用于溶酶体病症的基因疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年3月12日提交的美国临时专利申请号62/988,665、于2020年1月13日提交的美国临时专利申请号62/960,471、于2019年12月27日提交的美国临时专利申请号62/954,089、于2019年11月12日提交的美国临时专利申请号62/934,450和于2019年4月10日提交的美国临时专利申请号62/831,846的优先权。这些申请中的每一个的公开内容以引用方式整体并入本文。
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技术领域
5.本公开涉及基因疗法及其使用方法领域。
背景技术：
6.戈谢病(gaucher disease)是一种罕见的先天性糖鞘脂代谢异常，其原因在于溶酶体酸性β-葡糖脑苷脂酶(gcase，“gba”)的缺乏。患者具有非cns症状和发现，包括肝脾肿大、导致全血细胞减少症的骨髓机能不全、肺病和纤维化，以及骨质缺损。此外，大量患者具有神经病学表现，包括有缺陷的眼扫视运动和凝视、癫痫发作、认知缺陷、发育迟滞和运动障碍(包括帕金森病(parkinson’s disease))。存在解决外周疾病以及在造血骨髓和内脏中的主要临床表现的几种治疗方法，包括如下所述的酶替代疗法、与有缺陷的gcase结合并改善稳定性的伴侣样小分子药物，以及阻断导致症状和发现的在戈谢病中累积的底物产生的底物减少疗法。然而，戈谢病的其他方面(特别是影响骨骼和脑的那些方面)似乎难以治疗。
7.颗粒蛋白前体(progranulin，pgrn)是一种另外的与溶酶体功能相关的蛋白质。pgrn由grn基因编码。在人体内的grn单倍体不足导致发生ftd-grn(具有grn突变的额颞叶痴呆)的风险为大约90％，ftd-grn是一种以执行功能受损、行为改变和语言困难为特征、伴有额叶和颞叶萎缩的神经退行性疾病。对于患有ftd的患者还没有改善疾病的疗法可用。
技术实现要素：
8.本文提供了用于治疗患有或疑似患有具有grn突变的额颞叶痴呆的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(raav)，所述raav包含：(i)包含含有表达构建体的核酸的raav载体，所述表达构建体包含与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；和(ii)aav9衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav以从约1
×
10
13
个载体基因组(vg)至约7
×
10
14
vg范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，所述raav通过注射到小脑延髓池中来施用。
9.在一些实施方案中，与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子是鸡β肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，所述raav载体还包含巨细胞病毒(cmv)增强子。在一些实施方案中，所述raav载体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。在一些实施方案中，所述raav载体还包含牛生长激素聚a信号尾。在一些实施方案中，所述核酸包含位于表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(itr)序列。在一些实施方案中，每个itr序列是野生型aav2itr序列。在一些实施方案中，所述raav载体还包含在5’itr与表达构建体之间的try区，其中所述try区包含seq id no：28。
10.本文提供了用于治疗患有或疑似患有具有grn突变的额颞叶痴呆的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用raav，所述raav包含：(i)包含以5
′
至3
′
的顺序含有以下各项的核酸的raav载体：
11.(a)aav2 itr；(b)cmv增强子；(c)cba启动子；(d)编码pgrn蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；(e)wpre；(f)牛生长激素聚a信号尾；和(g)aav2 itr；以及
12.(ii)aav9衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav以从约1
×
10
13
vg至约7
×
10
14
vg范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，所述raav通过注射到小脑延髓池中来施用。
13.在一些实施方案中，所述raav以包含约20mm ph 8.0的tris、约1mm mgcl2、约200mm nacl和约0.001％w/v泊洛沙姆188的制剂施用。
14.本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含(i)raav，所述raav包含：(a)包含含有表达构建体的核酸的raav载体，所述表达构建体包含与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；和(b)aav9衣壳蛋白；以及(ii)约20mm ph 8.0的tris，(iii)约1mm mgcl2，(iv)约200mm nacl，和(v)约0.001％w/v泊洛沙姆188。
15.本文提供了raav，所述raav包含：(a)包含含有表达构建体的核酸的raav载体，所述表达构建体包含与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；和(b)aav9衣壳蛋白，所述raav用于治疗受试者的具有grn突变的额颞叶痴呆的方法中。
16.本文提供了定量脑脊液(csf)样品中的pgrn蛋白水平的方法，所述方法包括：(1)在含有二硫苏糖醇(dtt)和样品缓冲液的主混合物中稀释所述csf样品；(2)将稀释后的csf样品、抗颗粒蛋白前体抗体、检测抗颗粒蛋白前体抗体的二抗、鲁米诺和过氧化物加载到毛细管卡盒的孔中；(3)将所述毛细管卡盒加载到自动化western印迹免疫测定仪器中；(4)利用所述自动化western印迹免疫测定仪器计算信号强度、峰面积和信噪比；以及(5)将在所述csf样品中的颗粒蛋白前体的蛋白质水平定量为对于抗颗粒蛋白前体抗体的免疫反应性的峰面积。
附图说明
17.图1是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
18.图2是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和limp2(scarb2或其部分)的表
达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和limp2的编码序列由内部核糖体进入位点(ires)分开。
19.图3是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和limp2(scarb2或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和limp2的编码序列的表达各自由单独的启动子驱动。
20.图4是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、limp2(scarb2或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
21.图5是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、鞘脂激活蛋白原(prosaposin)(例如，psap或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
22.图6是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和鞘脂激活蛋白原(例如，psap或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和鞘脂激活蛋白原的编码序列由内部核糖体进入位点(ires)分开。
23.图7是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。在此实施方案中，所述载体包含cba启动子元件(cba)以组成型表达人gba1的密码子优化的编码序列，所述cba启动子元件由以下四个部分组成：cmv增强子(cmve)、cba启动子(cbap)、外显子1和内含子(int)。3
′
区还含有wpre调控元件，其后是bgh聚a尾。在启动子区的5
′
端包括三个转录调控激活位点：tata、rbs和yy1。侧翼itr允许间插序列的正确包装。评价了5
′
itr序列(插入框)的两个变体；这些变体在野生型aav2 itr的20个核苷酸“d”区域内具有几个核苷酸差异。在一些实施方案中，raav载体含有在顶行显示的“d”结构域核苷酸序列。在一些实施方案中，raav载体包含突变体“d”结构域(例如，具有在底行显示的核苷酸变化的“s”结构域)。
24.图8是描绘图6中所述的载体的一个实施方案的示意图。
25.图9显示在帕金森病的cbe小鼠模型中递送包含编码gcase(例如，gba1或其部分)的转基因的raav的代表性数据。在p8开始每日ip递送pbs媒介物、25mg/kg cbe、37.5mg/kg cbe或50mg/kg cbe(从左到右)。每天检查两次存活(左上)，并且每天检查体重(右上)。所有组均以n＝8开始。通过在p23在空旷场地中行进的总距离(左下)和在p24落在疲劳转棒仪(rotarod)上的等待时间(中下)来评估行为。在有(第3天)和没有(第1天)cbe停用的情况下在pbs和25mg/kg cbe治疗组中均分析在小鼠皮质中gcase底物的水平。将聚集glusph和galsph的水平(右下)显示为pmol/mg组织湿重。给出了平均值。误差条是sem。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001，通过线性回归确定的治疗组的标称p值。
26.图10是描绘cbe小鼠模型中最大raav剂量的研究设计的一个实施方案的示意图。简言之，在p3通过icv注射递送raav，并且在p8开始每日cbe治疗。在p24-25在空旷场地和疲劳转棒仪测定中评估行为，并且在p36和p38测量底物水平。
27.图11显示了cbe小鼠模型中最大raav剂量的活体评估的代表性数据。在p3，通过icv递送用赋形剂或8.8e9 vg raav-gbal来治疗小鼠。在p8开始每日ip递送pbs或25mg/kg cbe。在研究结束时，在p36(第1天)最后一次cbe剂量之后一天将一半小鼠处死，而剩余的一半小鼠经历了在p38(第3天)处死之前的3天cbe停用。每天称重所有治疗组(赋形剂 pbs n＝8，raav-gba1 pbs n＝7，赋形剂 cbe n＝8和变体 cbe n＝9)(左上)，并且分析在p36的体重(右上)。通过在p23在空旷场地中行进的总距离(左下)和在p24落在疲劳转棒仪上的等
待时间(右下)来评估行为，将每只动物评价为3次试验的中值。由于致死率，对于行为测定的赋形剂 cbe组n＝7，而对于所有其他组n＝8。给出了动物中的平均值。误差条是sem。*p＜0.05；***p＜0.001，在cbe治疗动物中通过线性回归确定的治疗组的标称p值。
28.图12显示了cbe小鼠模型中最大raav剂量的生化评估的代表性数据。使用所有治疗组(赋形剂 pbs n＝8、变体 pbs n＝7、赋形剂 cbe n＝7和变体 cbe n＝9)的皮质测量在cbe停用之前(第1天)或之后(第3天)在各组中的gcase活性(左上)、glusph水平(右上)、glucer水平(左下)和载体基因组(右下)。生物分布显示为载体基因组数/1μg基因组dna。给出了平均值。误差条是sem。(*)p＜0.1；**p＜0.01；***p＜0.001，在cbe治疗动物中通过线性回归确定的治疗组的标称p值，其中收集天数和性别作为协变量进行了校正。
29.图13显示了在使用赋形剂 pbs、赋形剂 cbe和变体 cbe治疗组之后cbe小鼠模型中行为和生化相关性的代表性数据。在治疗组之间，在rotarod上的表现与glucer积累呈负相关(a，线性回归p＝0.0012)，并且glusph积累与gcase活性增加呈负相关(b，线性回归p＝0.0086)。
30.图14显示了cbe小鼠模型中变体的生物分布的代表性数据。对于所有治疗组(赋形剂 pbs n＝8、变体 pbs n＝7、赋形剂 cbe n＝7和变体 cbe n＝9)，在肝、脾、肾和生殖腺中评估载体基因组的存在。生物分布显示为载体基因组数/1μg基因组dna。通过定量pcr使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在；通过a260光密度测量评价基因组dna浓度。给出了平均值。误差条是sem。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001，在cbe治疗动物中通过线性回归确定的治疗组的标称p值，其中收集天数和性别作为协变量进行了校正。
31.图15显示了cbe小鼠模型中raav剂量范围的活体评估的代表性数据。小鼠在p3通过icv递送接受赋形剂或三种不同剂量的raav-gba1之一：3.2e9 vg、1.0e10vg或3.2e10vg。在p8，开始25mg/kgcbe的每日ip治疗。接受赋形剂和cbe或赋形剂和pbs的小鼠用作对照。所有治疗组均以每组n＝10(5m/5f)开始。在其最后一次cbe剂量(p38-p40)后一天将所有小鼠处死。每天对所有治疗组称重，并在p36分析它们的重量。通过在p24时落在rotarod上的等待时间和在p30时横穿楔形横梁的等待时间来评估运动表现。由于早期致死性，参与行为测定的小鼠数量为：赋形剂 pbs n＝10、赋形剂 cbe n＝9、以及3.2e9 vg raav-gba1 cbe n＝6、1.0e10vg raav-gba1 cbe n＝10、3.2e10 vg raav-gba1 cbe n＝7。给出了平均值。误差条为sem；*p＜0.05；**p＜0.01，在cbe治疗动物中通过线性回归确定的标称p值，其中性别作为协变量进行了校正。
32.图16显示了cbe小鼠模型中raav剂量范围的生化评估的代表性数据。将所有治疗组(赋形剂 pbs n＝10、赋形剂 cbe n＝9、以及3.2e9 vg raav-gba1 cbe n＝6、1.0e10 vg raav-gba1 cbe n＝10、3.2e10vg raav-gba1 cbe n＝7)的皮质用于测量gcase活性、glusph水平、glucer水平和载体基因组。gcase活性显示为nggcase/mg总蛋白。glusph和glucer水平显示为pmol/mg组织湿重。生物分布显示为载体基因组数/1μg基因组dna。通过定量pcr使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在；通过a260光密度测量评价基因组dna浓度。还在肝脏(e)中测量了载体基因组的存在。给出了平均值。误差条是sem。**d＜0.01；***p＜0.001，在cbe治疗动物中通过线性回归确定的标称p值，其中性别作为协变量进行了校正。
33.图17显示了遗传小鼠模型中最大剂量raav-gba1的楔形横梁分析的代表性数据。
在raav-gba1施用后4周通过横梁行走来测定治疗组(wt 赋形剂(n＝5)、4l/ps-na 赋形剂(n＝6)和4l/ps-na raav-gba1(n＝5))的运动表现。将总滑动数和活动时间显示为在不同横梁上的5次试验的总和。将速度和每个速度下的滑动数显示为在不同横梁上5次试验的平均值。给出了平均值。误差条是sem。
34.图18显示了编码颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白的raav构建体的体外表达的代表性数据。左图显示了颗粒蛋白前体(pgrn)elisa测定的标准曲线。下图显示了在用raav转导的hek293t细胞的细胞裂解物中通过elisa测定测量的pgrn表达的剂量-反应。moi＝感染复数(每个细胞的载体基因组数)。
35.图19显示了编码gba1与鞘脂激活蛋白原(psap)、scarb2和/或一种或多种抑制性核酸组合的raav构建体的体外表达的代表性数据。数据表明，相对于模拟转染细胞，用每种构建体转染hek293细胞导致所关注转基因的过表达。
36.图20是描绘包含位于itr“外部”(例如，相对于转基因插入物或表达构建体在itr的末端近侧)的“d”区的raav载体(顶部)和在载体“内部”(例如，在载体的转基因插入物近侧)具有itr的野生型raav载体的示意图。
37.图21是描绘包含编码gba2或其部分和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
38.图22是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和半乳糖神经酰胺酶(例如，galc或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和半乳糖神经酰胺酶的编码序列的表达由t2a自切割肽序列分开。
39.图23是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和半乳糖神经酰胺酶(例如，galc或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和半乳糖神经酰胺酶的编码序列的表达由t2a自切割肽序列分开。
40.图24是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、组织蛋白酶b(例如，ctsb或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和组织蛋白酶b的编码序列的表达由t2a自切割肽序列分开。
41.图25是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、鞘磷脂磷酸二酯酶1(例如，smpd1或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
42.图26是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和半乳糖神经酰胺酶(例如，galc或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和半乳糖神经酰胺酶的编码序列由内部核糖体进入位点(ires)分开。
43.图27是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和组织蛋白酶b(例如，ctsb或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和组织蛋白酶b的编码序列的表达各自由单独的启动子驱动。
44.图28是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、gch1(例如，gch1其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和gch1的编码序列由t2a自切割肽序列分开。
45.图29是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、rab7l1(例如，rab7l1其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和rab7l1的编码序列由t2a自切割肽序列分开。
46.图30是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、gch1(例如，gch1其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和gch1的编码序列的表达是内部核糖体进入位点(ires)。
47.图31是描绘包含编码vps35(例如，vps35或其部分)以及α-syn和tmem106b的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
