自杀基因以在需要时使car-t细胞自我毁灭。现在临床研究中大多使用的仍然是第二代car结构。
4.然而，car-t细胞疗法在临床应用中仍然存在一些问题，例如在血液瘤治疗中存在大量肿瘤复发现象，在实体瘤治疗中应答率不高等等，这些可能是由复杂的肿瘤微环境、car-t细胞耗竭等因素造成。
5.因此，仍然需要对现有的cart细胞疗法进行改进，以促进car-t细胞在体内的增殖，抵抗肿瘤微环境的免疫抑制作用，进而提高car-t细胞疗法对肿瘤的整体治疗效果。


技术实现要素：

6.因此，在第一个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述共刺激结构域包含nk激活性受体或其配体的胞内区。
7.在一个实施方案中，所述nk激活性受体选自2b4、dnam-1和lfa-1，更优选2b4。
8.在一个实施方案中，所述nk激活性受体的配体选自cd48、cd112、cd155、icam1、icam2或icam3，更优选cd155和icam-3。
9.在一个优选实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的共刺激结构域包含选自以下蛋白的胞内区：cd155、icam3和2b4。在一个实施方案中，所述cd155胞内区与seq id no:29所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性；icam3胞内区与seq id no:27所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性；2b4胞内区与seq id no:31所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
10.在一个实施方案中，所述共刺激结构域进一步包含选自以下蛋白的信号传导结构域：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、、
cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、cd94、ltb、zap70以及它们的组合。优选地，所述共刺激结构域进一步包含cd27、cd28、cd134、cd137或cd278的信号传导结构域或它们的组合，更优选进一步包含cd28和/或cd137的信号传导结构域。
11.在一个实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合部分。
12.在一个实施方案中，所述配体结合结构域选自免疫球蛋白分子、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、scfv抗体片段、重链抗体、线性抗体、sdab或纳米抗体。
13.在一个实施方案中，所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：tshr、cd19、cd123、cd22、baff-r、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、gprc5d、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-l lra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、afp、folate受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、cs1、cd138、ncam、claudin18.2、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gml、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、folate受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-la、mage-a1、豆荚蛋白、hpv e6、e7、mage al、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、pcta-l/galectin 8、melana/martl、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、雄激素受体、cyclin bl、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b 1、boris、sart3、pax5、oy-tes 1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5、igll1、pd1、pdl1、pdl2、tgfβ、april、nkg2d和它们的任意组合。优选地，所述配体结合结构域与选自以下的靶标结合：所述靶标选自cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd123、cd138、cd171、muc1、afp、folate受体α、cea、psca、psma、her2、egfr、il13ra2、gd2、nkg2d、egfrviii、cs1、bcma、间皮素和它们的任意组合。
14.在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
15.在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d，优选cd3ζ信号传导结构域。
16.本发明还提供编码如上所述的新型嵌合抗原受体的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。
17.在第二个方面，本发明还提供包含如上所述的新型嵌合抗原受体、核酸分子或载体的工程化免疫细胞。
18.在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞中用作共刺激结构域的相应内源性nk激活性受体或配体的表达被抑制或沉默。在一个优选的实施方案中，所述nk激活性受体是
2b4，所述nk激活性受体的配体是cd155或icam3。
19.在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：cd52、gr、dck、tcr/cd3基因(例如trac、trbc、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ)、mhc相关基因(hla-a、hla-b、hla-c、b2m、hla-dpa、hla-dq、hla-dra、tap1、tap2、lmp2、lmp7、rfx5、rfxap、rfxank、ciita)和免疫检查点基因，如pd1、lag3、tim3、ctla4、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、pdcd1、havcr2、btla、cd160、tigit、cd96、crtam、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、fas、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit、foxp3、prdm1、batf、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2和gucy1b3。优选地，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：trac、trbc、hla-a、hla-b、hla-c、b2m、rfx5、rfxap、rfxank、ciita、pd1、lag3、tim3、ctla4。
