一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制作方法

：
1.本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种用于制备β-烟酰胺单核苷酸的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸也叫β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide，β-nmn)，结构如化合物ⅰ所示。
[0003][0004]
β-烟酰胺单核苷酸在人体细胞能量生成中扮演重要角色，参与细胞内nad

(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，细胞能量转化的重要辅酶)的合成，是nad

的关键前体之一。david scinclair研究团队在文献science,2017,355,1312-1317中报道，nad

在小鼠体内的增加，能够使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被延缓，这项研究工作使得人类向实现长寿梦想迈进了一大步。nad

分子量过大，口服吸收利用率低。但随着对nad

前体小分子物质β-nmn的研究发现，服用β-nmn可以有效提升体内nad

的浓度，并显著改善人体新陈代谢，使得β-nmn成为了“不老神药”。这也促使全球医药、食品、化妆品界科研人员不断的对β-nmn进行研究与开发。
[0005]
目前，在β-nmn的生物酶法合成中，烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)是最为关键的限速酶，它能催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸发生反应合成β-nmn，转化反应式如scheme 1所示。
[0006][0007]
在催化反应中，酶的催化效率和稳定性是工业应用的重要指标，而现有的野生型烟酰胺磷酸核糖转移酶在催化效率和稳定性上都较差，严重制约了β-nmn的生物催化技术的产业化的应用。
[0008]
因此，提高烟酰胺磷酸核糖转移酶的稳定性是降低β-nmn的生物催化合成成本、提高烟酰胺磷酸核糖转移酶的工业应用价值、促进生物催化技术在β-nmn产业化生产中应用
的关键因素。


技术实现要素：

[0009]
针对现有技术中烟酰胺磷酸核糖转移酶的稳定性较低、工业应用价值较低的问题，本发明的目的在于提供一种稳定性高于现有野生型的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。
[0010]
一方面，本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以seq id no.1所示的野生型烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列为参考序列，在314、315、417、419、450、452位点发生单点或者多点突变。其中，第314位的ser突变为cys，第315位的gly突变为cys，第417位的pro突变为cys，第419位的ala突变为cys，第450位的leu突变为pro，第452位的glu突变为pro。
[0011]
进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、5、7、9、11、13、15所示。
[0012]
进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的核苷酸序列如seq id no.4、6、8、10、12、14、16所示。
[0013]
进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体来源于homo sapiens，野生型模板ncbi的登录号为nm_005746.3。
[0014]
进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体表达于大肠杆菌e.coli bl(21)de3。
[0015]
进一步，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的表达载体为pet28a。
[0016]
另一方面，本发明提供了烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体可应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中，催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸转变为烟酰胺单核苷酸。
[0017]
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，通过对烟酰胺磷酸核糖转移酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高稳定性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，该突变体可高效催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸转变为β-nmn，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产β-nmn的成本，具有较高的工业应用价值。
附图说明
[0018]
图1nampt基因的电泳图
[0019]
图2野生型nampt的蛋白表达图
具体实施方式
[0020]
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
[0021]
实施例1野生型nampt的克隆构建
[0022]
通过设计上下游引物扩增出nampt基因，上游引物：5
’-
cgatcgcatatgaatcctgcggcagaa-3’，划线部分为限制性内切酶ndeⅰ的酶切位点；下游引物：5
’-
atgctaggaattcctaatgatg tg ctgcttccag-3’，划线部分为限制性内切酶ecorⅰ的酶切位点。
[0023]
利用prime star聚合酶(takara公司)，在上下游引物的参与下扩增得到目的基因
nampt。pcr反应条件为：98℃预变性2min，每个循环包括95℃变性25s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃衍生5min。反应结束后在1％的琼脂糖凝胶上检测pcr产物，结果见附图1。核酸长度与pdb数据库公布的大小一致(1473bp)，其核苷酸序列如seq id no:2所示。用试剂盒(axygen公司)纯化产物，将纯化后产物用限制性内切酶ndeⅰ和ecorⅰ(thermo公司)进行双酶切，之后用相同内切酶双酶切的质粒pet-28a，将切割后的基因和质粒片段进行t40ligase酶连接，连接后产物再次纯化后直接转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃孵育1h后，直接涂布在含有25μg/ml卡那霉素抗性的lb平板上，得带重组质粒命名为pet-28a-nampt。
[0024]
实施例2野生型nampt的蛋白表达
[0025]
将构建好的重组质粒pet28a-nampt经过化学转化方法，转入bl21(de3)感受态细胞，在含有kan

抗性的lb平板上37℃隔夜倒置培养。挑选阳性单克隆细胞，获得可以诱导表达的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因工程菌株。将含有nampt基因的bl21(de3)细胞接种到含有kan

抗性的lb试管中，于37℃培养过夜，得到一级种子培养液。将种子培养液按照1％的接种比例转接到含有抗性的2yt液体培养基中，置于摇床中，37℃下，200rpm转速培养3-5h，测od达到0.6～0.8时，降温至20℃，加入iptg，浓度控制在0.1mm，进行隔夜诱导表达。发酵液通过离心并收集菌体，用20mm磷酸盐缓冲液(ph7.5)将收集的菌体进行溶解，并利用超声破碎细胞。之后再次12000rpm离心10min，得到的上清液即为转氨酶蛋白，通过电泳可以看见蛋白的表达情况，见附图2。
[0026]
实施例3突变体的构建
[0027]
依据nampt的晶体3dhd结构，分别对位点314、315、417、419、450和452进行定点突变，利用primer5软件设计突变引物，利用全质粒pcr获得突变体，具体引物设计见表1。
[0028]
表1定点突变的引物序列
[0029][0030]
表1中带下划线的序列为突变位点，利用primer star max dna聚合酶(takara公司)在正反向饱和引物的参与下，以重组质粒pet28a-nampt为模板，进行全质粒扩增反应，pcr反应程序参考表2。
[0031]
表2全质粒扩增程序表
[0032]
[0033][0034]
将获得的全质粒突变体片段基因转入bl21(de3)感受态细胞中，涂布于含有30ug/ml的kan

抗性lb平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序鉴定位点是否突变。在单点获得突变体后，分别分析稳定性变化，将稳定性提高的突变体可以再次叠加突变，突变方法与上述相同。
[0035]
实施例4突变体稳定性的比较
[0036]
为了测试突变体的稳定性是否有提升，首先将上述经基因工程手段获得的突变体进行摇瓶表达细胞，获得的细胞放置于-80℃的超低温冰箱中进行冷冻破碎，放置2天后，分别称量0.5g破碎细胞若干，转入ep管中，置放在25℃水域锅中。分别在放置不同时间段取样转化测试参与活力，具体投料为：利用20mm磷酸盐缓冲液ph 7.5配置50mm磷酸焦磷酸核糖(prpp)，取10ml pprp投入反应釜中，再称量0.061g烟酰胺(nam)转入反应釜中，将不同时间段热失活的nampt突变体0.5g投入反应釜中，37℃开始计时反应，4h后将反应液加热到90℃保持5min，终止反应。将反应液在12000rpm离心2min，送hplc分析产物生成情况，具体稳定性半衰期的数据见表3。
[0037]
表3 nampt突变体的稳定性数据
[0038]