48.图32是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)、il-34(例如，il34或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和il-34的编码序列由t2a自切割肽序列分开。
49.图33是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和il-34(例如，il34或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和il-34的编码序列由内部核糖体进入位点(ires)分开。
50.图34是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和trem2(例如，trem2或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和trem2的编码序列的表达各自由单独的启动子驱动。
51.图35是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和il-34(例如，il34或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。gcase和il-34的编码序列的表达各自由单独的启动子驱动。
52.图36a-图36b显示了如通过qpcr和elisa所测量的相对于对照转导细胞trem2和gba1在hek293细胞中的过表达的代表性数据。图36a显示了trem2过表达的数据。图36b显示了来自相同构建体的gba1过表达的数据。
53.图37显示了通过gfp报告子测定(顶部)和α-syn测定(底部)指示在体外成功沉默snca的代表性数据。
54.图38显示了通过gfp报告子测定(顶部)和α-syn测定(底部)指示在体外成功沉默tmem106b的代表性数据。
55.图39是描绘包含编码pgrn的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
56.图40显示了使用具有“d”序列的野生型(圆形)或替代性(例如，“外部”；正方形)放置的itr的raav转导hek293细胞的数据。具有放置于“外部”的itr的raav能够与具有野生型itr的raav一样有效地转导细胞。
57.图41是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
58.图42是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
59.图43是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
60.图44是描绘包含编码pgrn的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
61.图45是描绘包含编码pgrn的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
62.图46是描绘包含编码pgrn和微管相关蛋白tau(mapt)的干扰rna的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
63.图47是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建
体的载体的一个实施方案的示意图。
64.图48是描绘包含编码psap的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
65.图49是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
66.图50是描绘包含编码gcase(例如，gba1或其部分)和半乳糖神经酰胺酶(例如，galc或其部分)的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。
67.图51是描绘包含raav载体的质粒的一个实施方案的示意图，所述raav载体包括编码gcase(例如，gba1或其部分)、鞘脂激活蛋白原(例如，psap或其部分)和α-syn的干扰rna的表达构建体。
68.图52a显示了来自具有ftd-grn突变的患者的ipsc衍生的神经元干细胞(nsc)系比源自健康对照受试者的nsc系分泌更少的颗粒蛋白前体。使用非配对t检验确定统计学；*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。数据表示为平均值
±
sem。
69.图52b显示了ftd-grn突变携带者神经元培养物中剂量范围的pr006a转导的结果。nsc以相同密度接种并分化为神经元。在第7天，将神经元用赋形剂或指定量的pr006a转导72小时。通过elisa测量从细胞培养基中分泌的颗粒蛋白前体表达，并归一化为体积(n＝3-4；平均值
±
sem)。黑色虚线表示从对照神经元(赋形剂治疗的)分泌的颗粒蛋白前体的内源性水平。在赋形剂处理的ftd-grn神经元中无法检出分泌的颗粒蛋白前体。使用anova、随后tukey hsd确定统计学，并且在图上指示了每种条件与赋形剂治疗的对照神经元的统计学比较，*＝p＜0.05，***＝p＜0.001。lloq＝定量下限；moi＝感染复数。
70.图52c显示了pr006处理神经元培养物拯救ftd-grn神经元培养物中关键溶酶体蛋白酶组织蛋白酶d的缺陷性成熟。nsc以相同浓度接种并分化为神经元。在第7天，用赋形剂或pr006a以5.3x105的moi转导神经元72小时。将神经元裂解，并且在蛋白质simplewestern jess系统上用抗组织蛋白酶d(ctsd)一抗分析裂解物。检测与成熟组织蛋白酶d(matctsd)和前组织蛋白酶d(proctsd)两者对应的条带，并且对每个条带的曲线下面积进行定量并归一化为内部总蛋白归一化信号。确定赋形剂或pr006a处理的ftd-grn神经元中的matctsd/proctsd比率；y轴将matctsd/proctsd比率描绘为赋形剂处理的对照神经元的比率百分比(n＝3；平均值
±
sem)。使用配对t检验确定统计学，*＝p＜0.05。
71.图52d和图52f显示了pr006a减少ftd-grn神经元培养物中的tdp-43病理。nsc以相同浓度接种并分化为神经元。在第7天，用赋形剂或pr006a以5.3x105的moi转导神经元，并在转导后21天进行收集。图52d：将神经元裂解，并且分离triton-x不溶性蛋白质级分并在蛋白质simple western jess系统上用抗tdp-43抗体(#12892-ap-1)进行分析。检测与tdp-43对应的条带，并且对每个条带的曲线下面积进行定量并对不溶性级分的总蛋白质浓度进行归一化。y轴将不溶性tdp-43的量描绘为对于每个ftd-grn细胞系单独归一化的赋形剂处理水平的百分比(n＝3；平均值
±
sem)。图52d显示了pr006处理降低ftd-grn神经元培养物中的不溶性tdp-43(ftd-grn病理的标志)。图52f：来自用pr006a处理的ipsc衍生的神经元的免疫荧光图像的核tdp-43信号的定量。确定赋形剂或pr006a处理的ftd-grn神经元中每个细胞核的tdp-43信号强度；y轴将每个细胞核的tdp-43信号强度描绘为赋形剂处理的对照神经元的每个细胞核的tdp-43信号强度百分比(n＝145-306个细胞；平均值
±
sem)。使用抗tdp-43抗体(#12892-ap-1)测量tdp-43，并通过dapi染色确定细胞核面积。图52f显示了
pr006处理使ftd-grn神经元培养物中细胞核tdp-43表达水平增加至接近野生型对照水平。使用非配对t检验确定统计学，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。
72.图52e显示了来自具有ftd-grn突变的患者的ipsc衍生的nsc系比源自健康对照受试者的nsc系表达更少的颗粒蛋白前体。使用非配对t检验确定统计学；*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。数据表示为平均值
±
sem。
73.图52g是显示来自人ftd-grn的神经元干细胞(nsc)系和人对照细胞系成功地分化成神经元培养物的一系列图像。在7天时间段之后，对照和ftd-grn nsc系(ftd-grn#1和ftd-grn#2)分化成神经元，如细胞形态学和神经元标志物的免疫荧光染色所指示(neun[红]；被标记的map2或tau在左侧[绿色])。dapi(蓝色)用于对细胞核染色。
[0074]
图53a-图53c是描绘分析成年剂量范围pr006a ftd-grn小鼠模型研究中cns中的生物分布和颗粒蛋白前体表达的实验结果的一系列条形图。通过icv施用向4月龄grn ko小鼠给予pr006a或赋形剂。在用赋形剂(红色)或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(蓝色)剂量的pr006a治疗3个月之后处死它们用于分析cns中的生化终点。图53a：在大脑皮质和脊髓中评估载体基因组的存在，并且生物分布显示为对数标度上的载体基因组数/μg gdna(n＝8-10/组；平均值
±
sem)。通过qpcr使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。虚线(以50个载体基因组/μg gdna)表示阳性载体存在的阈值。图53b：通过定量rt-pcr(qrt-pcr)评估大脑皮质中的pr006a编码的grn rna表达(n＝8-10/组；平均值
±
sem)。将grn拷贝(对于我们的密码子优化的pr006a序列具有特异性)的数目归一化为1μg总rna并且在对数标度上显示。图53c：使用人特异性颗粒蛋白前体elisa在脑和脊髓中测量颗粒蛋白前体蛋白水平(n＝8-10/组；平均值
±
sem)。将组织颗粒蛋白前体水平归一化为总蛋白质浓度。定量下限(lloq)用灰色虚线表示。对于组织elisa测定，lloq(ng/mg)值通过将测定lloq(ng/ml)除以来自所有样品的总蛋白质浓度平均值来确定。在没有误差条的情况下在x轴上与治疗组图例颜色对应的简单线指示该组中的所有动物为0。使用anova、随后dunnett检验进行统计分析，以与赋形剂治疗的grn ko小鼠组进行比较；*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001；vg＝载体基因组；lloq＝定量下限；sc＝脊髓。
[0075]
图53d-图53e是描绘分析成年剂量范围pr006a ftd-grn小鼠模型研究中外周组织生物分布和颗粒蛋白前体表达的实验结果的一系列条形图。通过icv施用向4月龄grn ko小鼠给予pr006a或赋形剂。在用赋形剂(红色)或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(蓝色)剂量的pr006a治疗3个月之后处死它们用于分析肝、心脏、肺、肾、脾和生殖腺中的生化终点。图53d：评估载体基因组的存在，并且生物分布显示为对数标度上的载体基因组数/μg gdna(n＝8-10/组；平均值
±
sem)。通过qpcr使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。虚线(以50个载体基因组/μg gdna)表示阳性载体存在的阈值。图53e：使用elisa测量颗粒蛋白前体蛋白水平(n＝8-10/组；平均值
±
sem)。将组织颗粒蛋白前体水平归一化为总蛋白质浓度。在没有误差条的情况下在x轴上与治疗组图例颜色对应的简单线指示该组中的所有动物为0。使用anova、随后dunnett检验进行统计分析，以与赋形剂处理的grn ko小鼠组进行比较；*＝p＜0.05，***＝p＜0.001。vg＝载体基因组。
[0076]
图53f是描绘分析成年剂量范围pr006a ftd-grn小鼠模型研究中血浆中的颗粒蛋
白前体水平的实验结果的条形图。通过icv施用向4月龄grn ko小鼠给予pr006a或赋形剂。在用赋形剂(红色)或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(蓝色)剂量的pr006a治疗3个月之后处死它们用于分析血浆中的生化终点。使用人特异性颗粒蛋白前体elisa在血浆中测量颗粒蛋白前体蛋白水平(n＝8-10/组；平均值
±
sem)。在对数标度上显示血浆水平。定量下限(lloq)用灰色虚线表示。使用anova、随后dunnett检验进行统计分析，以与赋形剂处理的grn ko小鼠组进行比较；*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。lloq＝定量下限。vg＝载体基因组。
[0077]
图53g-图53h是描绘了显示在成年剂量范围pr006a ftd-grn成年小鼠模型研究中的溶酶体和神经病理学缺陷减少的实验结果的一系列条形图。通过icv施用向4月龄grn ko小鼠给予pr006a或赋形剂。在用赋形剂(红色)或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(蓝色)剂量的pr006a治疗3个月之后处死它们用于分析。通过两种独立的方法分析脂褐质沉积症：(1)病理学家对h&e染色的脑切片进行评分，和(2)定量来自ihc切片的脂褐质自发荧光。图53g：根据以下分级方案由盲法委员会认证的病理学家在不同脑区域的h&e染色切片中对脂褐质积累(自发荧光脂褐质颗粒)进行半定量评分：0＝未观察到脂褐质；1＝非常小的脂褐质颗粒(＜2μm)分散在整个区域；2＝小颗粒积累的密度增加，和/或较大颗粒的发展(＞2-3μm)；3＝多焦点区域具有从低客观能力可见的高密度脂褐质颗粒的；4＝广泛的脂褐质积累。显示了在大脑皮质、海马体和丘脑/下丘脑脑区域中的脂褐质严重性得分(n＝8-10/组)。图53h：在大脑皮质、海马体和丘脑中进行泛素的ihc分析并定量。对于泛素显示了阈值以上的免疫反应性对象的大小(免疫反应性对象大小[μm2](n＝8-10/组；平均值
±
sem)。通过anova、随后dunnett检验确定统计学，以与赋形剂处理的grn ko小鼠组进行比较，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001；vg＝载体基因组；wt＝野生型。
[0078]
图53i-图53k是描绘显示在成年剂量范围的pr006a ftd-grn小鼠模型研究中降低的神经炎症标志物的实验结果的一系列条形图。通过icv施用向4月龄grn ko小鼠给予pr006a或赋形剂。在用赋形剂(红色)或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(蓝色)剂量的pr006a治疗3个月之后处死它们用于分析。图53i：通过qrt-pcr在躯体感觉皮质中测量tnf和cd68的基因表达(mrna水平)(平均值
±
sem；n＝8-10/组)。将基因表达归一化为管家基因ppib。图53j-图53k：在大脑皮质、海马体和丘脑中在固定脑切片中进行iba1(图53j)和gfap(图53k)的ihc分析并定量。显示了由阈值以上的对象覆盖的所关注区域的百分比(免疫反应性面积[％])(平均值
±
sem；n＝8-10/组)。使用anova与dunnett调整确定统计学，比较各组与赋形剂治疗的grn ko小鼠组，*＝p＜0.05，***＝p＜0.001。vg＝载体基因组；wt＝野生型。
[0079]
图53l-图53n是描绘显示在成年剂量范围的pr006a ftd-grn小鼠模型研究中的溶酶体和免疫途径的基因表达降低的实验结果的一系列条形图。通过icv施用向4月龄grn ko小鼠给予pr006a或赋形剂。在用赋形剂(红色)或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(蓝色)剂量的pr006a治疗3个月之后处死它们用于分析。在来自icv治疗的grn ko小鼠和来自年龄匹配的wt c57bl/6j小鼠(灰色)的大脑皮质样品中进行rna测序。使用基因集变异分析(gsva)方法比较先前公开的基因标签的mrna表达水平，与wt小鼠相比所述基因标签在赋形剂治疗的grnko小鼠中失调。所显示的
数据是来自两个公开的研究和一个hallmark途径的共识(curated)基因集的gsva活性得分。图53l：细胞组分：液泡(go：0005773)，图53m：溶酶体，以及图53n：补体系统(hallmark途径)(中位数
±
范围；n＝8-10/组)。使用anova、随后dunnett检验进行统计分析，以与赋形剂处理的grn ko小鼠组进行比较，同时控制家族式i型错误率，***＝p＜0.001。gsva＝基因集变异分析；vg＝载体基因组；wt＝野生型。
[0080]
图54a是描绘分析通过qpcr定量的pr006a转基因的生物分布的实验结果的一系列条形图。在icm注射赋形剂、低剂量的pr006a(6.5
×
109vg/g脑)或高剂量的pr006a(6.5
×
10
10
vg/g脑)之后182天使用qpcr方法在nhp中分析了转基因水平。各个条代表每组3只动物的平均值
±
sem；黄色线指示在50vg/μg dna下的定量下限。
[0081]
图54b是描绘分析针对人颗粒蛋白前体的抗药物抗体水平的实验结果的一系列条形图。在用赋形剂、低剂量的pr006a(6.5x109vg/g脑)或高剂量的pr006a(6.5x10
10
vg/g脑)治疗后第29天和第182天在nhp血清和csf样品中的针对颗粒蛋白前体的抗体。数据表示平均值
±
sem。
[0082]
图54c是描绘分析pr006a转基因(grn)表达的实验结果的一系列条形图。使用rt-qpcr在第183天收集的nhp皮质、海马体和腹侧中脑中确定grn表达水平。数据表示为平均值
±
sem。
[0083]
图54d是描绘分析通过simple western
tm
(jess)平台定量的csf中的颗粒蛋白前体水平的实验结果的条形图。在第183天收集的nhpcsf样品中确定颗粒蛋白前体水平，通过simple western
tm
(jess)分析进行确定。来自用赋形剂、低剂量的pr006a(6.5
×
109vg/g脑重量)或高剂量的pr006a(6.5
×
10
10
vg/g脑重量)治疗的nhp的csf样品。所呈现的数据是平均值
±
sem；p值：*p＜0.05，通过使用william趋势检验的单向剂量依赖性反应分析。
[0084]
图55是显示自动化western jess测定的选择性和特异性结果的图。在ftd患者csf样品中的颗粒蛋白前体蛋白水平由jess检测为58kda。组(a)：杂合的ftd患者以及组(b)和(c)：家族性非携带者或正常个体。数据表示为平均值
±
该平均值的标准误差(sem)。sem值显示为垂直误差条。
[0085]
图56是显示通过elisa检测的ftd患者csf样品中的颗粒蛋白前体水平的图。组(a)：杂合的ftd患者以及组(b)和(c)：家族性非携带者或正常个体。数据表示为平均值
±
该平均值的标准误差(sem)。sem值显示为垂直误差条。
[0086]
图57是在jess自动化western平台上一式两份运行的每个csf样品的凝胶图像。使用一抗adipogen pg-359-7以4倍稀释度分析样品。第一泳道是分子量标准品，并且在右边是用于计算实施例14中报道的免疫反应性的条带鉴定物。
[0087]
图58a-图58b是显示人pgrn表达水平的测量的一系列图。使用simple western
tm
(jess)分析在第180天收集的非人灵长类(nhp)csf样品中确定人pgrn表达水平。分析了来自用赋形剂(“赋形剂”)、低剂量的pr006a(6.5x109vg/g脑重量；“低”)或高剂量的pr006(6.5x10
10
vg/g脑重量；“高”)治疗的nhp的csf。数据表示为平均免疫反应性峰面积(图58a)，或相对于赋形剂治疗的动物的倍数变化(图58b)。每个点代表来自一个nhp的单个csf样品(技术重复的平均值)，并且方框代表三个单独nhp的平均值 /-标准误差。
[0088]
图59a-图59c是描绘分析在pr006a治疗后在年老ftd-grn小鼠模型中的cns中的生物分布和颗粒蛋白前体表达的实验结果的一系列条形图。在接受icv赋形剂(红色)或
9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)pr006a(蓝色)之后2个月，从18月龄grn ko小鼠收集组织样品。图59a：在大脑皮质和脊髓中评估载体基因组的存在(平均值
±
sem；n＝4/组)。生物分布显示为在对数标度上的载体基因组数/1μg gdna。通过qpcr使用载体参考标准曲线来定量载体基因组的存在。虚线(以50个载体基因组/μg gdna)表示阳性载体存在的阈值。图59b-图59c：使用elisa在cns组织(脑和脊髓(图59b))和csf(图59c)中测量颗粒蛋白前体蛋白水平(平均值