20.在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞选自t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞或nkt细胞。优选地，所述t细胞是cd4 /cd8 t细胞、cd4 辅助t细胞、cd8 t细胞、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞或αβ-t细胞。在一个实施方案中，免疫细胞衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等。
21.在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体，和一种多种药学上可接受的赋型剂。
22.在第三个方面，本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。
23.在一个实施方案中，本发明还提供根据本发明的新型钱和抗原受体、核酸分子、载体、工程化免疫细胞或药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
24.本发明的嵌合抗原受体的优势之处在于：(1)提供了nk激活性受体或其配体的胞内区作为额外的共刺激结构域，与单独的传统共刺激结构域例如cd28或4-1bb相比，具有更强的激活能力，提高了car细胞的杀伤能力；(2)在通用型car细胞的情况下，为了抑制nk细胞对外源性car细胞的杀伤，可能需要抑制或沉默car细胞中的内源性nk激活性受体或其配体的表达。在这种情况下，在car中包含相应的被抑制或沉默的nk激活性受体或其配体的胞内区作为共刺激结构域能够显著提高car细胞的杀伤活性。
25.发明详述
26.除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
27.嵌合抗原受体
28.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括配体结合结构域(例如抗体或其抗原结合部分)、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。car能够利用抗体的抗原结合特性以非mhc限制性的方式将t细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非mhc限制性的抗原识别给予表达car的免疫细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。
29.在第一个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，其中所述共刺激结构域包含nk激活性受体或其配体的胞内区。
30.共刺激结构域是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个胞内区，或其功能性片段。“共刺激分子”是指在t细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导t细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。传统的嵌合抗原受体使用cd28或4-1bb的胞内区作为共刺激结构域。本发明的嵌合抗原受体包含新型共刺激结构域，即，nk激活性受体或其配体的胞内区。本发明发现，nk激活性受体或其配体的胞内区作为新型共刺激结构域的加入能够显著增加car细胞对靶细胞的杀伤活性，尤其是在相应的内源性nk激活性受体或其配体在car细胞内的表达被抑制或沉默的情况下。
31.如本文所用，术语“nk激活性受体”是指通常具有基于免疫受体酪氨酸的激活性基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,itam)或者能够激活nk细胞活性的nk细胞表面受体。“nk激活性受体的配体”或者“nk激活性配体”是指与nk激活性受体结合的分子。nk激活性受体的主要功能在于活化nk细胞，使其发挥细胞毒性作用并释放细胞因子。nk细胞通过激活性受体和抑制性受体之间的平衡来调节活化状态。正常情况下，nk抑制性受体在信号转导平衡中占主导地位，抑制nk细胞活性，从而避免对自身细胞的杀伤。但当mhc-i类分子表达异常时，例如被人为抑制或敲除时，nk激活性受体将占据主导，nk细胞将此类mhc-i表达异常的细胞识别为“非自我”从而进行杀伤。
32.在一个实施方案中，nk激活性受体是2b4。2b4也称为cd244，是一种膜蛋白，广泛表达于nk细胞、cd8 t细胞、单核细胞和粒细胞表面。2b4的胞外区具有一个v型免疫球蛋白结构域和一个c2型免疫球蛋白样结构域，跨膜区不含任何带电荷的氨基酸，胞内区含有免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory switch motif,itsm)，该基序可被衔接蛋白sap、eat-2、drt等的胞质sh2区域识别。2b4交联使itsm中的酪氨酸磷酸化，并募集衔接蛋白，其中2b4与sap形成的复合物可以激活nk细胞。2b4并不是独立的受体，其作为nk细胞的辅助活化性受体，启动依赖于同其他ncr受体的共同作用。2b4的配体是cd48，高表达于造血细胞系和部分b淋巴细胞上。因此，在一个实施方案中，nk激活性受体的配体是cd48。
33.在一个实施方案中，nk激活性受体是dnam-1。dnam-1也称为cd226，是启动nk细胞发挥功能的主要辅助性活化受体。dnam-1含有2个免疫球蛋白v样结构域的胞膜外区、1个跨膜区，以及含有酪氨酸和丝氨酸残基潜在磷酸化位点的胞质区。dnam-1表达于多种血细胞上，包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、单核细胞、粒细胞和血小板。dnam-1是cd155和cd112共同的受体。cd112是单纯疱疹病毒受体，属于人连接素(nectin)家族，是ca2 非依赖性igsf黏附分子，其家族成员间通过同源或异源形式相互作用，引起细胞间黏附。cd155与nectin结构相似,又称为脊髓灰质炎病毒受体(polyclonal antibody to poliovirus receptor，pvr)。因此，在一个实施方案中，nk激活性受体的配体选自cd112和cd155。
34.在一个实施方案中，nk激活性受体是lfa-1。lfa-1由两条多肽链通过非共价键连接而成：α亚单位(cd11a)和β亚单位(cd18)。lfa-1的配体包括免疫球蛋白超家族成员icam1、icam2和icam3，它们是细胞间的黏着分子，在把白细胞定位黏合到受伤部位的上皮细胞中起着重要作用。icam1可以在多种细胞，例如淋巴细胞、内皮细胞、单核细胞、肿瘤细
胞上表达，并且受细胞因子的诱导调控。icam2可以在白细胞、内皮细胞和血小板上表达，icam3只在白细胞上表达，这两者不受细胞因子的诱导调控。这三种配体分别与lfa-1的α亚单位内的不同区域结合。icam分子和lfa-1之间的相互结合,为细胞毒性t细胞和nk细胞介导的免疫杀伤提供所需的共刺激信号，从而激活免疫反应。研究表明，icam1能够增强nkg2d介导的nk细胞对结直肠癌细胞的杀伤作用。因此，在一个实施方案中，nk激活性受体的配体选自icam1、icam2和icam3。
35.在一个实施方案中，选自以下蛋白的胞内区可用作本发明的嵌合抗原受体的共刺激结构域：2b4、cd48、dnam-1、cd112、cd155、lfa-1、icam1、icam2或icam3，更优选2b4、cd155和icam3。
36.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含2b4胞内区作为共刺激结构域，其与seq id no:31所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:32所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