±
sem；n＝4/组)。组织颗粒蛋白前体水平归一化为总蛋白质浓度，并且csf颗粒蛋白前体水平归一化为流体体积。定量下限(lloq)用灰色虚线表示。对于组织elisa测定，lloq(ng/mg)值通过将测定lloq(ng/ml)除以来自所有样品的总蛋白质浓度平均值来确定。在没有误差条的情况下在x轴上的简单红线表示该组中的所有动物为0。使用kruskal-wallis进行统计分析；*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。vg＝载体基因组；lloq＝定量下限；sc＝脊髓。
[0089]
图59d-图59e是描绘显示在pr006a治疗后在年老ftd-grn小鼠模型中的溶酶体和神经病理学缺陷减少的实验结果的一系列条形图和图像。在接受icv赋形剂(红色)或9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)pr006a(蓝色)之后2个月，从18月龄grn ko小鼠收集组织样品。通过病理学家对h&e染色的脑切片评分来分析脂褐质沉积症。图59d：来自脑切片的丘脑/下丘脑区域的代表性脂褐质图像。白色箭头指示脂褐质积累的实例。提供了来自进行自发荧光脂褐质颗粒评价的脑切片的h&e染色载波片的大脑皮质、海马体和丘脑/下丘脑中的脂褐质严重性得分的汇总。根据以下分级方案由盲法委员会认证的病理学家对脂褐质积累半定量评分：0＝未观察到脂褐质；1＝非常小的脂褐质颗粒(＜2μm)分散在整个区域；2＝小颗粒积累的密度增加，和/或较大颗粒的发展(＞2-3μm)；3＝多焦点区域具有从低客观能力可见的高密度脂褐质颗粒；4＝广泛的脂褐质积累。图59e：在大脑皮质、海马体和丘脑中进行泛素的ihc分析(n＝4/组)并定量。显示了每个区域的阳性细胞密度(细胞/mm2)(平均值
±
sem)。使用t检验确定统计学，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01。vg＝载体基因组。
[0090]
图59f-图59i是描绘显示在pr006a治疗后在年老ftd-grn小鼠模型中的神经炎症标志物减少的实验结果的一系列条形图。在接受icv赋形剂(红色)或9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)pr006a(蓝色)之后2个月，从18月龄grn ko小鼠收集组织样品。图59f：通过qrt-pcr在躯体感觉皮质中测量tnf和cd68的基因表达(平均值
±
sem；n＝4/组)。将基因表达归一化为管家基因ppib。(图59g)使用中尺度发现(mesoscale discovery)小鼠促炎症细胞因子测定在大脑皮质中测量了促炎症细胞因子tnfα的蛋白质表达(平均值
±
sem；n＝4/组)。将大脑皮质匀质化，并将蛋白质表达水平归一化为组织裂解物的总蛋白质浓度。图59h-图59i：在固定的脑切片中进行iba1(图59h)和gfap(图59i)的ihc分析并定量。显示了来自所分析的三个脑区域(大脑皮质、海马体和丘脑)的阳性细胞密度(细胞/mm2)的汇编(平均值
±
sem；n＝3-4/组)。使用t检验进行统计分析，*＝p＜0.05。vg＝载体基因组。
[0091]
图60是描绘用pr006a转导的hek293t细胞的剂量-反应曲线的图(n＝2；平均值
±
sem)。用不同量的pr006a转导相等数量的细胞。72小时之后，使用elisa测定测量了细胞培养基中的颗粒蛋白前体蛋白水平。
[0092]
图61是在年老ftd-grn小鼠模型中的最大剂量pr006a的研究设计图。将10μl赋形剂(对照)或pr006a以9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)的剂量通过icv注射递送至两个grn ko小鼠群组中：(1)注射时16月龄(n＝4-5/组；prv-2018-027)和(2)注射时14月龄(n＝1/赋形
剂治疗组；n＝3/pr006a治疗组；prv-2019-002)。注射之后两个月时将动物处死。收集cns和外周组织以分析pr006a生物分布(qpcr)、颗粒蛋白前体蛋白表达(elisa)和组织病理学(h&e)。评估脑中的促炎症标志物的表达、脂褐质积累和泛素积累。
[0093]
图62a-图62b是显示在pr006a治疗后在年老ftd-grn小鼠模型中的外周组织生物分布和颗粒蛋白前体表达结果的条形图。在接受icv赋形剂(红色)或9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)pr006a(蓝色)之后2个月，从18月龄grn ko小鼠收集组织样品。图62a：在肝、心脏、肺、肾、脾和生殖腺中评估载体基因组的存在(平均值
±
sem；n＝4/组)。生物分布显示为在对数标度上的载体基因组数/μg gdna。通过qpcr使用载体参考标准品定量载体基因组的存在。图62b：使用elisa测量了颗粒蛋白前体蛋白水平(平均值
±
sem；n＝4/组)。将组织颗粒蛋白前体水平归一化为总蛋白质浓度。在没有误差条的情况下在x轴上的简单红线指示该组中的所有动物为0。使用kruskal-wallis进行统计分析；*＝p＜0.05，**＝p＜0.01，***＝p＜0.001。vg＝载体基因组。
[0094]
图63是在成年ftd-grn小鼠模型中的剂量范围的pr006a的研究设计图，将10μl赋形剂(对照)或pr006a以1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)或1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)pr006a的剂量通过icv注射递送至4月龄grn ko小鼠中(n＝10/组)。注射之后三个月当小鼠为7月龄时，将动物处死。收集cns和外周组织以分析pr006a生物分布(qpcr)、颗粒蛋白前体蛋白表达(elisa)和组织病理学(h&e)。评估脑中的促炎症标志物的表达、脂褐质积累、泛素积累和总体基因表达变化。
[0095]
图64是描绘包含编码人颗粒蛋白前体的表达构建体的重组腺相关病毒载体(pr006a)的一个实施方案的示意图。“bp”是指“碱基对”。“kan”是指赋予卡那霉素抗性的基因。“grn”是指“颗粒蛋白前体”。“itr”是指腺相关病毒反向末端重复序列。“try”是指包含三个转录调控激活位点tata、rbs和yy1的序列。“cbap”是指鸡β肌动蛋白启动子。“cmve”是指巨细胞病毒增强子。“wpre”是指土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。“bgh”是指牛生长激素聚a信号尾。“iht”是指内含子。pr006a的两条链的核苷酸序列在seq id no：90和91中提供。
具体实施方式
[0096]
本公开部分地基于用于在受试者中表达某些基因产物(例如，与cns疾病相关的基因产物)的组合的组合物和方法。基因产物可以是蛋白质、蛋白质片段(例如部分)、抑制cns疾病相关基因的干扰核酸等。在一些实施方案中，基因产物是由cns疾病相关基因编码的蛋白质或蛋白质片段。在一些实施方案中，基因产物是抑制cns疾病相关基因的干扰核酸(例如shrna、sirna、mirna、amirna等)。
[0097]
cns疾病相关基因是指编码基因产物的基因，所述基因产物在遗传上、在生化上或在功能上与cns疾病(诸如ftd(额颞叶痴呆)或pd(帕金森病))相关。例如，在grn基因(其编码蛋白质pgrn)中具有致病性突变的个体与在grn中不具有突变的个体相比具有增加的发生ftd的风险。类似地，已经观察到在gba1基因(其编码蛋白质gcase)中具有突变的个体与在gba1中不具有突变的个体相比具有增加的发生pd的风险。在另一个实例中，pd与包含α突触核蛋白(α-syn)蛋白质的蛋白质聚集体的积累相关；因此，snca(其编码α-syn)是pd相关基因。在一些实施方案中，本文所述的表达盒编码cns疾病相关基因(或其编码序列)的野生型或非突变型形式。cns疾病相关基因的实例列于表1中。
[0098]
表1：cns疾病相关基因的实例
[0099]
[0100][0101]
除了戈谢病患者(其在gba1基因的两个染色体等位基因中都具有突变)之外，仅在gba1的一个等位基因中具有突变的患者处于帕金森病(pd)的高度增加的风险中。pd症状(其包括步态困难、休息时的震颤、僵硬和经常抑郁、睡眠困难和认知衰退)的严重性与酶活性降低的程度相关。因此，戈谢病患者具有最严重的病程，然而在gba1中具有单一轻度突变的患者通常具有更良性的病程。突变携带者还具有其他pd相关病症(包括路易体痴呆(特征在于执行功能障碍、精神病和pd样运动障碍)、以及具有特征性运动和认知缺损的多系统萎缩症)的高风险。没有任何疗法可以改变这些病症的不可阻挡的病程。
[0102]
酶诸如gcase(例如，gba1基因的基因产物)的缺陷、以及涉及溶酶体功能或大分子运输至溶酶体的许多基因(例如，溶酶体膜蛋白1(limp)，也称为scarb2)中的常见变体，已经与增加的pd风险和/或戈谢病(例如，神经元病性戈谢病，诸如2型戈谢病或3型戈谢病)风险相关。本公开部分地基于编码与中枢神经系统(cns)疾病(例如戈谢病、pd等)相关的一种或多种基因(例如gcase、gba2、鞘脂激活蛋白原、颗粒蛋白前体(pgrn)、limp2、galc、ctsb、smpd1、gch1、rab7、vps35、il-34、trem2、tmem106b或任何前述基因(或其部分)的组合)的表达构建体(例如载体)。在一些实施方案中，本文所述的基因产物的组合当在受试者中表达时一起(例如协同地)发挥作用以减少cns疾病的一种或多种体征和症状。
[0103]
因此，在一些方面，本公开提供了包含编码gcase(例如，gba1基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的gcase编码序列。在一些实施方案中，编码gcase的核酸序列编码包含如seq id no：14所示(例如，如ncbi参考序列np_000148.2所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：
15所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码gcase蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0104]
在一些方面，本公开提供了包含编码鞘脂激活蛋白原(例如，psap基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的鞘脂激活蛋白原编码序列。在一些实施方案中，编码鞘脂激活蛋白原的核酸序列编码包含如seq id no：16所示(例如，如ncbi参考序列np_002769.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：17所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码鞘脂激活蛋白原蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0105]
在一些方面，本公开提供了包含编码limp2/scarb2(例如，scarb2基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的scarb2编码序列。在一些实施方案中，编码limp2/scarb2的核酸序列编码包含如seq id no：18所示(例如，如ncbi参考序列np_005497.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：29所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码scarb2蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0106]
在一些方面，本公开提供了包含编码gba2蛋白(例如，gba2基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的gba2编码序列。在一些实施方案中，编码gba2的核酸序列编码包含如seq id no：30所示(例如，如ncbi参考序列np_065995.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：31所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码gba2蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0107]
在一些方面，本公开提供了包含编码galc蛋白(例如，galc基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的galc编码序列。在一些实施方案中，编码galc的核酸序列编码包含如seq id no：33所示(例如，如ncbi参考序列np_000144.2所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：34所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码galc蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0108]
在一些方面，本公开提供了包含编码ctsb蛋白(例如，ctsb基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的ctsb编码序列。在一些实施方案中，编码ctsb的核酸序列编码包含如seq id no：35所示(例如，如ncbi参考序列np_001899.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：36所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码ctsb蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0109]
在一些方面，本公开提供了包含编码smpd1蛋白(例如，smpd1基因的基因产物)的
表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的smpd1编码序列。在一些实施方案中，编码smpd1的核酸序列编码包含如seq id no：37所示(例如，如ncbi参考序列np_000534.3所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：38所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码smpd1蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0110]
在一些方面，本公开提供了包含编码gch1蛋白(例如，gch1基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的gch1编码序列。在一些实施方案中，编码gch1的核酸序列编码包含如seq id no：45所示(例如，如ncbi参考序列np_000534.3所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：46所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码gch1蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0111]
在一些方面，本公开提供了包含编码rab7l蛋白(例如，rab7l基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的rab7l编码序列。在一些实施方案中，编码rab7l的核酸序列编码包含如seq id no：47所示(例如，如ncbi参考序列np_003920.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：48所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码rab7l蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0112]
在一些方面，本公开提供了包含编码vps35蛋白(例如，vps35基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的vps35编码序列。在一些实施方案中，编码vps35的核酸序列编码包含如seq id no：49所示(例如，如ncbi参考序列np_060676.2所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：50所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码vps35蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0113]
在一些方面，本公开提供了包含编码il-34蛋白(例如，il34基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的il-34编码序列。在一些实施方案中，编码il-34的核酸序列编码包含如seq id no：55所示(例如，如ncbi参考序列np_689669.2所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：56所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码il-34蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0114]
在一些方面，本公开提供了包含编码trem2蛋白(例如，trem基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的trem2编码序列。在一些实施方案中，编码trem2的核酸序列编码包含如seq id no：57所示(例如，如ncbi参考序列np_061838.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：
58所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码trem2蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0115]
在一些方面，本公开提供了包含编码tmem106b蛋白(例如，tmeml06b基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的tmem106b编码序列。在一些实施方案中，编码tmem106b的核酸序列编码包含如seq id no：63所示(例如，如ncbi参考序列np_060844.2所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：64所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码tmem106b蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0116]
在一些方面，本公开提供了包含编码颗粒蛋白前体(例如，pgrn基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的鞘脂激活蛋白原编码序列。在一些实施方案中，编码颗粒蛋白前体(pgrn)的核酸序列编码包含如seq id no：67所示(例如，如ncbi参考序列np_002078.1所示)的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：68所示的序列。在一些实施方案中，表达构建体包含腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，例如位于编码鞘脂激活蛋白原蛋白的核酸序列侧翼的aav itr。
[0117]
在一些方面，本公开提供了包含编码第一基因产物和第二基因产物的表达构建体的分离的核酸，其中每个基因产物独立地选自表1中所示的基因产物或其部分。
[0118]
在一些实施方案中，第一基因产物或第二基因产物是gcase蛋白或其部分。在一些实施方案中，第一基因产物是gcase蛋白并且第二基因产物选自gba2、鞘脂激活蛋白原、颗粒蛋白前体、limp2、galc、ctsb、smpd1、gch1、rab7、vps35、il-34、trem2和tmem106b。
[0119]
在一些实施方案中，表达构建体编码(例如，单独或除了另一基因产物以外)干扰核酸(例如，shrna、mirna、dsrna等)。在一些实施方案中，干扰核酸抑制α突触核蛋白(α-synuclein)的表达。在一些实施方案中，靶向α突触核蛋白的干扰核酸包含如seq id no：20-25中任一者所示的序列。在一些实施方案中，靶向α突触核蛋白的干扰核酸与如seq id no：20-25中任一者所示的序列结合(例如，杂交)。
[0120]
在一些实施方案中，干扰核酸抑制tmem106b的表达。在一些实施方案中，靶向tmem106b的干扰核酸包含如seq id no：64或65所示的序列。在一些实施方案中，靶向tmem106b的干扰核酸与如seq id no：64或65所示的序列结合(例如，杂交)。
[0121]
在一些实施方案中，表达构建体还包含一个或多个启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白(cba)启动子、cag启动子、cd68启动子或jet启动子。在一些实施方案中，启动子是rna pol ii启动子(例如，或rna pol iii启动子(例如，u6等)。
[0122]
在一些实施方案中，表达构建体还包含内部核糖体进入位点(ires)。在一些实施方案中，ires位于第一基因产物与第二基因产物之间。
[0123]
在一些实施方案中，表达构建体还包含自切割肽编码序列。在一些实施方案中，自切割肽是t2a肽。
[0124]
在一些实施方案中，表达构建体包含两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)序列。在一些实施方案中，itr序列位于第一基因产物和第二基因产物侧翼(例如，从5′
端至3
′
端如下排列：itr-第一基因产物-第二基因产物-itr)。在一些实施方案中，分离的核酸的itr序列之一缺乏功能性末端分辨位点(terminal resolution site，trs)。例如，在一些实施方案中，itr之一是δitr。
[0125]
在一些方面，本公开涉及包含具有经修饰的“d”区(例如，相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)经修饰的d序列)的itr的raav载体。在一些实施方案中，具有经修饰的d区的itr是raav载体的5
′
itr。在一些实施方案中，经修饰的“d”区包含“s”序列，例如，如seq id no：26所示。在一些实施方案中，具有经修饰的“d”区的itr是raav载体的3
′
itr。在一些实施方案中，经修饰的“d”区包含3
′
itr，其中所述“d”区位于itr的3
′
端(例如，相对于载体的转基因插入物在itr的外部或终末端)。在一些实施方案中，经修饰的“d”区包含如seq id no：26或27所示的序列。
[0126]
在一些实施方案中，分离的核酸(例如raav载体)包含try区。在一些实施方案中，try区包含如seq id no：28所示的序列。
[0127]
在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸包含具有如seq id no：1-91中任一者所示的序列的肽或由其组成，或编码具有如seq id no：1-91中任一者所示的序列的肽。
[0128]
在一些方面，本公开提供了包含如本公开所描述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是重组aav(raav)载体或杆状病毒载体。在一些实施方案中，raav载体是单链的(例如单链dna)。
[0129]
在一些实施方案中，本公开提供了包含如本公开所描述的分离的核酸或如本公开所描述的载体的宿主细胞。
[0130]
在一些实施方案中，本公开提供了包含衣壳蛋白和如本公开所描述的分离的核酸或载体的重组腺相关病毒(raav)。
[0131]
在一些实施方案中，衣壳蛋白能够穿过血脑屏障，例如aav9衣壳蛋白或aavrh.10衣壳蛋白。在一些实施方案中，raav转导中枢神经系统(cns)的神经元细胞和非神经元细胞。
[0132]
在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有中枢神经系统(cns)疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)。在一些实施方案中，cns疾病是神经退行性疾病，诸如表12中所列出的神经退行性疾病。在一些实施方案中，cns疾病是突触核蛋白病，诸如表13中所列出的突触核蛋白病。在一些实施方案中，cns疾病是tau蛋白病，诸如表14中所列出的tau蛋白病。在一些实施方案中，cns疾病是溶酶体贮积病，诸如表15中所列出的溶酶体贮积病。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是神经元病性戈谢病，诸如2型戈谢病或3型戈谢病。
[0133]
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)。
[0134]
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有额颞叶痴呆(ftd)、具有grn突变的ftd、具有tau突变的ftd、具有c9orf72突变的ftd、蜡样脂褐质沉积症、帕金森病、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)、皮质基底节变性、运动神经元疾病或戈谢病的
受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav，其中所述pgrn由seq id no：68的核酸序列编码；以及其中所述raav包含具有aav9血清型的衣壳蛋白。
[0135]
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav，其中所述pgrn由seq id no：68的核酸序列编码；以及其中所述raav包含具有aav9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav以约3.5
×
10
13
个载体基因组(vg)、约7.0
×
10
13
vg或约1.4
×
10
14
vg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，所述raav通过注射到小脑延髓池中来施用。
[0136]
在一些实施方案中，组合物包含编码两种或更多种基因产物(例如cns疾病相关的基因产物)，例如本技术中所描述的2种、3种、4种、5种或更多种基因产物的核酸(例如raav基因组，例如被aav衣壳蛋白衣壳化)。在一些实施方案中，组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种或更多种)不同的核酸(例如，两种或更多种raav基因组，例如分别被aav衣壳蛋白衣壳化)，每种编码一种或多种不同的基因产物。在一些实施方案中，将两种或更多种不同的组合物施用于受试者，每种组合物包含一种或多种编码不同基因产物的核酸。在一些实施方案中，不同的基因产物可操作地连接至相同的启动子类型(例如，相同的启动子)。在一些实施方案中，不同的基因产物可操作地连接至不同的启动子。
[0137]
分离的核酸和载体
[0138]
分离的核酸可以是dna或rna。在一些方面，本公开提供了分离的核酸(例如raav载体)，其包含编码一种或多种pd相关基因(例如gcase(例如，gba1基因的基因产物)或其部分)的表达构建体。gcase，也称为β葡糖脑苷脂酶或gba，是指切割化学葡糖脑苷脂(糖脂代谢中的中间体)的β糖苷键的溶酶体蛋白质。在人类中，gcase由位于第1号染色体上的gba1基因编码。在一些实施方案中，gba1编码由ncbi参考序列ncbi参考序列np_000148.2表示的肽(seq id no：14)。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的gcase编码序列，诸如seq id no：15所示的序列。
[0139]
在一些方面，本公开提供了包含编码鞘脂激活蛋白原(例如，psap基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。鞘脂激活蛋白原是鞘脂激活蛋白(鞘脂激活蛋白(saposin))a、b、c和d的前体糖蛋白，其促进具有短的寡糖基团的糖鞘脂的分解代谢。在人类中，psap基因位于第10号染色体上。在一些实施方案中，psap编码由ncbi参考序列np_002769.1表示的肽(例如，seq id no：16)。在一些实施方案中，分离的核酸包含已被密码子优化(例如，针对在哺乳动物细胞例如人细胞中的表达进行密码子优化)的鞘脂激活蛋白原编码序列，诸如seq id no：17所示的序列。
[0140]
本公开的方面涉及包含编码limp2/scarb2(例如，scarb2基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。scarb2是指调节细胞内的溶酶体和内体转运的膜蛋白。在人类中，scarb2基因位于第4号染色体上。在一些实施方案中，scarb2基因编码由ncbi参考序列np_005497.1表示的肽(seq id no：18)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：19所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的scarb2编码序列。
[0141]
本公开的方面涉及包含编码gba2蛋白(例如，gba2基因的基因产物)的表达构建体
的分离的核酸。gba2蛋白是指非溶酶体葡糖神经酰胺酶。在人类中，gba2基因位于第9号染色体上。在一些实施方案中，gba2基因编码由ncbi参考序列np_065995.1表示的肽(seq id no：30)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：31所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的gba2编码序列。
[0142]
本公开的方面涉及包含编码galc蛋白(例如，galc基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。galc蛋白是指半乳糖神经酰胺酶(或半乳糖脑苷脂酶)，其是水解半乳糖脑苷脂、半乳糖鞘氨醇、乳糖神经酰胺和单半乳糖二酯酰甘油的半乳糖酯键的酶。在人类中，galc基因位于第14号染色体上。在一些实施方案中，galc基因编码由ncbi参考序列np_000144.2表示的肽(seq id no：33)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：34所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的galc编码序列。
[0143]
本公开的方面涉及包含编码ctsb蛋白(例如，ctsb基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。ctsb蛋白是指组织蛋白酶b，其是在细胞内蛋白水解中起重要作用的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。在人类中，ctsb基因位于第8号染色体上。在一些实施方案中，ctsb基因编码由ncbi参考序列np_001899.1表示的肽(seq id no：35)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：36所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的ctsb编码序列。
[0144]
本公开的方面涉及包含编码smpd1蛋白(例如，smpd1基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。smpd1蛋白是指鞘磷脂磷酸二酯酶1，其是参与鞘脂代谢的水解酶。在人类中，smpd1基因位于第11号染色体上。在一些实施方案中，smpd1基因编码由ncbi参考序列np_000534.3表示的肽(seq id no：37)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：38所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的smpd1编码序列。
[0145]
本公开的方面涉及包含编码gch1蛋白(例如，gch1基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。gch1蛋白是指gtp环水解酶i，其是作为叶酸和生物蝶呤生物合成途径的一部分的水解酶。在人类中，gch1基因位于第14号染色体上。在一些实施方案中，gch1基因编码由ncbi参考序列np_000152.1表示的肽(seq id no：45)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：46所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的gch1编码序列。
[0146]
本公开的方面涉及包含编码rab7l蛋白(例如，rab7l基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。rab7l蛋白是指rab7，成员ras癌基因家族样1，其是gtp结合蛋白。在人类中，rab7l基因位于第1号染色体上。在一些实施方案中，rab7l基因编码由ncbi参考序列np_003920.1表示的肽(seq id no：47)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：48所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的rab7l编码序列。
[0147]
本公开的方面涉及包含编码vps35蛋白(例如，vps35基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。vps35蛋白是指液泡蛋白分选相关蛋白35，其是参与蛋白质从内体逆向转运到反式高尔基体网络的蛋白质复合物的一部分。在人类中，vps35基因位于第16号染色体上。在一些实施方案中，vps35基因编码由ncbi参考序列np_060676.2表示的肽(seq id no：49)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：50所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的vps35编码序列。
[0148]
本公开的方面涉及包含编码il-34蛋白(例如，il34基因的基因产物)的表达构建
体的分离的核酸。il-34蛋白是指白细胞介素34，其是增加单核细胞生长和存活的细胞因子。在人类中，il34基因位于第16号染色体上。在一些实施方案中，il34基因编码由ncbi参考序列np_689669.2表示的肽(seq id no：55)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：56所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的il-34编码序列。
[0149]
本公开的方面涉及包含编码trem2蛋白(例如，trem2基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。trem2蛋白是指在骨髓细胞2上表达的触发性受体，其是在骨髓细胞上发现的免疫球蛋白超家族受体。在人类中，trem2基因位于第6号染色体上。在一些实施方案中，trem2基因编码由ncbi参考序列np_061838.1表示的肽(seq id no：57)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：58所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的trem2编码序列。
[0150]
本公开的方面涉及包含编码tmem106b蛋白(例如，tmem106b基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。tmem106b蛋白是指跨膜蛋白106b，其是参与树突形态发生和调节溶酶体运输的蛋白质。在人类中，tmem106b基因位于第7号染色体上。在一些实施方案中，tmem106b基因编码由ncbi参考序列np_060844.2表示的肽(seq id no：62)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：63所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的tmem106b编码序列。
[0151]
本公开的方面涉及包含编码颗粒蛋白前体蛋白(例如，pgrn基因的基因产物)的表达构建体的分离的核酸。pgrn蛋白是指颗粒蛋白前体，其是参与发育、炎症、细胞增殖和蛋白稳态的蛋白质。在人类中，pgrn基因位于第17号染色体上。在一些实施方案中，pgrn基因编码由ncbi参考序列np_002078.1表示的肽(seq id no：67)。在一些实施方案中，分离的核酸包含如seq id no：68所示的序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含已经过密码子优化的pgrn编码序列。在一些实施方案中，所述核酸还包含鸡β肌动蛋白(cba)启动子和巨细胞病毒增强子(cmve)。
[0152]
在一些方面，本公开提供了用于定量脑脊液(csf)样品中的pgrn蛋白水平的自动化western印迹免疫测定。在一些实施方案中，免疫测定是基于毛细管的自动化western印迹免疫测定平台，其中所有步骤诸如蛋白质分离、免疫探测、洗涤和通过化学发光进行的检测均发生在毛细管卡盒中。在一些实施方案中，csf样品来自人或非人灵长类动物。在一些方面，免疫测定允许在循环抗体的存在下检测pgrn蛋白水平的差异。在一些方面，本公开提供了定量csf样品中颗粒蛋白前体蛋白水平的方法，所述方法包括：(1)稀释csf样品(例如，4倍稀释)；(2)向毛细管卡盒的孔中加载所述csf样品；抗颗粒蛋白前体抗体；检测抗颗粒蛋白前体抗体、鲁米诺和过氧化物的二抗；(3)将毛细管卡盒装入自动化western印迹免疫测定仪器中；(4)使用所述自动化western印迹免疫测定仪器计算以下中的一种或多种：信号强度、峰面积、信噪比和总蛋白质归一化参数；以及(5)将所述csf样品中的颗粒蛋白前体蛋白水平定量为对于所述抗颗粒蛋白前体抗体的免疫反应性的峰面积。在一些实施方案中，所述csf样品被稀释在包含二硫苏糖醇(dtt)和样品缓冲液的主混合物中。主混合物还可以包含其他专有组分。在一些方面，抗颗粒蛋白前体抗体检测人颗粒蛋白前体。在一些实施方案中，使用控制自动化western印迹免疫测定仪器的软件从计算的参数定量颗粒蛋白前体蛋白水平。在一些实施方案中，软件是用于simplewestern
tm
的compass软件
(proteinsimple，san jose，ca)。
[0153]
在一些实施方案中，本公开提供了定量脑脊液(csf)样品中的颗粒蛋白前体蛋白水平的方法，所述方法包括：(1)在含有二硫苏糖醇(dtt)和样品缓冲液的主混合物中稀释csf样品(例如，4倍稀释)；(2)向毛细管卡盒的孔中加载稀释的csf样品、抗颗粒蛋白前体抗体；检测抗颗粒蛋白前体抗体、鲁米诺和过氧化物的二抗；(3)将毛细管卡盒装入自动化western印迹免疫测定仪器中；(4)使用所述自动化western印迹免疫测定仪器计算信号强度、峰面积和信噪比；以及(5)将所述csf样品中的颗粒蛋白前体蛋白水平定量为对于所述抗颗粒蛋白前体抗体的免疫反应性的峰面积。
[0154]
在一些方面，本公开提供了包含编码第一基因产物和第二基因产物的表达构建体的分离的核酸，其中每个基因产物独立地选自表1中所示的基因产物或其部分。
[0155]