37.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含cd155胞内区作为共刺激结构域，其与seq id no:29所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:30所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
38.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含icam3胞内区作为共刺激结构域，其与seq id no:27所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:28所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
39.在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含其他已知的nk激活性受体或其配体的胞内区作为共刺激结构域，此类实例包括但不限于：nkg2家族蛋白，例如nkg2c、nkg2e、nkg2d、nkg2f、nkg2h以及与其结合的配体，例如hla-e、qa1b、mica、micb、ulbp1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、rae-1、h60、mult1等；天然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors,ncr)家族，例如nkp30、nkp44、nkp46或nkp80以及与其结合的配体，例如b7-h6、bag6、pfemp1、hspgs、aicl；kir-s家族，例如kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、kir2ds5、kir3ds1等，以及与其结合的配体；协同激活受体，例如cd2，以及与其结合的配体，例如cd58和cd59；与ifnγ信号通路相关的分子，例如stat1、jak1、ifngr2、jak2、ifngr1等。
40.除了本发明提供的nk激活性受体或其配体的胞内区作为共刺激结构域外，本发明的嵌合抗原受体还可以包含一个或多个额外的共刺激结构域，其选自以下蛋白质的胞内区：tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、cd94、ltb或zap70，优选选自4-1bb、cd28、cd27、ox40或其组合，更优选选自4-1bb、cd28。在一个实施方案中，本发明的car包含2b4胞内区和4-1bb胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的car包含cd155胞内区和4-1bb胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的car包含icam3胞内区和4-1bb胞内区作为共刺激结构域。在一个实
施方案中，本发明的car包含2b4胞内区和cd28胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的car包含cd155胞内区和cd28胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的car包含icam3胞内区和cd28胞内区作为共刺激结构域。
41.作为共刺激结构域的4-1bb和cd28胞内区是本领域技术人员已知的。例如，4-1bb胞内区与seq id no:9所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:10所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。cd28胞内区与seq id no:7所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:8所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
42.如本文所用，“配体结合结构域”是指可以与配体(例如抗原)结合的任何结构或其功能性变体。配体结合结构域可以是抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其抗原结合片段。例如，配体结合结构域包括但不限于免疫球蛋白分子、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、scfv、二硫键-连接的fv(sdfv)、抗体的重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)、线性抗体、重链抗体、单结构域抗体(single domain antibody，sdab)、纳米抗体(nanobody，nb)、重组纤连蛋白结构域、anticalin和darpin等，优选选自免疫球蛋白分子、fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、scfv、线性抗体、重链抗体、sdab和纳米抗体，更优选选自fab、fab’、f(ab’)2、scfv、重链抗体、sdab和纳米抗体。在本发明中，配体结合结构域可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。“fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链n端部分组成，其中重链n端部分包括重链可变区和ch1。与完整的igg相比，fab没有fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。
[0043]“单链抗体”或“scfv”是由抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scfv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，hollinger等人,1993proc natl acad.sci.u.s.a.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及pct公布号wo2006/020258和wo2007/024715，其全文通过引用并入本文。scfv可以包含以任何顺序连接的vh和vl，例如vh-接头-vl或vl-接头-vh。
[0044]“重链抗体”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体包含一个重链可变区和常规的ch2与ch3区，主要存在于骆驼科中。近些年来在软骨鱼中发现了一种无轻链或其他蛋白分子伴随的类似于重链抗体的抗原受体(new or nurse shark antigen receptor，nar)。由于nar分子与ig亚型在跨膜和分泌方式等功能特征相似，故也被称为免疫球蛋白新抗原受体(ig new antigen receptor，ignar)。
[0045]“单结构域抗体”或“sdab”是指仅由轻链抗体可变区或重链抗体可变区组成的基因工程抗体。在骆驼科中发现的sdab仅包含重链抗体可变区，也被称为vhh或“纳米抗体”，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标
抗原的最小单位。基本的vhh从n端至c端具有以下结构：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，其中cdr是指互补决定区，fr是指框架区。
[0046]