在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，raav载体)包含如seq id no：1-91中任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，raav载体)包含与如seq id no：1-91中任一者所示的序列互补(例如，为如seq id no：1-91中任一者所示的序列的互补序列)的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，raav载体)包含为如seq id no：1-91中任一者所示序列的反向互补序列的序列或由其组成。在一些实施方案中，本公开所描述的分离的核酸或载体(例如，raav载体)包含如seq id no：1-91中任一者所示序列的一部分或由其组成。一部分可以包含如seq id no：1-91中任一者所示的序列的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本公开所描述的核酸序列是核酸有义链(例如，5
′
至3
′
链)，或在病毒序列的背景下是正( )链。在一些实施方案中，本公开所描述的核酸序列是核酸反义链(例如，3
′
至5
′
链)，或在病毒序列的背景下是负( )链。
[0156]
在一些实施方案中，基因产物由天然存在的基因的编码部分(例如cdna)编码。在一些实施方案中，第一基因产物是由gba1基因编码的蛋白质(或其片段)。在一些实施方案中，基因产物是由表1中所列出的另一基因(例如scarb2/limp2基因或psap基因)编码的蛋白质(或其片段)。然而，技术人员认识到第一基因产物(例如，gcase)和第二基因产物(例如，limp2等)的表达顺序通常可以颠倒(例如，limp2是第一基因产物，并且gcase是第二基因产物)。在一些实施方案中，基因产物是表1中所列出的基因的片段(例如部分)。蛋白质片段可以包含由表1中所列出的基因编码的蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约99％。在一些实施方案中，蛋白质片段包含由表1中所列出的基因编码的蛋白质的50％与99.9％之间(例如50％与99.9％之间的任何值)。
[0157]
在一些实施方案中，表达构建体是单顺反子的(例如，表达构建体编码包含第一基因产物和第二基因产物的单一融合蛋白)。在一些实施方案中，表达构建体是多顺反子的(例如，表达构建体编码两种不同的基因产物，例如两种不同的蛋白质或蛋白质片段)。
[0158]
多顺反子表达载体可以包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个)启动子。可以使用任何合适的启动子，例如组成型启动子、诱导型启动子、内源性启动子、组织特异性启动子(例如cns特异性启动子)等。在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白启动子(cba启动子)、cag启动子(例如，如alexopoulou等人(2008)bmc cell biol.9：2；doi：10.1186/1471-2121-9-2所述的)、cd68启动子或jet启动子(例如，如等人(2002)gene 297(1-2)：21-32所述的)。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至编码第一基因
产物、第二基因产物、或第一基因产物和第二基因产物的核酸序列。在一些实施方案中，表达盒包含一个或多个另外的调控序列，包括但不限于转录因子结合序列、内含子剪接位点、聚(a)添加位点、增强子序列、阻遏物结合位点或前述各项的任何组合。
[0159]
在一些实施方案中，编码第一基因产物的核酸序列和编码第二基因产物的核酸序列被编码内部核糖体进入位点(ires)的核酸序列分开。ires位点的实例由例如mokrejs等人(2006)nucleic acids res.34(数据库发布)：d125-30进行了描述。在一些实施方案中，编码第一基因产物的核酸序列和编码第二基因产物的核酸序列被编码自切割肽的核酸序列分开。自切割肽的实例包括但不限于t2a、p2a、e2a、f2a、bmcpv2a和bmifv 2a，以及由liu等人(2017)sci rep.7：2193所描述的那些。在一些实施方案中，自切割肽是t2a肽。
[0160]
在病理学上，病症诸如pd和戈谢病与主要由α突触核蛋白(α-syn)蛋白构成的蛋白质聚集体的积累相关。因此，在一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包含减少或阻止α-syn蛋白表达的抑制性核酸。可以将编码抑制性核酸的序列置于表达载体的非翻译区(例如内含子、5
′
utr、3
′
utr等)中。
[0161]
在一些实施方案中，抑制性核酸位于表达构建体的内含子中，例如位于编码第一基因产物的序列上游的内含子中。抑制性核酸可以是双链rna(dsrna)、sirna、shrna、微小rna(mirna)、人工mirna(amirna)或rna适体。通常，抑制性核酸与靶rna(例如，mrna)的约6个与约30个之间(例如，在6个与30个之间的任何整数，包括端值)连续核苷酸结合(例如，与之杂交)。在一些实施方案中，抑制性核酸分子是mirna或amirna，例如靶向snca(编码α-syn蛋白的基因)或tmeml06b(例如编码tmem106b蛋白的基因)的mirna。在一些实施方案中，mirna不包含与其杂交的snca mrna区域的任何错配(例如，mirna是“完美的”)。在一些实施方案中，抑制性核酸是shrna(例如靶向snca或tmem106b的shrna)。在一些实施方案中，抑制性核酸是包括mir-155支架和snca或tmem106b靶向序列的人工mirna(amirna)。
[0162]
本领域技术人员认识到，当提及包含或编码抑制性核酸(例如，dsrna、sirna、mirna、amirna等)的核酸序列时，在本文提供的序列中的任何一个或多个胸苷(t)核苷酸或尿苷(u)核苷酸可以被适合与腺苷核苷酸碱基配对(例如，通过沃森-克里克碱基对)的任何其他核苷酸替换。例如，t可以被u替换，并且u可以被t替换。
[0163]
如本文所述的分离的核酸可以其自身存在，或作为载体的一部分存在。通常，载体可以是质粒、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体(bac)或病毒载体(例如腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体等)。在一些实施方案中，载体是质粒(例如，包含如本文所述的分离的核酸的质粒)。在一些实施方案中，raav载体是单链的(例如单链dna)。在一些实施方案中，载体是重组aav(raav)载体。在一些实施方案中，载体是杆状病毒载体(例如苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)核型多角体(acnpv)载体)。
[0164]
通常，raav载体(例如，raav基因组)包含侧翼有两个aav反向末端重复(itr)序列的转基因(例如，包含以下各项中的一种或多种的表达构建体：启动子、内含子、增强子序列、蛋白质编码序列、抑制性rna编码序列、聚a尾序列等)。在一些实施方案中，raav载体的转基因包含如本公开所描述的分离的核酸。在一些实施方案中，raav载体的两个itr序列中的每一个是全长itr(例如，长度为大约145bp，并且含有功能性rep结合位点(rbs)和末端分辨位点(trs))。在一些实施方案中，raav载体的itr之一被截短(例如缩短的或非全长)。在一些实施方案中，截短的itr缺乏功能性末端分辨位点(trs)并且被用于产生自身互补aav
载体(scaav载体)。在一些实施方案中，截短的itr是δitr，例如，如mccarty等人(2003)gene ther.10(26)：2112-8所述。
[0165]
本公开的方面涉及分离的核酸(例如raav载体)，其包含相对于野生型aav itr(例如相对于野生型aav2 itr(例如seq id no：29))具有一个或多个修饰(例如核酸添加、缺失、取代等)的itr。野生型aav2itr的结构如图20所示。通常，野生型itr包含自身退火形成回文双链t形发夹结构的125个核苷酸区域，所述回文双链t形发夹结构由两个交叉臂(分别由称为b/b
′
和c/c
′
的序列形成)、较长的茎区域(由序列a/a
′
形成)和称为“d”区的单链末端区域组成(图20)。通常，itr的“d”区位于由a/a
′
序列形成的茎区域和含有raav载体的转基因的插入物之间(例如，相对于itr的末端定位于itr的“内部”或者在raav载体的转基因插入物或表达构建体近侧)。在一些实施方案中，“d”区包含如seq id no：27所示的序列。已观察到“d”区在通过衣壳蛋白对raav载体的衣壳化中起重要作用，例如，如ling等人(2015)j mol genet med9(3)所公开的。
[0166]
本公开部分地基于令人惊讶的发现，即与具有未经修饰(例如，野生型)itr的itr的raav载体相比，包含位于itr“外部”(例如，相对于转基因插入物或表达构建体在itr末端近侧)的“d”区的raav载体被aav衣壳蛋白有效地衣壳化。在一些实施方案中，具有经修饰的“d”序列(例如，在“外部”位置的“d”序列)的raav载体相对于具有野生型itr序列的raav载体具有降低的毒性。
[0167]
在一些实施方案中，相对于野生型“d”序列(例如，seq id no：27)，经修饰的“d”序列包含至少一个核苷酸取代。相对于野生型“d”序列(例如，seq id no：27)，经修饰的“d”序列可能具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个核苷酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型“d”序列(例如，seq id no：27)，经修饰的“d”序列包含至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个核酸取代。在一些实施方案中，经修饰的“d”序列与野生型“d”序列(例如，seq id no：27)具有约10％与约99％之间(例如，10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)的同一性。在一些实施方案中，经修饰的“d”序列包含如seq id no：26所示的序列，也称为“s”序列，如wang等人(1995)j mol biol 250(5)：573-80所述。
[0168]
如本公开所描述的分离的核酸或raav载体还可以包含“try”序列，例如，如seq id no：28所示或如francois等人，(2005)j.virol.79(17)：11082-11094所述。在一些实施方案中，try序列定位于分离的核酸或raav载体的itr(例如5
′
itr)与表达构建体(例如编码转基因的插入物)之间。
[0169]
在一些方面，本公开涉及包含如本公开所描述的分离的核酸或raav载体的杆状病毒载体。在一些实施方案中，所述杆状病毒载体是苜蓿银纹夜蛾核型多角体(acnpv)载体，例如，如urabe等人(2002)hum gene ther13(16)：1935-43以及smith等人(2009)mol ther17(11)：1888-1896所述。
[0170]
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例如，宿主细胞可以是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如hek293t细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌(e.coli)细胞。
[0171]
raav
[0172]
在一些方面，本公开涉及包含编码如本文所述的核酸(例如，如本文所述的raav载体)的转基因的重组aav(raav)。术语“raav”通常是指包含被一种或多种aav衣壳蛋白衣壳化的raav载体的病毒颗粒。本公开所描述的raav可以包含具有选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9和aav10的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，raav包含来自非人宿主的衣壳蛋白，例如恒河猴aav衣壳蛋白诸如aavrh.10、aavrh.39等。在一些实施方案中，本公开所描述的raav包含为野生型衣壳蛋白的变体的衣壳蛋白，诸如相对于其所来源的野生型aav衣壳蛋白包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个(例如，15个、2025个、50个、100个等)氨基酸置换(例如突变)的衣壳蛋白变体。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白变体是aav1rx衣壳蛋白，例如，如albright等人mol ther.2018年2月7日；26(2)：510-523所述。在一些实施方案中，衣壳蛋白变体是aav tm6衣壳蛋白，例如，如rosario等人mol ther methods clin dev.2016；3：16026所述。
[0173]
在一些实施方案中，本公开所描述的raav容易地通过cns扩散，特别是当引入csf空间或直接进入脑实质中时。因此，在一些实施方案中，本公开所描述的raav包含能够穿过血脑屏障(bbb)的衣壳蛋白。例如，在一些实施方案中，raav包含具有aav9或aavrh.10血清型的衣壳蛋白。例如samulski等人(1989)j virol.63(9)：3822-8以及wright(2009)hum gene ther.20(7)：698-706描述了raav的生产。在一些实施方案中，raav包含特异性地或优先地靶向骨髓细胞例如小胶质细胞的衣壳蛋白。
[0174]
在一些实施方案中，本公开提供了称为“pr006a”的raav。pr006a是递送功能性人grn基因，从而导致功能性人pgrn的表达增加的raav。pr006a载体插入物包含鸡β肌动蛋白(cba)启动子元件，其包含4个部分：巨细胞病毒(cmv)增强子、cba启动子、外显子1和内含子(int)以组成型表达人grn的密码子优化的编码序列(seq id no：68)。3
′
区域还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)，随后是牛生长激素聚腺苷酸化信号尾。以下三个已充分描述的转录调控激活
[0175]
位点被包括在启动子区域的5
′
端：tata、rbs和yy1(参见例如francois等人，(2005)j.virol.79(17)：11082-11094)。侧翼反向末端重复序列(itr)允许间插序列的正确包装。主链含有赋予卡那霉素抗性的基因以及防止反向包装的填充序列。图64显示了描绘raav载体的示意图。seq id no 90提供了图64所示pr006a载体的第一链(按5
′
至3
′
顺序)的核苷酸序列。seq id no 91提供了图64所示pr006a载体的第二链(按5
′
至3
′
顺序)的核苷酸序列。pr006a包含aav9衣壳蛋白。
[0176]
在一些实施方案中，在杆状病毒载体表达系统(bevs)中产生如本公开所描述的raav(例如，包含由aav衣壳蛋白衣壳化以形成raav衣壳颗粒的重组raav基因组)。例如urabe等人(2002)hum gene ther13(16)：1935-43；smith等人(2009)mol ther 17(11)：1888-1896；美国专利号8,945,918；美国专利号9,879,282；和国际pct公开wo 2017/184879描述了使用bevs生产raav。然而，可以使用任何合适的方法(例如，使用重组rep和cap基因)生产raav。在一些实施方案中，在hek293(人胚肾)细胞中生产本文所公开的raav。
[0177]
药物组合物
[0178]
在一些方面，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的分离的核酸或raav和药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料，诸如载剂或稀释剂，例如，所述材料可以施用于个体而不引
起不期望的生物效应或以有害方式与包含其的组合物的任何组分相互作用。
[0179]
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或载剂，诸如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料，它们涉及将可用于本发明内的化合物携带或运输至患者体内或之中，使得所述化合物可以执行预期的功能。在实施本发明中使用的药物组合物中可以包括的其他成分是本领域已知的，并且描述于例如remington
′
s pharmaceutical sciences(genaro编辑，mack publishing co.，1985，easton，pa)中，其以引用方式并入本文。
[0180]
本文提供的组合物(例如，药物组合物)可以通过任何途径施用，包括肠内(例如，口服)、肠胃外、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、透皮、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏、乳膏和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和/或作为口腔喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂。具体考虑的途径是口服施用、静脉内施用(例如，全身静脉内注射)、经由血液和/或淋巴供应的区域性施用、和/或直接施用于受累的部位。通常，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括药剂的性质(例如，其在胃肠道环境中的稳定性)和/或受试者的状况(例如，受试者是否能够耐受口服施用)。在某些实施方案中，本文所述的化合物或药物组合物适合于局部施用于受试者的眼睛。
[0181]
在一些实施方案中，本公开提供了包含在水溶液中呈现的上述pr006a raav的pr006a药物成品。在一些实施方案中，最终制剂缓冲液包含约20mm tris[ph 8.0]、约1mm mgcl2、约200mm nacl和约0.001％[w/v]泊洛沙姆188。在一些实施方案中，最终药物制品和最终制剂缓冲液适合于小脑延髓池内(icm)注射。
[0182]
方法
[0183]
本公开的方面涉及用于在受试者中表达一种或多种cns疾病相关基因产物以治疗cns相关疾病的组合物。一种或多种cns疾病相关基因产物可以由一种或多种分离的核酸或raav载体编码。在一些实施方案中，向受试者施用编码一种或多种(1种、2种、3种、4种、5种或更多种)基因产物的单一载体(例如，分离的核酸、raav等)。在一些实施方案中，向受试者施用多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)载体(例如分离的核酸、raav等)，其中每种载体编码不同的cns疾病相关基因产物。
[0184]
cns相关疾病可以是神经退行性疾病、突触核蛋白病、tau蛋白病或溶酶体贮积病。神经退行性疾病及其相关基因的实例列于表12中。
[0185]“突触核蛋白病”是指(例如，相对于健康受试者，例如未患有突触核蛋白病的受试者)以受试者中α突触核蛋白(snca的基因产物)的积累为特征的疾病或病症。突触核蛋白病及其相关基因的实例列于表13中。
[0186]“tau蛋白病”是指(例如，相对于未患有tau蛋白病的健康受试者)以受试者中异常tau蛋白积累为特征的疾病或病症。tau蛋白病及其相关基因的实例列于表14中。
[0187]“溶酶体贮积病”是指以受试者的溶酶体中毒性细胞产物的异常积累为特征的疾病。溶酶体贮积病及其相关基因的实例列于表15中。
[0188]
如本文所用的“治疗”(“treat”或“treating”)是指(a)预防或延迟cns疾病的发作；(b)降低cns疾病的严重性；(c)减少或预防cns疾病特征性症状的发展；和/或预防cns疾病特征性症状的恶化。cns疾病的症状可以包括例如运动功能障碍(例如，抖动、僵硬、运动
缓慢、行走困难、瘫痪)、认知功能障碍(例如，痴呆、抑郁、焦虑、精神病)、记忆困难、情绪和行为功能障碍。
[0189]
本公开部分地基于用于在受试者中表达pd相关基因产物的组合的组合物，所述pd相关基因产物的组合一起(例如协同地)发挥作用以治疗帕金森病。
[0190]