术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。例如，对于抗体，其功能性片段是其抗原结合部分。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。
[0047]
如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。
[0048]
因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。
[0049]
如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如blast(altschul等(1997)nucleic acids res.25：3389-3402)、blast2(altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410)、smith-waterman(smith等(1981)j.mol.biol.147：195-197)和clustalw。
[0050]
配体结合结构域的选择取决于待识别的与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记，例如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。因此，在一个实施方案中，本发明的配体结合结构域与选自以下的一个或多个靶标结合：tshr、cd19、cd123、cd22、cd30、cd171、cs-1、cll-1、cd33、egfrviii、gd2、gd3、bcma、tn ag、psma、ror1、flt3、fap、tag72、cd38、cd44v6、cea、epcam、b7h3、kit、il-13ra2、间皮素、il-l lra、psca、prss21、vegfr2、lewisy、cd24、pdgfr-β、ssea-4、cd20、folate受体α、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、ncam、prostase、pap、elf2m、ephrin b2、igf-i受体、caix、lmp2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、epha2、fucosyl gml、sle、gm3、tgs5、hmwmaa、o-乙酰基-gd2、folate受体β、tem1/cd248、tem7r、cldn6、gprc5d、cxorf61、cd97、cd 179a、alk、多聚唾液酸、plac1、globoh、ny-br-1、upk2、havcr1、adrb3、panx3、gpr20、ly6k、or51e2、tarp、wt1、ny-eso-1、lage-la、mage-a1、豆荚蛋白、hpv e6、e7、mage al、etv6-aml、精子蛋白17、xage1、tie 2、mad-ct-1、mad-ct-2、fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、pcta-l/galectin 8、melana/martl、ras突变体、htert、肉瘤易位断点、ml-iap、erg(tmprss2 ets融合基因)、na17、pax3、
雄激素受体、cyclin bl、mycn、rhoc、trp-2、cyp1b 1、boris、sart3、pax5、oy-tes 1、lck、akap-4、ssx2、rage-1、人端粒酶逆转录酶、ru1、ru2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、cd79a、cd79b、cd72、lair1、fcar、lilra2、cd300lf、clec12a、bst2、emr2、ly75、gpc3、fcrl5、igll1、pd1、pdl1、pdl2、tgfβ、april、claudin18.2、nkg2d和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自：cd19、cd20、cd22、baff-r、cd33、egfrviii、bcma、gprc5d、psma、ror1、fap、erbb2(her2/neu)、muc1、egfr、caix、wt1、ny-eso-1、cd79a、cd79b、gpc3、claudin18.2、nkg2d和它们的任意组合。根据待靶向的抗原，本发明的car可以被设计为包括对该抗原具有特异性的配体结合结构域。例如，如果cd19是待靶向的抗原，则cd19抗体可用作本发明的配体结合结构域。
[0051]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体靶向cd19。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗cd19抗体，其包含：(i)分别如seq id no：33、34和35所示的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，和如seq id no：36、37和38所示的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3；或(ii)分别如seq id no：39、40和41所示的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，和如seq id no：42、43和44所示的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。优选地，所述抗cd19抗体包含与seq id no：1第1-107位或seq id no：25第1-107位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与seq id no：1第123-242位或seq id no：25第123-238位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列。
[0052]
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、nk细胞或nkt细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自cd8α链或cd28，其与seq id no:3或5所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:4或6所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0053]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自cd8、cd4或cd28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含cd8α链、fcγriiiα受体、cd28、igg4或igg1的铰链区部分，更优选来自cd8α、cd28或igg4的铰链，其与seq id no:19、21或23所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者其编码序列与seq id no:20、22或24所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序
列同一性。
[0054]
如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达car的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0055]