因此，在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)。
[0191]
本公开部分地基于用于在受试者中表达一种或多种cns疾病相关基因产物以治疗戈谢病的组合物。在一些实施方案中，戈谢病是神经元病性戈谢病，例如2型戈谢病或3型戈谢病。在一些实施方案中，患有戈谢病的受试者未患pd或不具有pd症状。
[0192]
因此，在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有神经元病性戈谢病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)。
[0193]
本公开部分地基于用于在受试者中表达一种或多种cns疾病相关基因产物以治疗阿尔茨海默病或额颞叶痴呆(ftd)的组合物。在一些实施方案中，受试者未患阿尔茨海默病。在一些实施方案中，受试者患有ftd并且未患阿尔茨海默病。在一些实施方案中，受试者患有具有grn(颗粒蛋白前体)突变的ftd。在一些实施方案中，受试者患有具有grn突变的ftd，并且受试者对于grn突变(例如，致病性grn突变)是杂合的。在一些实施方案中，grn突变是无效突变(例如，无义、移码或剪接位点突变，或者完全或部分(外显子)基因缺失)。在一些实施方案中，grn突变是具有经证实的功能性有害作用的致病性突变。在一些实施方案中，grn突变是错义致病性突变。在一些实施方案中，在molgen ftd数据库(molgen.ua.ac.be)中列出了grn突变。在一些实施方案中，grn突变在受试者中产生低血浆pgrn水平(＜70ng/ml)。
[0194]
在一些实施方案中，受试者患有ftd、具有grn突变的ftd、具有tau突变的ftd、具有c9orf72突变的ftd、神经元蜡样脂褐质沉积症、帕金森病、阿尔茨海默病、皮质基底节变性、运动神经元疾病或戈谢病。
[0195]
在一些实施方案中，受试者具有症状性ftd(例如，行为变异型ftd(bvftd)、原发性进行性失语症(ppa)-ftd、具有皮质基底节综合征的ftd、或综合征的组合)。
[0196]
因此，在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)。
[0197]
在一些实施方案中，向患有阿尔茨海默病或ftd(例如具有grn突变的ftd)的受试者施用编码颗粒蛋白前体(pgrn)或其部分的raav。在一些实施方案中，向患有阿尔茨海默病或ftd(例如具有grn突变的ftd)的受试者施用编码pgrn或其部分的raav，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些实施方案中，pgrn蛋白包含seq id no：67中的氨基酸序列或其部分。在一些实施方案中，编码pgrn的raav包含具有aav9血清型的衣壳蛋白。
[0198]
在一些实施方案中，将用于治疗ftd(例如具有grn突变的ftd)的包含编码pgrn的raav的组合物以约1
×
10
12
个载体基因组(vg)至约1
×
10
15
vg，或从约1
×
10
13
vg至约7
×
10
14
vg、或从约1
×
10
13
vg至约5
×
10
14
vg、或从约2
×
10
13
vg至约2
×
10
14
vg、或从约3
×
10
13
vg至约2
×
10
14
vg、或从约3.5
×
10
13
vg至约1.4
×
10
14
vg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，将用于治疗ftd(例如具有grn突变的ftd)的包含编码pgrn的raav的组合物以约2
×
10
13
vg、约3
×
10
13
vg、约4
×
10
13
vg、约5
×
10
13
vg、约6
×
10
13
vg、约7
×
10
13
vg、约8
×
10
13
vg、约9
×
10
13
vg、约1
×
10
14
vg、或约2
×
10
14
vg的剂量施用于受试者。
[0199]
在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有ftd(例如具有grn突变的ftd)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码pgrn的raav的组合物，其中所述组合物以约3.5
×
10
13
个载体基因组(vg)、约7.0
×
10
13
vg或约1.4
×
10
14
vg的剂量施用。
[0200]
在一些方面，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有ftd(例如具有grn突变的ftd)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码pgrn的raav的组合物，其中所述组合物以约1
×
10
14
个载体基因组(vg)、约2.0
×
10
14
vg或约4.0
×
10
14
vg的剂量施用。
[0201]
在一些实施方案中，将用于治疗ftd(例如具有grn突变的ftd)的包含编码pgrn的raav的组合物作为单一剂量施用于受试者，并且随后不将所述组合物施用于受试者。
[0202]
在一些实施方案中，通过单次枕骨下注射将包含raav的组合物递送到小脑延髓池中。在一些实施方案中，注射到小脑延髓池中是在放射摄影的引导下进行的。
[0203]
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码功能性颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白的序列的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些实施方案中，具有grn突变的ftd的症状可以是个性改变、执行功能受损、抑制解除、情感淡漠、语言产生缓慢、语法误用、多模式失认症、语义失语症或字词理解力受损。在一些实施方案中，编码pgrn的raav包含具有aav9血清型的衣壳蛋白。
[0204]
在一些实施方案中，本公开提供了用于减少患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的脑中的脂褐质积累的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些方面，本公开提供了用于减少患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的脑中的泛素积累的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些方面，本公开提供了用于降低患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的脑中的tnfα和/或cd68的基因表达和/或蛋白质表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些方面，本公开提供了用于增加患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的脑中的组织蛋白酶d的成熟的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些方面，本公开提供了用于增加患有或疑似患有具有grn突变的ftd的受试者的脑中的细胞核tdp-43(反式活性响应dna结合蛋白43kda)蛋白质水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些实施方案中，本公开提供了用于减少患有或疑似患有具有
grn突变的ftd的受试者的血液或csf中的神经丝轻链(nfl)的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含编码颗粒蛋白前体(pgrn)的raav的组合物，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或seq id no：68中的核酸序列编码。在一些实施方案中，编码pgrn的raav包含具有aav9血清型的衣壳蛋白。
[0205]
受试者通常是哺乳动物，优选人。在一些实施方案中，受试者的年龄在1月龄与10岁之间(例如，1月龄、2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄、7月龄、8月龄、9月龄、10月龄、11月龄、12月龄、13月龄、14月龄、15月龄、16月龄、17月龄、18月龄、19月龄、20月龄、21月龄、22月龄、23月龄、24月龄、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁或其间的任何年龄)。在一些实施方案中，受试者在2岁与20岁之间。在一些实施方案中，受试者在30岁与100岁之间。在一些实施方案中，受试者大于55岁。
[0206]
在一些实施方案中，将组合物直接施用于受试者的cns，例如通过直接注射到受试者的脑和/或脊髓中。cns-直接施用形式的实例包括但不限于脑内注射、心室内注射、池内注射、实质内注射、鞘内注射和前述各项的任何组合。在一些实施方案中，组合物通过小脑延髓池内(icm)注射施用于受试者。在一些实施方案中，直接注射到受试者的cns中导致受试者的中脑、纹状体和/或大脑皮质中的转基因表达(例如，第一基因产物、第二基因产物和如果适用的话第三基因产物的表达)。在一些实施方案中，直接注射到cns中导致受试者的脊髓和/或csf中的转基因表达(例如，第一基因产物、第二基因产物和如果适用的话第三基因产物的表达)。
[0207]
在一些实施方案中，直接注射至受试者的cns包括对流增强递送(ced)。对流增强递送是一种治疗策略，其涉及手术暴露脑和将小直径导管直接放置到脑的目标区域中，随后将治疗剂(例如，如本文所述的组合物或raav)直接输注到受试者的脑中。例如debinski等人(2009)expert rev neurother.9(10)：1519-27等人对ced进行了描述。
[0208]
在一些实施方案中，将组合物外周地(例如通过外周注射)施用于受试者。外周注射的实例包括皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射或前述各项的任何组合。在一些实施方案中，外周注射是动脉内注射，例如注射到受试者的颈动脉中。
[0209]
在一些实施方案中，将如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)外周地和直接地施用至受试者的cns。例如，在一些实施方案中，通过动脉内注射(例如，注射到颈动脉中)和通过实质内注射(例如，通过ced的实质内注射)向受试者施用组合物。在一些实施方案中，向cns的直接注射和外周注射是同时的(例如，同时发生)。在一些实施方案中，直接注射发生在外周注射之前(例如，之前1分钟与1周之间或更长时间)。在一些实施方案中，直接注射发生在外周注射之后(例如，之后1分钟与1周之间、或更长时间)。
[0210]
在一些实施方案中，在如本文所述的组合物之前(例如，之前1个月与1分钟之间)或同时向受试者施用免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂是皮质类固醇(例如，泼尼松、布地奈德等)、mtor抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司等)、抗体(例如，阿达木单抗、依那西普、那他珠单抗等)或甲氨蝶呤。
[0211]
向受试者施用的如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)的量将根据施用方法而变化。例如，在一些实施方案中，将如本文所述的raav以约109个基因组拷贝(gc)/kg至约10
14
gc/kg(例如，约109gc/kg、约10
10
gc/kg、约10
11
gc/kg、约
10
12
gc/kg、约10
12
gc/kg、或约10
14
gc/kg)的滴度施用于受试者。在一些实施方案中，通过注射至csf空间或通过实质内注射向受试者施用高滴度(例如，＞10
12
个基因组拷贝gc/kg)的raav。在一些实施方案中，将如本文所述的raav通过静脉内注射以从约1x10
10
个载体基因组(vg)至约1x10
17
vg范围内的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，将如本文所述的raav通过注射到小脑延髓池中以从约1x10
10
vg至约1x10
16
vg范围内的剂量施用于受试者。
[0212]
如本公开所描述的组合物(例如，包含分离的核酸或载体或raav的组合物)可以一次或多次(例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、20次或更多次)施用于受试者。在一些实施方案中，例如通过输注泵连续地(例如长期地)向受试者施用组合物。
[0213]
实施例
[0214]
实施例1：raav载体
[0215]
使用诸如hek293细胞的细胞产生aav载体以用于三质粒转染。itr序列位于表达构建体的侧翼，所述表达构建体包含每种所关注转基因的启动子/增强子元件、3
′
聚a信号和翻译后信号诸如wpre元件。通过融合蛋白质序列；或使用2a肽接头，诸如t2a或p2a，其由于防止肽键的产生而导致具有添加的氨基酸的2个肽片段；或使用ires元件；或通过用2个分开的表达盒表达可以同时表达多种基因产物，诸如gba1和limp2和/或鞘脂激活蛋白原。在所表达的基因的上游存在可有效剪接的短内含子序列可以提高表达水平。shrna和其他调控rna可能也包括在这些序列内。本公开所描述的表达构建体的实例显示于图1-8、21-35、39、41-51和64以及下表2中。
[0216]
[0217][0218]
实施例2：病毒转导到gba缺陷型细胞中的基于细胞的测定
[0219]
获得gba1缺陷的细胞，例如作为来自gd患者的成纤维细胞、单核细胞或hes细胞、
或患者来源的诱导多能干细胞(ipsc)。这些细胞积累底物诸如葡糖神经酰胺和葡糖基鞘氨醇(glccer和glcsph)。用gcase抑制剂诸如cbe处理野生型或突变型培养细胞系也可用于获得gba缺陷型细胞。
[0220]
使用此类细胞模型，根据蛋白质聚集体(诸如具有针对该蛋白质的抗体的α突触核蛋白或磷酸-αsyn的)的积累，对溶酶体缺陷进行定量，随后使用荧光显微镜进行成像。还通过icc对蛋白质标志物诸如lamp1、lamp2、limp1、limp2，或使用染料诸如lysotracker，或通过经荧光葡聚糖的胞吞区室摄取或其他标志物进行溶酶体异常的成像。还可以进行由于与溶酶体(诸如lc3)的缺陷性融合而导致的自噬标志物积累的成像。将western印迹和/或elisa用于定量这些标志物的异常积累。此外，使用标准方法测量糖脂底物和gba1产物的积累。
[0221]
在aav载体转导的表达的情况下测量治疗终点(例如，pd相关病理的减少)，以确认和定量活性和功能。还可以使用蛋白质elisa量度或通过标准gcase活性测定来定量gcase。
[0222]
实施例3：使用突变小鼠的体内测定
[0223]
本实施例描述了使用突变型小鼠的aav载体的体内测定。上述aav载体在突变型小鼠中的体内研究使用例如以下文献所描述的测定来进行：liou等人(2006)j.biol.chem.281(7)：4242-4253；sun等人(2005)j.lipid res.46：2102-2113；以及farfel-becker等人(2011)dis.model mech.4(6)：746-752。
[0224]
使用浓缩的aav储备液，例如以5-10μl之间的注射体积，进行媒介物对照和aav载体的鞘内或心室内递送(例如，以2
×
10
11
vg/小鼠的剂量)。通过对流增强递送进行实质内递送。
[0225]
在症状发作之前或发作之后开始治疗。所测量的终点是底物在cns和csf中的积累、通过elisa的gcase酶和酶活性的积累、运动和认知终点、溶酶体功能障碍、以及α突触核蛋白单体、初原纤维或原纤维的积累。
[0226]
实施例4：疾病的化学模型
[0227]
本实施例描述了使用戈谢病的化学诱导的小鼠模型(例如，cbe小鼠模型)的aav载体的体内测定。这些aav载体的体内研究在戈谢病的化学诱导的小鼠模型中进行，例如，如vardi等人(2016)j pathol.239(4)：496-509所述。
[0228]
使用浓缩的aav储备液，例如用5-10μl之间的注射体积，进行媒介物对照和aav载体的鞘内或心室内递送(例如，以2
×
10
11
vg/小鼠的剂量)。通过对流增强递送进行实质内递送。通过尾静脉注射实现外周递送。
[0229]
在症状发作之前或发作之后开始治疗。所测量的终点是底物在cns和csf中的积累、通过elisa的gcase酶和酶活性的积累、运动和认知终点、溶酶体功能障碍、以及α突触核蛋白单体、初原纤维或原纤维的积累。
[0230]
实施例5：pd、lbd、戈谢病患者的临床试验
[0231]
在一些实施方案中，患有某些形式的戈谢病(例如gd1)的患者发展帕金森病(pd)或路易体痴呆(lbd)的风险增加。本实施例描述了在患有戈谢病、pd和/或lbd的患者中评估如本公开所描述的raav的安全性和功效的临床试验。
[0232]
使用类似于grabowski等人(1995)ann.intern.med.122(1)：33-39所述的研究设计进行此类载体治疗戈谢病、pd和/或lbd的临床试验
[0233]
实施例6：外周疾病的治疗
[0234]
在一些实施方案中，患有某些形式的戈谢病的患者表现出周围神经病的症状，例如，如biegstraaten等人(2010)brain 133(10)：2909-2919所述。
[0235]
本实施例描述了如本文所述的aav载体用于治疗与戈谢病(例如，1型戈谢病)相关的周围神经病的体内测定。简言之，向鉴定为具有周围神经病的体征或症状的1型戈谢病患者施用如本公开所描述的raav。在一些实施方案中，在施用raav之后，例如使用biegstraaten等人所描述的方法监测受试者的外周神经病体征和症状。
[0236]
例如通过western印迹分析、酶促功能测定或成像研究来测定在患者中(例如，在患者的血清中，在患者的外周组织(例如，肝组织、脾组织等)中)存在的如本公开所描述的所转导的基因产物的水平。
[0237]
实施例7：cns形式的治疗
[0238]
本实施例描述了如本文所述的raav用于治疗cns形式的戈谢病的体内测定。简言之，向鉴定为患有cns形式的戈谢病(例如，2型或3型戈谢病)的戈谢病患者施用如本公开所描述的raav。例如通过western印迹分析、酶促功能测定或成像研究来测定在患者cns中(例如患者cns的血清中、在患者的脑脊液(csf)中或在患者的cns组织中)存在的如本公开所描述的所转导的基因产物的水平。
[0239]
实施例8：在具有gba1突变的受试者中的帕金森病的基因疗法
[0240]
本实施例描述了将编码gba1的重组腺相关病毒(raav)施用于患有以gba1基因突变为特征的帕金森病的受试者。
[0241]
raav-gba1载体插入物含有cba启动子元件(cba)，其由四个部分组成：cmv增强子(cmve)、cba启动子(cbap)、外显子1和内含子(int)以组成型表达人gbal(栗色)的密码子优化的编码序列(cds)。3
′
区还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)转录后调控元件，其后是牛生长激素聚a信号(bgh聚a)尾。侧翼itr允许间插序列的正确包装。评价了5
′
itr序列的两个变体(图7，插入框，底部序列)；这些变体在itr的20个核苷酸“d”区内具有几个核苷酸差异，这被认为影响包装和表达的效率。raav-gba1载体产物含有图7中所示的“d”结构域核苷酸序列(插入框，顶部序列)。变体载体具有突变的“d”结构域(本文中称为“s”结构域，其中核苷酸变化通过阴影显示)，其在临床前研究中类似地进行。主链含有赋予卡那霉素抗性的基因以及防止反向包装的填充序列。图8显示了描绘raav-gba1载体的示意图。使用aav9血清型衣壳蛋白将raav-gba1载体包装成raav。
[0242]
将raav-gba1作为单剂量通过荧光透法引导的枕骨下注射到小脑延髓池(小脑延髓池内；icm)中施用于受试者。raav-gba1给药方案研究的一个实施方案如下：
[0243]
以基于非临床药理学和毒理学研究的结果确定的两个剂量水平之一(3e13vg(低剂量)；1e14vg(高剂量)等)向患者(n＝12)施用单剂量的raav-gba1。
[0244]
在化学小鼠模型中进行初始研究，包括每日递送一种gcase抑制剂环己烯四醇-b-环氧化物(cbe)以评价raav-gba1载体和raav-gba1 s变体构建体(如下文进一步所描述的)的功效和安全性。另外，在携带纯合的gba1突变且鞘脂激活蛋白部分缺陷(4l/ps-na)的遗传小鼠模型中进行初始研究。在小鼠和非人灵长类(nhp)中进行另外的剂量范围研究以进一步评价载体安全性和功效。
[0245]
测试aav主链中5
′
反向末端重复序列(itr)的两个略微不同的版本以评估可制造
性和转基因表达(图7)。在145bp 5’itr内的20bp“d”结构域被认为是最佳病毒载体生产所必需的，但也已报道“d”结构域内的突变在一些情况下增加转基因表达。因此，除了具有完整“d”结构域的病毒载体raav-gbal以外，还评价了具有突变的d结构域(本文中称为“s”结构域)的第二种载体形式。raav-gba1和变体两者表达相同的转基因。虽然两种载体都产生如下文详述的在体内有效的病毒，但是选择含有野生型“d”结构域的raav-gba1用于进一步开发。
[0246]
为了建立gcase缺陷的cbe模型，向幼年小鼠给药cbe，cbe是gcase的特异性抑制剂。从出生后第8天(p8)开始每天通过ip注射向小鼠给予cbe。测试三种不同的cbe剂量(25mg/kg、37.5mg/kg、50mg/kg)和pbs以建立表现出行为表型的模型(图9)。较高剂量的cbe以剂量依赖性方式导致致死率。用50mg/kg cbe治疗的所有小鼠死于p23，用37.5mg/kg cbe治疗的8只小鼠中有5只死于p27。在用25mg/kg cbe治疗的小鼠中没有致死性。然而注射cbe的小鼠在空旷场地测定中没有显示出一般的运动缺陷(以与给予pbs的小鼠相同的速度行进相同的距离)，cbe治疗的小鼠表现出运动协调和平衡缺陷，如通过疲劳转棒仪测定所测量的。
[0247]
在其最后一次cbe剂量后(p27，“第1天”)或在cbe停用三天后(p29，“第3天”)将存活至研究结束的小鼠处死。在给予25mg/kg cbe的小鼠皮质上进行脂质分析，以评价第1天和第3天群组中gcase底物的积累。与pbs治疗的对照相比，在cbe治疗的小鼠中glusph和galsph水平(在本实施例中以聚集体测量)显著积累，这与gcase不足一致。
[0248]
基于上文所述的研究，选择25mg/kg cbe剂量，因为其产生行为缺陷而不影响存活。为了在cbe治疗期间实现gba1在整个脑中的广泛分布和转基因表达，在出生后第3天(p3)通过脑室内(icv)注射递送raav-gba1或赋形剂，随后在p8开始每日ip cbe或pbs治疗(图10)。
[0249]
接受raav-gba1的cbe治疗的小鼠在疲劳转棒仪上的表现在统计学上显著好于接受赋形剂的小鼠(图11)。在不同治疗组中的小鼠与赋形剂治疗的小鼠在其他行为测量方面没有差异，诸如在测试期间行进的总距离(图11)。
[0250]
在活体研究完成时，在最后一次cbe剂量后(p36，“第1天”)或在cbe停用三天后(p38，“第3天”)将一半小鼠处死用于生化分析(图12)。使用生物学一式三份进行的荧光酶测定，评价皮质中的gcase活性。在用raav-gba1治疗的小鼠中gcase活性增加，而cbe治疗降低gcase活性。另外，接受cbe和raav-gba1两者的小鼠具有与pbs治疗组相似的gcase活性水平，表明raav-gba1的递送能够克服由cbe治疗诱导的gcase活性的抑制。对小鼠的运动皮质进行脂质分析以检测底物glucer和glusph的水平。两种脂质均在给予cbe的小鼠脑中积累，并且raav-gba1治疗显著减少了底物积累。
[0251]
在治疗组中，脂质水平与gcase活性和在疲劳转棒仪上的表现均呈负相关。在raav-gba1施用之后增加的gcase活性与底物减少和增强的运动功能相关(图13)。如图14所示，通过如借助qpcr所测量的载体基因组存在来评估初步生物分布(将＞100个载体基因组/1μg基因组dna定义为阳性)。接受raav-gba1(有和没有cbe)的小鼠在皮质中对于raav-gba1载体基因组呈阳性，表明icv递送导致raav-gba1递送至皮质。另外，在肝中检测到载体基因组，在脾中检测到很少，而在心脏、肾或生殖腺中未检测到。对于所有量度，第1天和第3天组之间没有统计学显著差异。
[0252]
在cbe模型中进行的更大规模研究进一步探索了raav-gba1在cbe模型中的有效剂量。使用25mg/kg cbe剂量模型，在p3经由icv递送赋形剂或raav-gbal，并且在p8开始每日ippbs或cbe治疗。考虑到在先前研究中观察到的有和没有cbe停用的组之间的相似性，在最后一次cbe剂量(p38-40)后一天将所有小鼠处死。评估三种不同raav-gba1剂量的效果，产生以下五组，每组10只小鼠(5m/5f)：
[0253]
赋形剂icv pbs ip
[0254]
赋形剂icv 25mg/kg cbe ip
[0255]
3.2e9vg(2.13e10vg/g脑)raav-gba1 icv 25mg/kg cbe ip
[0256]
1.0e10vg(6.67e10vg/g脑)raav-gba1 icv 25mg/kg cbe ip
[0257]
3.2e10vg(2.13e11 vg/g脑)raav-gba1 icv 25mg/kg cbe ip。
[0258]
在p37，最高剂量的raav-gba1拯救cbe治疗相关的增重失败。此外，与赋形剂 cbe治疗组相比，此剂量导致在疲劳转棒仪和楔形横梁上的表现在统计学上显著增加(图15)。在几组中观察到致死性，包括赋形剂治疗组和raav-gba1治疗组(赋形剂 pbs：0；赋形剂 25mg/kg cbe：1；3.2e9vg raav-gba1 25mg/kg cbe：4；1.0e10vg raav-gba1 25mg/kg cbe：0；3.2e10vg raav-gba1 25mg/kg cbe：3)。
[0259]
在活体研究完成时，将小鼠处死用于生化分析(图16)。通过荧光测定以生物学一式三份评估皮质中的gcase活性。与cbe治疗相比，cbe治疗的小鼠显示出降低的gcase活性，然而接受高raav-gba1剂量的小鼠显示出gcase活性在统计学上显著增加。cbe治疗的小鼠也具有glucer和glusph的积累，两者都通过施用高剂量的raav-gba1来拯救。
[0260]
除了建立的化学cbe模型之外，还在4l/ps-na遗传模型中评价了raav-gba1，所述4l/ps-na遗传模型对于gba1中的v394l gd突变是纯合的，并且还部分缺乏影响gcase定位和活性的鞘脂激活蛋白。这些小鼠表现出运动强度、协调性和平衡缺陷，如它们在横梁行走、疲劳转棒仪和金属丝悬挂测定中的表现所证明的。通常，这些小鼠的寿命少于22周。在初始研究中，通过icv在p23递送3μl最大滴度病毒，其中最终剂量为2.4e10vg(6.0e10 vg/g脑)。每组6只小鼠，治疗组为：
[0261]
wt 赋形剂icv
[0262]
4l/ps-na 赋形剂icv
[0263]
4l/ps-na 2.4e10vg(6.0e10vg/g脑)raav-gba1icv
[0264]
在raav-gbal递送后4周评估通过横梁行走测试的运动表现。与用赋形剂治疗的突变型小鼠相比，接受raav-gba1的突变型小鼠的组显示出更少的总滑动数和更少的每个速度下的滑动数的趋势，将运动功能恢复至接近wt水平(图17)。由于运动表型随着这些小鼠的年龄而变得更严重，所以在稍后的时间点评估了它们对这种和其他行为测试的表现。在活体研究完成时，在这些小鼠中评估脂质水平、gcase活性和生物分布。
[0265]
目前使用cbe模型测试另外的更低剂量的raav-gba1，其对应于0.03x、0.1x和1x建议的1期高临床剂量。每组包括每组10只小鼠(5m/5f)：
[0266]
赋形剂icv
[0267]
赋形剂icv 25mg/kg cbe ip
[0268]
3.2e8 vg(2.13e9 vg/g脑)raav-gba1 icv 25mg/kg cbe ip
[0269]
1.0e9 vg(6.67e9 vg/g脑)raav-gba1icv 25mg/kg cbe ip
[0270]
1.0e10 vg(6.67e10 vg/g脑)raav-gba1 icv 25mg/kg cbe ip。
[0271]
除运动表型以外，在皮质中评估脂质水平和gcase活性。还进行了治疗和分析的时间过程。
[0272]
启动了一项更大剂量范围的研究，以评价功效和安全性数据。用10μl raav-gba1注射了10只4l/ps-na小鼠(每组5m/5f)。使用异速生长脑重量计算，剂量与0.15x、1.5x、4.4x和14.5x建议的1期高临床剂量相关。注射组由以下组成：
[0273]
wt 赋形剂icv
[0274]
4l/ps-na 赋形剂icv
[0275]
4l/ps-na 4.3e9vg(1.1e10vg/g脑)raav-gba1 icv
[0276]
4l/ps-na 4.3e10vg(1.1e11vg/g/脑)raav-gba1 icv
[0277]
4l/ps-na 1.3e11vg(3.2e11vg/g脑)raav-gba1 icv
[0278]
4l/ps-na 4.3e11vg(1.1e12 vg/g脑)raav-gba1 icv。
[0279]
实施例9：raav载体的体外分析
[0280]
在体外和体内测试raav构建体。图18显示了编码颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白的raav构建体的体外表达的代表性数据。左图显示了颗粒蛋白前体(pgrn)elisa测定的标准曲线。下图显示了在用raav转导的hek293t细胞的细胞裂解物中通过elisa测定测量的pgrn表达的剂量-反应。moi＝感染复数(每个细胞的载体基因组数)。
[0281]
进行试点研究以评估编码单独的或与gba1和/或一种或多种抑制性rna组合的鞘脂激活蛋白原(psap)和scarb2的raav载体的体外活性。还测试了编码psap和颗粒蛋白前体(pgrn)的一种构建体。所测试的载体包括表3中所示的那些。“opt”是指为了在哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达而进行密码子优化的核酸序列。图19显示了表明与模拟转染细胞相比用每种构建体转染hek293细胞导致对应基因产物的过表达的代表性数据。
[0282]
进行试点研究以评估编码单独的或与一种或多种抑制性rna组合的trem2的raav载体的体外活性。所测试的载体包括表3中所示的那些。“opt”是指为了在哺乳动物细胞(例如人细胞)中表达而进行密码子优化的核酸序列。图36a-36b显示了表明与模拟转染细胞相比用每种构建体转染hek293细胞导致对应基因产物的过表达的代表性数据。
[0283]
表3
[0284]
id启动子抑制性rna启动子转基因i00015jl_内含子sncajetlongopt-psap_gba1i00039
‑‑
jetlongopt-psap-grni00046
‑‑
cbaopt-psapi00014jetlongsncajetlongopt-scarb2_gba1i00040
ꢀꢀ
jl，cd68opt-gba1，trem2
[0285]
实施例10：snca和tmem106b shrna构建体的测试
[0286]
hek293细胞
[0287]
本研究使用人胚肾293细胞系(hek293)(#85120602，sigma-aldrich)。将hek293细胞维持在含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(#15140122，thermo fisher scientific)的培养基(补充有10％胎牛血清[fbs][#10082147，thermo fisher scientific]的d-mem[#11995065，thermo fisher scientific])中。
[0288]
质粒转染
[0289]
使用lipofectamine 2000转染试剂(#11668019，thermo fisher scientific)根据制造商的说明进行质粒转染。简言之，将hek293细胞(#12022001，sigma-a1drich)以3x105个细胞/ml的密度铺板在不含抗生素的培养基中。第二天，在opti-mem溶液(#31985062，thermo fisher scientific)中合并质粒和lipofectamine 2000试剂。在5分钟后，将混合物添加到hek293培养物中。在72小时后，收获细胞用于rna或蛋白质提取，或进行成像分析。对于成像分析，在铺板细胞之前用0.01％聚-l-赖氨酸溶液(p8920，sigma-aldrich)预包被板。
[0290]
通过定量实时pcr(qrt-pcr)的基因表达分析
[0291]
使用power sybr green cells-to-ct试剂盒(#4402955，thermo fisher scientific)根据制造商的说明通过定量实时pcr(qrt-pcr)确定相对基因表达水平。使用lipofectamine 2000转染试剂(在50μl opti-mem溶液中的0.5μg质粒和1.5μl试剂)将候选质粒瞬时转染到铺板在48孔板(7.5x104个细胞/孔)上的hek293细胞中。在72小时后，从细胞中提取rna并将其用于逆转录以根据制造商的说明合成cdna。对于定量pcr分析，使用基因特异性引物对(250nm终浓度)和power sybr green pcr主混合物(#4367659，thermo fisher scientific)一式两份扩增2-5μl cdna产物。snca、tmem106b和gapdh基因的引物序列为：对于snca，为5
’‑
aag agg gtg ttc tct atg tag gc-3’(seq id no：71)，5
’‑
gct cct cca aca ttt gtc act t-3’(seq id no：72)；对于tmem106b，为5
’‑
aca cag tac cta ccg tta tag ca-3’(seq id no：73)，5
’‑
tgt tgt cac agt aac ttg cat ca-3’(seq id no：74)；以及对于gapdh，为5
’‑
ctg ggc tac act gag cac c-3’(seq id no：75)，5
’‑
aag tgg tcg ttg agg gca atg-3’(seq id no：76)。在quantstudio 3实时pcr系统(thermo fisher scientific)中进行定量pcr。通过管家基因gapdh将表达水平归一化并使用比较ct方法进行计算。
[0292]
荧光成像分析
[0293]
将在egfp编码区下游含有人snca基因的3
′‑
utr的egfp报告质粒用于验证snca和tmem106b敲低质粒。使用lipofectamine 2000转染试剂(在10μl opti-mem溶液中的0.04μg报告质粒、0.06μg敲低质粒和0.3μl试剂)将egfp报告质粒和候选敲低质粒同时转染到铺板在聚-l-赖氨酸包被的96孔板(3.0x104个细胞/孔)上的hek293细胞中。在72小时后，使用varioskan lux多模式读数器(thermo fisher scientific)在激发488nm/发射512nm下测量egfp信号的荧光强度。将细胞用4％pfa在rt下固定10分钟，并且与含有40μg/ml7-氨基放线菌素d(7-aad)的d-pbs一起在rt下孵育30分钟。在用d-pbs洗涤之后，使用varioskan读数器在激发546nm/发射647nm下测量7-aad信号的荧光强度以定量细胞数量。将每个7-aad信号水平的归一化egfp信号与对照敲低样品进行比较。
[0294]
酶联免疫吸附测定(elisa)
[0295]
将α-突触核蛋白报告质粒(其含有：人snca基因的3
′‑
utr；或tmem106b基因，其位于snca编码区下游)用于在蛋白质水平上验证敲低质粒。使用从hek293细胞中提取的裂解物通过elisa(#khb0061，thermo fisher scientific)确定α-突触核蛋白的水平。使用lipofectamine2000转染试剂(在25μl opti-mem溶液中的0.1μg报告质粒、0.15μg敲低质粒和0.75μl试剂)将候选质粒瞬时转染到铺板在48孔板(7.5x104个细胞/孔)上的hek293细胞
中。在72小时后，将细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物(#p8340，sigma-aldrich)的放射免疫沉淀测定(ripa)缓冲液(#89900，thermo fisher scientific)中裂解，并超声处理数秒钟。在冰上孵育30分钟之后，将裂解物在4℃下以20,000
×
g离心15分钟，并收集上清液。定量蛋白质水平。将板在varioskan读板仪中于450nm读数，使用softmax pro 5软件计算浓度。将所测量的蛋白质浓度归一化为用二喹啉甲酸测定(#23225，thermo fisher scientific)确定的总蛋白质浓度。
[0296]
图37和表4显示了通过gfp报告子测定(顶部)和α-syn测定(底部)指示在体外成功沉默snca的代表性数据。图38和表5显示了通过gfp报告子测定(顶部)和α-syn测定(底部)指示在体外成功沉默tmem106b的代表性数据。
[0297]
表4
[0298]
id启动子敲低启动子过表达i00007cmv_内含子snca_micmvopt-gba1i00008h1snca_shcmvopt-gba1i00009h1snca_pubsh4cmvopt-gba1i00014jl_内含子snca_mijetlongopt-scarb2_gbai00015jl_内含子snca_mijetlongopt-psap_gbai00016jl_内含子snca_mijetlongopt-ctsb_gbai00019jl_内含子snca_tmem_mijetlongopt-vps35i00023jl_内含子snca_mijetlongopt-gba1_il34i00024jl_内含子snca_mijetlongopt-gba2i00028内含子snca_broadshcmvopt-gba1i00029内含子snca_pubsh4cmvopt-gba1
[0299]
表5
[0300]
id启动子敲低启动子过表达i00010h1tmem_pubshcmvopt-grni00011jl_内含子tmem_mijetlongopt-gba1_grni00012h1tmem_shcmvopt-grni00019jl_内含子snca_tmem_mijetlongopt-vps35
[0301]
实施例11：itr“d”序列放置和细胞转导
[0302]
研究了放置itr“d”序列对raav载体的细胞转导的影响。如图20所示，用编码gcase的raav转导hek293细胞，所述编码gcase的raav具有1)野生型itr(例如，“d”序列在转基因插入物近侧且在itr末端远侧)或2)具有位于载体“外部”的“d”序列(例如，在itr末端近侧且在转基因插入物远侧的“d”序列)的itr。令人惊讶的是，数据表明具有位于“外部”位置的“d”序列的raav保留了有效地包装和转导细胞的能力(图40)。
[0303]
实施例12：颗粒蛋白前体raav的体外测试
[0304]
图39是描绘包含编码pgrn的表达构建体的载体的一个实施方案的示意图。通过注射编码pgrn(例如，密码子优化的pgrn)的raav载体，通过实质内或鞘内注射(诸如注射到小脑延髓池中)，颗粒蛋白前体在缺少grn(对于grn缺失为杂合的或纯合的)的啮齿动物的cns中过表达。
[0305]
在2月龄或6月龄时和年龄达到6个月或12个月时注射小鼠并分析以下中的一项或多项：grn在rna和蛋白质水平上的表达水平、行为测定(例如，改善的运动)、存活测定(例如，改善的存活)、小胶质细胞和炎症标志物、神经胶质增生、神经元损失、脂褐质沉积症和/或溶酶体标志物积累拯救(诸如lamp1)。对pgrn缺陷型小鼠的测定在例如arrant等人(2017)brain 140：1477-1465；arrant等人(2018)j.neuroscience 38(9)：2341-2358；以及amado等人(2018)doi：https：//doi.org/10.1101/30869(所述文献的全部内容以引用方式并入本文)中进行了描述。
[0306]
实施例13：颗粒蛋白前体raav的体外和体内测试
[0307]
进行体外和体内测定以分析编码颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白raav构建体(pr006(也称为pr006a)；参见图64)的效果。pr006包含具有aav9血清型的衣壳。
[0308]
体外非临床研究
[0309]