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是t细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,itam)。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d等的胞内区。在优选的实施方式中，本发明car的信号传导结构域可以包含cd3ζ胞内区，其与seq id no:11或13所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与seq id no:12或14所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0056]
在一个实施方案中，共刺激结构域和胞内信号传递结构域可以任何顺序可操作连接。例如，共刺激结构域可以位于近膜端，而胞内信号传导结构域位于远膜端，或者刺激结构域位于远膜端，而胞内信号传导结构域位于近膜端。当含有两个或更多个共刺激结构域时，共刺激结构域可以位于胞内信号传递结构域的一侧或两侧。
[0057]
在一个实施方案中，本发明的car还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如t细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自cd8α、igg1、gm-csfrα、b2m等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与seq id no:15或17所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与seq id no:16或18所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
[0058]
在一个实施方案中，本发明的car还可以包含开关结构，以调控car的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的car结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。
[0059]
在一个实施方案中，本发明的car还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过
外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除car细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如cd20表位、rqr8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除car细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是icaspase-9，可以通过化学诱导药物如ap1903、ap20187等诱导icaspase-9发生二聚化，从而激活下游的caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。
[0060]
核酸和载体
[0061]
本发明还提供一种核酸分子，其包含编码本发明的嵌合抗原受体的核酸序列。本发明还提供一种包含此类核酸分子的载体。
[0062]
如本文所用，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的rna或dna，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括dna(比如dsdna、ssdna、cdna)、rna(比如dsrna、ssrna、mrna、ivtrna)，它们的组合或衍生物(比如pna)。优选地，所述核酸是dna或rna，更优选mrna。
[0063]
核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(pna)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链car可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。
[0064]
可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。
[0065]
如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。
[0066]
载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mrna的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(rsv)、多瘤病毒和腺相关病毒(aav)等、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括bac和yac)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的dna序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，mcs)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polya)、3’utr、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
[0067]
工程化免疫细胞
[0068]
本发明提供一种工程化免疫细胞，其包含本发明的嵌合抗原受体、核酸分子或载体。
[0069]
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导adcc和/或cdc)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞。在一个实施方案中，免疫细胞衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等。优选地，免疫细胞是t细胞。t细胞可以是任何t细胞，如体外培养的t细胞，例如原代t细胞，或者来自体外培养的t细胞系例如jurkat、supt1等的t细胞，或获得自受试者的t细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。t细胞也可以被浓缩或纯化。t细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，cd4 /cd8 t细胞、cd4 辅助t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8 t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人t细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如ficoll分离从受试者的血液获得t细胞。
[0070]
采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体的核酸序列以及外源性基因引入免疫细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是rna转染，即将rna(比如体外转录的rna，ivtrna)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/dna共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。
[0071]
在一个实施方案中，为减少移植物抗宿主病的风险，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：cd52、gr、dck、tcr/cd3基因(例如trac、trbc、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ)、mhc相关基因(hla-a、hla-b、hla-c、b2m、hla-dpa、hla-dq、hla-dra、tap1、tap2、lmp2、lmp7、rfx5、rfxap、rfxank、ciita)和免疫检查点基因，如pd1、lag3、tim3、ctla4、ppp2ca、ppp2cb、ptpn6、ptpn22、pdcd1、havcr2、btla、cd160、tigit、cd96、crtam、tnfrsf10b、tnfrsf10a、casp8、casp10、casp3、casp6、casp7、fadd、fas、tgfbrii、tgfrbri、smad2、smad3、smad4、smad10、ski、skil、tgif1、il10ra、il10rb、hmox2、il6r、il6st、eif2ak4、csk、pag1、sit、foxp3、prdm1、batf、gucy1a2、gucy1a3、gucy1b2和
gucy1b3。优选地，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：trac、trbc、hla-a、hla-b、hla-c、b2m、rfx5、rfxap、rfxank、ciita、pd1、lag3、tim3、ctla4，更优选trac、trbc、hla-a、hla-b、hla-c、b2m、rfx5、rfxap、rfxank、ciita。
[0072]
在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞中用作共刺激结构域的相应内源性nk激活性受体或配体的表达被抑制或沉默。在制备通用型car细胞以降低移植物抗宿主病风险时，通常会敲除car细胞中的内源性mhc相关基因，例如hla、b2m、ciita，rfx5等，以避免car细胞被受体的t细胞攻击，进而影响car细胞的存活和疗效。然而，某些nk抑制性受体，例如nkg2a也结合mhc相关基因。这种结合使得正常情况下nk细胞中的抑制性信号占据主导地位，将细胞识别为“自我”而不会发动攻击。因此，当抑制或沉默car细胞中的内源性mhc相关基因的表达时，会使得患者体内的nk细胞的抑制性信号被解除，激活性信号占主导，结果是car细胞被患者体内的nk细胞识别为“非自我”进行杀伤。这种情况下，可能需要抑制或沉默car细胞中的内源性nk激活性受体或其配体的表达，以减少nk细胞的激活性信号，降低体内nk细胞对外源性car细胞的杀伤。
[0073]
发明人首次发现，在其中nk激活性受体的表达被抑制或沉默的car细胞中，包含相应的被抑制或沉默的nk激活性受体或其配体的胞内区作为共刺激结构域能够显著提高car细胞的杀伤活性；在其中nk激活性配体的表达被抑制或沉默的car细胞中，包含相应的被抑制或沉默的nk激活性配体或其受体的胞内区作为共刺激结构域能够显著提高car细胞的杀伤活性。
[0074]
因此，在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞的内源性nk激活性配体cd155的表达被抑制或沉默，并且其表达的嵌合抗原受体包含cd155胞内区或cd155的受体(例如dnam-1)的胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞的内源性nk激活性配体icam3的表达被抑制或沉默，并且其表达的嵌合抗原受体包icam3胞内区或icam3的受体(例如lfa-1)的胞内区作为共刺激结构域。在一个实施方案中，本发明的工程化免疫细胞的内源性nk激活性受体2b4的表达被抑制或沉默，并且其表达的嵌合抗原受体包2b4胞内区或2b4的配体(例如cd48)的胞内区作为共刺激结构域。
[0075]
抑制基因表达或使基因沉默的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用反义rna、rna诱饵、rna适体、sirna、shrna/mirna、反式显性阴性蛋白(tnp)、嵌合/融合蛋白、趋化因子配体、抗感染性细胞蛋白、细胞内抗体(sfv)、核苷类似物(nrti)、非核苷类似物(nnrti)、整合酶抑制剂(寡核苷酸、二核苷酸和化学剂)和蛋白酶抑制剂来抑制基因的表达。另外，也可以通过例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、tale核酸酶或crispr系统中的cas酶介导dna断裂，从而使基因沉默。
[0076]
药物组合物
[0077]
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的嵌合抗原受体、核酸分子、载体或工程化免疫细胞作为活性剂，和一种多种药学上可接受的赋型剂。
[0078]
如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附
剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。
[0079]
根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
[0080]
根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。
[0081]
根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠ii(sorfimer sodiumphotofrin ii)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀e(auristatin e)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素a、dna酶和rna酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗cd3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。
[0082]
治疗应用
[0083]
本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述嵌合抗原受体、核酸分子、载体、工程化免疫细胞以及药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
[0084]
在一个实施方案中，直接向受试者施用有效量的本发明的免疫细胞和/或药物组合物。
[0085]
在另一个实施方案中，本发明的治疗方法是离体治疗。具体地，该方法包括以下步骤：(a)提供样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的嵌合抗原受体以及外源性基因(如果存在)引入所述免疫细胞，并任选地抑制或沉默所述免疫细胞中特定基因的表达(如果需要)，获得经修饰的免疫细胞，(c)向有此需要的受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，步骤(a)中提供的免疫细胞选自巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、t细胞、nk细胞和/或nkt细胞；并且所述免疫细胞可以通过本领域已知的常规方法从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，也可以使用能够表达本发明的嵌合抗原受体并发挥如本文所
述的所需生物效应功能的其它免疫细胞。此外，通常选择的免疫细胞与受试者的免疫系统相容，即优选所述免疫细胞不引发免疫原性响应。例如，可以使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的可在体外生长和扩增的淋巴细胞。使用此类细胞将不需要获得和/或提供受试者自身淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入免疫细胞或通过用病毒载体感染免疫细胞来实施，所述病毒载体为如前所述的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时rna转染。
[0086]
在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞和/或nkt细胞，更优选t细胞、nk细胞或nkt细胞。
[0087]
如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。
[0088]
如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。
[0089]
如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。
[0090]
在一个实施方案中，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和cns癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(gbm)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性(sl)nhl、中间级/滤泡性nhl、中间级扩散性nhl、高级成免疫细胞性nhl、高级成淋巴细胞性nhl、高级小型非裂化细胞性nhl、大肿块病nhl)、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、malt淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、白血病(包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病(包括未分化型和部分分化型)、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人t细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(ptld)。优选地，可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。
[0091]
在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。
[0092]
在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于i型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。
[0093]
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
[0094]
图1示出了bbzi3-car t细胞和bbz155-car t细胞中scfv的表达水平。
[0095]
图2示出了bbzi3-car t细胞和bbz155-car t细胞对靶细胞的杀伤效果。
[0096]
图3示出了bbzi3-car t细胞和bbz155-car t细胞的细胞因子释放水平。
[0097]
图4示出了其中相应内源性nk激活性受体的配体被敲除的car-t细胞scfv的表达水平。
[0098]
图5示出了其中相应内源性nk激活性受体的配体被敲除的car-t细胞对靶细胞的杀伤效果。
[0099]
图6示出了其中相应内源性nk激活性受体的配体被敲除的car-t细胞的细胞因子释放水平。
[0100]
图7示出了bbz2b4-car t细胞以及其中cd48被敲除的car-t细胞的scfv表达水平。
[0101]
图8示出了bbz2b4-car t细胞以及其中cd48被敲除的car-t细胞对靶细胞的杀伤效果。
具体实施方式
[0102]
本发明所有实施例中使用的t细胞是通过ficoll-paquetm premium(ge healthcare，货号17-5442-02)采用白细胞分离术从健康供体分离的原代人cd4 cd8 t细胞。
[0103]
实施例1.制备car t细胞
[0104]
合成编码以下蛋白的序列，并将其克隆至plvx载体(public protein/plasmid library(ppl)，货号:ppl00157-4a)：cd8α信号肽(seq id no：15)、抗cd19 scfv(seq id no：1)、cd8α铰链区(seq id no：19)、cd8α跨膜区(seq id no：3)、4-1bb胞内区(seq id no：9)、cd3ζ胞内区(seq id no：11)和nk激活性配体的胞内区作为额外的共刺激结构域(cd155胞内区(seq id no：29)或icam3胞内区(seq id no：27))，并通过测序确认目标序列的正确插入。
[0105]
在无菌管中加入3ml opti-mem(gibco，货号31985-070)稀释上述质粒后，再根据质粒:病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体pspax2(addgene，货号12260)和包膜载体pmd2.g(addgene，货号12259)。然后，加入120ul x-treme gene hp dna转染试剂(roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293t细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，
超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的慢病毒。
[0106]
用dynabeads cd3/cd28 ctstm(gibco,货号40203d)激活t细胞，并在37℃和5％co2下培养1天。然后，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得表达bbzi3-car和bbz155-car的t细胞。不包含额外的共刺激结构域的bbz-car t细胞(即，cd8α信号肽-抗cd19 scfv-cd8α铰链区-cd8α跨膜区-4-1bb胞内区-cd3ζ胞内区)和未经修饰的野生型t细胞(nt)用作对照。
[0107]
在37℃和5％co2下培养11天之后，使用biotin-sp(long spacer)affinipure goat anti-mouse igg,f(ab')2fragment specific(min x hu,bov,hrs sr prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，apc streptavidin(bd pharmingen，货号554067)或pe streptavidin(bd pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测car-t细胞上的scfv的表达水平，结果如图1所示。
[0108]
可以看出，本发明制备的car t细胞中的scfv均可以有效表达。实施例2：car t细胞对靶细胞的杀伤效果和细胞因子释放
[0109]
2.1检测对靶细胞的杀伤能力
[0110]
首先以1x104/孔将携带荧光素基因的nalm6靶细胞铺入96孔板中，然后以2:1的效靶比(即效应t细胞与靶细胞之比)将nt细胞、bbz-car t细胞、bbzi3-car t细胞和bbz155-car t细胞铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值
×
100％，计算得到杀伤效率，结果如图2所示。
[0111]
可以看出，与传统结构的bbz-car t细胞相比，进一步包含nk激活性配体icam3或cd155的胞内区作为共刺激结构域可以显著增强car t细胞的杀伤能力。
[0112]
2.2检测细胞因子释放水平
[0113]
(1)收集细胞共培养上清液
[0114]
以1x105/孔的浓度将靶细胞nalm6或非靶细胞jurkat铺于96孔板中，然后以1:1的比例将本发明的nt细胞、bbz-car t细胞、bbzi3-car t细胞和bbz155-car t细胞分别与靶细胞或非靶细胞共培养，18-24小时后收集细胞共培养上清液。
[0115]
(2)elisa检测上清中il-2和ifn-γ的分泌量
[0116]
使用捕获抗体purified anti-human il2 antibody(biolegend，货号500302)或purified anti-human ifn-γantibody(biolegend，货号506502)包被96孔板4℃孵育过夜，然后移除抗体溶液，加入250μl含有2％bsa(sigma，货号v900933-1kg)的pbst(含0.1％吐温的1xpbs)溶液，37℃孵育2小时。然后用250μl pbst(含0.1％吐温的1xpbs)清洗板3次。每孔加入50μl细胞共培养上清液或标准品，并在37℃孵育1小时，然后用250μl pbst(含0.1％吐温的1xpbs)清洗板3次。然后向各孔分别加入50μl检测抗体anti-interferon gamma抗体[md-1](biotin)(abcam，货号ab25017)，在37℃孵育1小时后，用250μl pbst(含0.1％吐温的1xpbs)清洗板3次。再加入hrp streptavidin(biolegend，货号405210)，在37℃孵育30分钟后，弃上清液，加入250μl pbst(含0.1％吐温的1xpbs)，清洗5次。向各孔加入50μl tmb底物溶液。使反应在室温下于暗处发生30分钟，之后向各孔中加入50μl 1mol/l h2so4以停止反应。在停止反应的30分钟内，使用酶标仪检测450nm处吸光度，并根据标准曲线(根据标准品的读值和浓度绘制)计算细胞因子的含量，结果如图3所示。
[0117]
可以看出与传统结构的bbz-car t细胞相比，进一步包含nk激活性配体icam3或cd155的胞内区作为共刺激结构域可以显著提高car t细胞的细胞因子释放水平。
[0118]
实施例3.nk激活性配体被敲除的cart细胞
[0119]
通过crisp/cas9系统分别敲除bbzi3-car和bbz155-car t细胞中的相应nk激活性配体，获得icam3被敲除的i3ko-bbzi3-car t细胞和cd155被敲除的155ko-bbz155-car t细胞。还通过相同的方式敲除bbz-car t细胞中的icam3或cd155，获得其中icam3被敲除的i3ko-bbz-car t细胞和cd155被敲除的155ko-bbz-car t细胞。
[0120]
将car t细胞在37℃和5％co2下培养11天之后，使用apc-anti human cd155(biolegend，货号337618)和pe-anti human icam3(biolegend，货号330005)抗体，通过流式细胞仪检测cd155和icam3的基因编辑效率，结果如下表1所示。
[0121]
表1.基因编辑效率
[0122]
细胞名称敲除基因nt敲除后的表达水平155ko-bbz-car tcd15587.6％23.6％155ko-bbz155-car tcd15587.6％25.8％i3ko-bbz-car ticam393.5％18％i3ko-bbzi3-car ticam393.5％19.8％
[0123]
可以看出，各种nk激活性配体都被有效的敲除。
[0124]
在37℃和5％co2下培养11天之后，使用biotin-sp(long spacer)affinipure goat anti-mouse igg,f(ab')2fragment specific(min x hu,bov,hrs sr prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，apc streptavidin(bd pharmingen，货号554067)或pe streptavidin(bd pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测上述car t细胞上的scfv的表达水平，结果如图4所示。
[0125]
可以看出，本发明制备的car t细胞中的scfv均可以有效表达。
[0126]
根据实施例2.1所述的方法检测以上car t细胞对nalm6靶细胞的杀伤能力，结果如图5所示。
[0127]
可以看出，在敲除相应的nk激活性配体后，进一步包含nk激活性配体的胞内区能够显著增强car-t细胞的杀伤能力。
[0128]
根据实施例2.2所述的方法检测以上car t细胞与nalm6靶细胞共培养后的细胞因子释放水平，结果如图6所示。
[0129]
可以看出，在敲除相应的nk激活性配体后，进一步包含nk激活性配体的胞内区的car t细胞具有更强的分泌ifn-γ的能力。此外，与i3ko-bbz-car t组相比，i3ko-bbzi3-car t组细胞il-2的分泌水平也显著增强。以上结果说明，在敲除nk激活性配体的背景下，进一步包含相应nk激活性配体的胞内区能够增强car-t细胞的细胞因子分泌能力。
[0130]
实施案例4表达nk激活性受体胞内段的car t细胞
[0131]
根据实施例1中的方式制备bbz2b4-car t细胞，其与bbz-car t细胞的区别仅在于car结构中还包含nk激活性受体2b4的胞内区(seq id no：31)作为额外的共刺激结构域。同时通过crisp/cas9系统敲除bbz-car t细胞和bbz2b4-car t细胞中的cd48基因(即，2b4的配体)，获得其中cd48被敲除的48ko-bbz-car t细胞和48ko-bbz2b4-car t细胞。
[0132]
将car t细胞在37℃和5％co2下培养11天之后，使用pe-anti human cd48
(biolegend，货号336708)检测cd48的基因编辑效率，以确认cd48被有效敲除，结果如下表2所示。
[0133]
表2.基因编辑效率
[0134]
细胞名称敲除基因nt敲除后的表达水平48ko-bbz-car tcd4897.3％17.4％48ko-bbz2b4-car tcd4897.3％16.1％
[0135]
在37℃和5％co2下培养11天之后，使用biotin-sp(long spacer)affinipure goat anti-mouse igg,f(ab')2fragment specific(min x hu,bov,hrs sr prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，apc streptavidin(bd pharmingen，货号554067)或pe streptavidin(bd pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测上述car t细胞上的scfv的表达水平，结果如图7所示。
[0136]
可以看出，本发明制备的car t细胞中的scfv均可以有效表达。
[0137]
根据实施例2中2.1的方式检测上述car t细胞对nalm6细胞的杀伤效果。结果显示，无论是与传统结构的car t细胞(即，bbz-car)相比或是与其中nk激活性配体cd48被敲除的car-t细胞(即，48ko-bbz-car)相比，进一步在car结构中包含nk激活性配体的受体2b4的胞内区作为额外的共刺激结构域均能显著增强car t细胞的杀伤能力。
[0138]
要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。