在hek293t细胞中源自pr006a的颗粒蛋白前体表达
[0310]
研究了pr006a在细胞背景下诱导颗粒蛋白前体蛋白产生的能力。在从2.1x105至3.3x106个载体基因组(vg)/细胞的感染复数(moi)范围内用pr006a转导hek293t细胞。pr006a转导导致颗粒蛋白前体蛋白表达和分泌到细胞培养基中的稳健的剂量依赖性增加(图60)。在仅用赋形剂(预期的临床媒介物)治疗的阴性对照组中检测到显著较低的颗粒蛋白前体蛋白水平，其反映了源自内源性人grn基因的表达。
[0311]
在ftd-grn ipsc衍生的神经元中的功效
[0312]
进行测定以分析raav构建体在体外在人ftd-grn(具有grn突变的额颞叶痴呆)神经元培养物中的功效。细胞系获自国家神经障碍和中风研究所(national institute of neurological disorders and stroke，ninds)人类细胞和数据储存库(human cell and data repository，nhcdr)：材料nd50015(ftd-grn，m1l)、nd50060(ftd-grn，r493x)和nd38555(对照，野生型)(参见表6)。
[0313]
表6：ipsc细胞系特征的汇总
[0314][0315]
为了建立与ftd-grn病理学相关的细胞模型，使用两步方案将来自每个细胞系的ipsc分化成神经元细胞。在第一步中，使ipsc分化成缺乏多能性标志物(即oct4和ssea1)表达且获得神经元干细胞标志物(即，sox2、巢蛋白、sox1和pax6)表达的增殖神经元干细胞(nsc)系，如通过免疫荧光标记所检测。
[0316]
以相同密度接种对照和ftd-grn nsc系，并且在48小时后，通过酶联免疫吸附测定(elisa)测量在细胞裂解物(细胞内颗粒蛋白前体)(图52e)和细胞培养基(分泌的颗粒蛋白前体)(图52a)中的颗粒蛋白前体的表达。将颗粒蛋白前体表达归一化为总蛋白质浓度以解释细胞数量的差异(n＝3；平均值
±
sem)。具有杂合grn突变的nsc系与对照nsc相比具有显著较低的细胞内和分泌的颗粒蛋白前体水平，其中ftd-grn nsc表达约25-50％的内源性颗
粒蛋白前体水平。这提示此ftd-grn细胞模型再现了在ftd-grn患者中观察到的临床颗粒蛋白前体缺乏，所述ftd-grn患者在血浆中表达正常颗粒蛋白前体水平的三分之一至二分之一(finch等人，brain 132，583-591(2009)；ghidoni等人，neurology 71，1235-1239，(2008)；sleegers等人，ann neurol 65，603-609(2009))。
[0317]
将来自所有细胞系的nsc分化成神经元培养物。在确定ipsc衍生的nsc表现出降低的颗粒蛋白前体表达之后，将细胞系分化成神经元以产生用于pr006a的非临床功效研究的临床代表性细胞类型。将nsc接种到神经元分化培养基中，在7天的时间段内最终分化成有丝分裂后神经元，然后通过免疫荧光评估神经元标志物(即map2、neun、tau、tuj1、nf-h)的表达(图52g)。对照和ftd-grn ipsc衍生的nsc系使用此方案均有效地分化成神经元。
[0318]
将ftd-grn ipsc衍生的神经元培养物用于评价pr006a在体外的功效。用赋形剂或pr006a以2.7x105、5.3x105或1.1x106vg/细胞的moi处理ftd-grn神经元。如通过elisa所测量的，pr006转导导致分泌的颗粒蛋白前体在所有细胞系中稳健的剂量依赖性表达(图52b)。评估赋形剂处理的对照和ftd-grn神经元的内源性颗粒蛋白前体水平。对照神经元表达了内源性分泌的颗粒蛋白前体，然而在ftd-grn神经元中没有检测到分泌的颗粒蛋白前体(图52b)。线性回归分析证实了两种ftd-grn细胞系中pr006a剂量和颗粒蛋白前体水平之间的显著相关性(p＝3.5x10-13
)。这些结果证明用pr006a处理导致ftd-grn神经元模型中颗粒蛋白前体的分泌升高。
[0319]
已知颗粒蛋白前体刺激溶酶体蛋白酶组织蛋白酶d(ctsd)的成熟，其功能的丧失也与溶酶体贮积病和神经退行性变有关。ctsd表达为无活性的全长原蛋白(proctsd)，其经历蛋白水解加工形成酶促活性的成熟蛋白酶(matctsd)。已经报道颗粒蛋白前体用作与proctsd结合的分子伴侣以增强其成熟为matctsd蛋白酶。在ftd-grn神经元培养物中，pr006转导拯救了组织蛋白酶d的缺陷性成熟(图52c)。用pr006a或赋形剂转导对照、ftd-grn#1和ftd-grn#2神经元。使用5.3x105pr006a的moi进行功效实验，因为其将颗粒蛋白前体水平恢复到对照细胞的水平的至少2倍(图52b)。为了评价功效，使用自动化simple western
tm
(jess)平台测量细胞裂解物中的proctsd和matctsd表达水平(图52c)。与赋形剂处理的对照神经元相比，赋形剂处理的ftd-grn神经元具有较低的matctsd与proctsd的比率；pr006a处理显著增加了两种ftd-grn神经元系的比率(图52c)。在对照神经元中，pr006a处理没有显著改变matctsd与proctsd的比率。这些发现证明pr006a恢复ftd-grn神经元中的溶酶体功能相关表型。
[0320]
在正常神经元中，tdp-43(反式激活应答dna结合蛋白43kda)蛋白质位于细胞核中。在ftd-grn患者死后的脑中，观察到tdp-43在神经元的细胞质中聚集，并且tdp-43的细胞核积累减少。ftd神经元具有降低的细胞核tdp-43，导致在神经元中的聚集和下游毒性。由于grn ko小鼠不能完全再现此tdp-43病理学，所以诱导性多能干细胞(ipsc)衍生的神经元是研究tdp-43生物学的有价值的ftd-grn模型。据报道，相对于不携带grn突变的对照神经元，在来自ftd-grn患者的ipsc衍生的神经元中，tdp-43在细胞核中的积累减少，并且不溶性tdp-43的积累增加，如valdez等人(human molecular genetics26，4861-4872(2017))所述。来自两种ftd-grn突变携带者谱系的神经元培养物的pr006a转导逆转了tdp-43异常，导致不溶性tdp-43减少(如使用simple western
tm
(jess)平台所测量(图52d))和tdp-43的细胞核定位增加(如使用免疫荧光所测量(图52f))。
[0321]
总之，pr006转导恢复了溶酶体酶组织蛋白酶d中的缺陷性成熟，并改善了ftd-grn神经元中的异常tdp-43病理学。
[0322]
体内非临床研究
[0323]
年老grn敲除小鼠中的功效和生物分布
[0324]
在grn敲除(ko)小鼠模型中评价了pr006a体内功效和最大剂量pr006a。在这些研究中使用的grn ko小鼠模型(b6(cg)-grn
tm1.1aidi
/j(jackson laboratory，bar harbor，me))中，外显子1-4从颗粒蛋白前体(grn)靶基因中缺失(yin et al.，j exp med 207，117-128(2010))。这些动物具有颗粒蛋白前体的完全丧失，显示出年龄依赖性表型，包括溶酶体改变、神经元脂褐质积累、泛素积累、小胶质细胞增生和神经炎症，并且因此被广泛用于ftd-grn模型。所有尝试均旨在消除研究偏倚；将小鼠分配到性别和体重平衡的治疗组，并且由合格人员对实验终点进行盲法评估。
[0325]
在最初的研究中，pr006a以9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)的剂量(由于注射体积限制和用于研究的病毒批次的物理滴度，这是研究时可实现的最高剂量)递送至年老的grn ko小鼠中。使用年老小鼠是因为许多ftd-grn相关表型(包括cns炎症和小胶质细胞增生)以年龄依赖性方式发展，表型的最显著表现出现在12-24月龄之间。
[0326]
在年老grn ko小鼠的研究中，通过单次脑室内(icv)注射施用pr006a。通过icv注射将10μl赋形剂(预期的临床媒介物；20mm ph 8.0的tris、200mm nacl和1mm mgcl2 0.001％普朗尼克(pluronic)f68)或9.7x10
10
vg pr006a(2.4x10
11
vg/g脑[基于400mg的成年小鼠脑重量])递送至两个年老grn ko小鼠群组中：(1)注射时16月龄(n＝4/组；prv-2018-027；图61)和(2)注射时14月龄(计划n＝3/组；prv-2019-002；图61)。注射之后两个月时将动物处死。
[0327]
在研究prv-2018-027中，将单剂量的pr006a递送至以下治疗组的16月龄小鼠中：
[0328]
模型icvicv剂量ngrn ko赋形剂不适用4(2m/2f)grn kopr006a9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)5(3m/2f)
[0329]
由于未预见的研究偏倚(基因型分型错误和动物过早损失)，研究prv-2019-002(14月龄群组)仅招募赋形剂治疗组的1只小鼠，而不是计划的n＝3。低样品数量使得无法进行统计分析，因此本研究不在此处作进一步讨论。然而，研究的结果与研究prv-2018-027的结果相当。
[0330]
生物分布和颗粒蛋白前体表达：通过使用qpcr测定测量载体基因组的存在来确定生物分布，所述qpcr测定符合现行美国食品药品管理局(u.s.food and drug administration)生物制品评价和研究中心(center for biologics evaluation and research，cber)/组织和先进疗法办公室(office of tissues and advanced therapies，otat)的pcr灵敏度标准(将＞50个载体基因组/1μg基因组dna定义为阳性)。接受pr006a的所有小鼠在大脑皮质和脊髓中的载体基因组均呈阳性，表明icv施用成功地导致脑和cns中的pr006a转导(图59a)。icv pr006a导致在grn ko小鼠的cns(脑、脊髓)中存在显著水平的人颗粒蛋白前体蛋白，然而正如预期的那样，在接受赋形剂的小鼠中无法检出人颗粒蛋白前体(图59b)。由于颗粒蛋白前体主要是分泌性蛋白质，csf中的表达可以被认为是在脑内蛋白质产生的替代物，并且代表csf颗粒蛋白前体水平已经降低的ftd-grn患者的潜在翻译
终点。我们能够在pr006a治疗的小鼠的csf中检测到人颗粒蛋白前体，但是由于小的样品体积和在小鼠中获得足够体积的csf的技术限制，csf颗粒蛋白前体水平的测量低于测定的定量下限(lloq)(图59c)。
[0331]
icv施用还导致在外周组织(包括肝、心脏、肺、肾、脾和生殖腺)中广泛的载体基因组存在和颗粒蛋白前体蛋白水平(图62a-图62b)。此外，在pr006a治疗的grn ko小鼠的血浆中可检测到显著水平的人颗粒蛋白前体。如所预期的，在赋形剂治疗的grn ko小鼠中没有检测到人颗粒蛋白前体。
[0332]
脂褐质积累：神经元脂褐质的积累是grn ko小鼠的标志性年龄依赖性表型，所述神经元脂褐质是在有丝分裂后细胞的溶酶体中随时间渐进地积累并且是溶酶体功能障碍的指示剂的电子密集的自发荧光物质。使用两种独立的方法在相邻脑切片中评估脂褐质积累：(1)在更临床的方法中，由盲法病理学家以0(未观察到脂褐质)至4(广泛的脂褐质积累)的等级对脑中的脂褐质积累进行评分，和(2)在更定量的方法中，通过免疫组织化学(ihc)检测脂褐质自发荧光并自动进行定量。grnko小鼠在整个脑中表现出显著的脂褐质沉积症，并且icv pr006a治疗降低了大脑皮质、海马体和丘脑中的脂褐质得分严重性(图59d)。根据ihc图像对脂褐质积累的定量还检测到在所有三个脑区域中使用pr006a治疗时脂褐质沉积症均减少。由于泛素阳性包涵体是ftd-grn患者的明确病理特征，其也以年龄依赖性方式在grn ko小鼠模型中积累，所以在所关注的脑区域(大脑皮质、海马体、丘脑)中进行ihc并定量以评估泛素积累。pr006a治疗显著地降低了grn ko小鼠中的泛素积累(图59e)。这些发现表明pr006a改善ftd-grn的grnko小鼠模型中的溶酶体功能障碍。
[0333]
神经炎症：慢性cns炎症是ftd-grn患者的脑中的病理学特征，其在grn ko小鼠中以年龄依赖性方式再现。颗粒蛋白前体在ftd-grn小鼠模型中具有抗炎症作用，并且颗粒蛋白前体的损失导致促炎症细胞因子(包括tnfα)的上调。在本研究中，用pr006a治疗抑制了年老grn ko小鼠中的炎症标志物水平。icv pr006a降低了大脑皮质中促炎症细胞因子tnf(tnfα)和小胶质细胞标志物cd68(cd68)的基因表达(图59f)。使用中尺度发现小鼠促炎症细胞因子测定，来自pr006a治疗的grn ko小鼠的大脑皮质样品中的tnfα蛋白质水平也降低(图59g)。为了进一步评价神经炎症，对小胶质细胞增生的标志物iba1和星形细胞增生的标志物gfap进行免疫组织化学(ihc)，并在所关注的脑区域(大脑皮质、海马体、丘脑)中进行定量。pr006a治疗在grn ko小鼠中导致小胶质细胞增生(ibal)减少的趋势，但不影响星形细胞增生(gfap)(图59h；图59i)。总之，这些结果表明pr006a治疗减少ftd-grn的年老grn ko小鼠模型中的神经炎症。
[0334]
组织病理学：由盲法委员会认证的病理学家对来自这些研究的所有小鼠的脑、胸脊髓、肝、心脏、脾、肺和肾的苏木精和曙红(h&e)染色的全面组织病理学分析揭示没有与pr006a治疗相关的不良事件。向grn ko小鼠施用pr006a导致作为模型特征的发现的发生率和/或严重性降低，包括髓质和脑桥中神经元坏死的频率和/或严重性得分的降低。此外，pr006a治疗降低了胸脊髓中轴索变性的发生率和严重性。在下文毒理学章节详细讨论了这些发现。
[0335]
结论：在9.7x10
10
vg(2.4x10
11
vg/g脑)的剂量下的icv pr006a导致在年老grn ko小鼠的整个脑和外周组织中广泛的载体基因组存在。pr006a治疗增加了总体颗粒蛋白前体表达。此外，pr006a减少了脑中脂褐质和泛素的积累，已知在grn ko小鼠模型和ftd-grn患
者中都出现病理学。pr006a还降低了在大脑皮质中促炎症细胞因子的表达和免疫细胞激活，它们是指示慢性cns炎症的表型。
[0336]
成年grn敲除小鼠中的剂量范围功效
[0337]
为了进一步评估pr006a的有效剂量，在成年grn ko小鼠中进行更大的剂量范围研究。在prv-2019-004中，通过icv将10μl赋形剂(预期临床媒介物；20mm ph 8.0的tris、200mm nacl和1mm mgcl2 0.001％普朗尼克f68)或pr006a递送至4月龄动物。使用这些成年小鼠代替年老的grn ko小鼠，因为后者没有足够的数量可获得用于进行剂量范围研究。尽管成年grn ko小鼠具有比年老小鼠更温和的表型，但它们仍然表现出溶酶体缺陷和神经炎症性改变，并且因此适合于评价pr006a的有效剂量范围。为了评估pr006a在宽范围的病毒剂量上的功效，将pr006a以1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)(由于注射体积限制和用于研究的病毒批次的物理滴度而在研究时可实现的最高剂量)、1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)的中等剂量或1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)的低剂量施用，其中全对数差跨越每个剂量。在图63中给出了实验设计的细节。
[0338]
评估pr006a的三个剂量，每组10只小鼠(4m/6f)：
[0339]
模型icvicv剂量ngrn ko赋形剂不适用10(4m/6f)grn kopr006a1.1x109vg(2.7x109vg/g脑)10(4m/6f)grn kopr006a1.1x10
10
vg(2.7x10
10
vg/g脑)10(4m/6f)grn kopr006a1.1x10
11
vg(2.7x10
11
vg/g脑)10(4m/6f)
[0340]
与具有野生型(wt)grn等位基因的grn ko小鼠(7月龄c57bl/6j)具有相同背景品系的年龄匹配小鼠用作本研究中选择功效终点的对照。
[0341]
模型icvicv剂量nwt(c57bl/6j)不适用不适用10(5m/5f)
[0342]
生物分布和颗粒蛋白前体表达：通过使用qpcr测定测量载体基因组的存在来确定生物分布，所述qpcr测定符合现行美国食品药品管理局cber/otat的pcr灵敏度标准(将＞50个载体基因组/μg基因组dna定义为阳性)。接受pr006a的小鼠在大脑皮质和脊髓中以剂量依赖性方式对载体基因组呈阳性，表明icv施用成功地导致cns中的pr006a转导(图53a)。pr006a编码的grn的qrt-pcr分析揭示了pr006a的icv给药导致在大脑皮质中人grnmrna表达的剂量依赖性诱导(图53b)。pr006a治疗增加在脑和脊髓中的人颗粒蛋白前体蛋白的水平(图53c)。在脑组织中，在最高pr006a剂量下检测并定量人颗粒蛋白前体水平；在较低剂量下，由于脑中的高背景，颗粒蛋白前体水平低于测定的检测极限。然而，基于剂量之间的对数倍数差异，在较低剂量下预期的颗粒蛋白前体水平的比例估计将远低于在脑组织中测定的定量下限(lloq)。在具有野生型(wt)grn等位基因的年龄和品系匹配的小鼠中测量了内源性小鼠颗粒蛋白前体的水平；在大脑皮质和脊髓两者中，pr006a治疗的grn ko小鼠中人颗粒蛋白前体的水平在任何剂量下都不超过wt小鼠中内源性颗粒蛋白前体的水平。由于采用非物种交叉反应性抗颗粒蛋白前体抗体的不同检测测定用于测量人和小鼠颗粒蛋白前体，因此绝对数量不能准确地进行比较。
[0343]
pr006a施用还导致在外周组织(包括肝、心脏、肺、肾、脾和生殖腺)中广泛的载体基因组存在和颗粒蛋白前体蛋白水平(图53d；图53e)。
14，7(2013))来确定与相同品系的年龄匹配的wt小鼠相比在7月龄的赋形剂治疗的grn ko小鼠中哪些基因表达途径被改变。我们证实了缺乏grn的小鼠中溶酶体和免疫相关途径的缺陷，如先前公开的研究中所报道的。在go term(go：0005773)“液泡”基因的子集(含有4个据报道在grn ko小鼠中失调的基因，如lui等人(cell 165，921-935(2016))所描述的)、“溶酶体基因”集(据显示在grn ko小鼠中失调的25个溶酶体相关基因的子集，如evers等人(cell reports 20，2565-2574(2017))所描述的)以及来自基因集富集分析hallmark数据库的“补体”基因集(含有编码补体系统的组分(先天免疫系统的部分)的基因)中报道了显著的变化。然后我们测量并比较了用pr006a治疗时这些基因集的活性水平(图53l-图53n)。用pr006a治疗剂量依赖性地逆转了在grn ko小鼠中观察到的基因集缺陷。
[0348]
组织病理学：由盲法委员会认证的病理学家对来自这些研究的所有小鼠的脑、胸脊髓、肝、心脏、脾、肺、肾和生殖腺的苏木精和曙红(h&e)染色进行的全面组织病理学分析发现没有与pr006a治疗相关的毒性的证据。在下面章节中提供了毒性分析的详情。
[0349]
结论：在从2.7x109vg/g脑至2.7x10
11
vg/g脑范围内的剂量下的icv pr006a以剂量依赖性方式导致在整个脑和外周组织中广泛的载体基因组存在。pr006a治疗还导致在cns中的颗粒蛋白前体mrna和蛋白质的产生。在多个脑区域中观察到在pr006a和降低的脂褐质沉积症(溶酶体功能障碍的读数)之间的清楚的剂量-反应关系。在pr006a的中等和最高剂量水平下观察到稳健且统计学显著的脂褐质沉积症减少。所有pr006a剂量都减少了脑中的泛素积累。从2.7x109vg/g脑的最低剂量开始，pr006a在rna和蛋白质水平上降低了脑中的促炎症标志物的表达。
[0350]
概要：体内非临床研究
[0351]
pr006a有效地转导grn ko小鼠，导致转基因的稳健的剂量依赖性生物分布和在cns中的颗粒蛋白前体mrna和蛋白质的产生。pr006a剂量依赖性地逆转了溶酶体和神经炎症途径中的基因表达异常。pr006a降低了在这种ftd-grn小鼠模型的脑中出现的许多表型，包括脂褐质沉积症、泛素积累和小胶质细胞增生。在剂量范围研究中，最低剂量即2.7x109vg/g脑的pr006a显著抑制了大脑皮质中炎症标志物的表达。中等剂量即2.7x10
10
vg/g脑的pr006a以稳健且统计学显著的方式改善了溶酶体缺陷(例如，脂褐质沉积症)和神经炎症。高剂量即2.7x10
11
vg/g脑的pr006a进一步增加了颗粒蛋白前体表达而没有毒性的证据。
[0352]
表7：生物分布汇总
[0353][0354]
将阳性生物分布定义为＞50vg/μg基因组dna。
[0355]
安全性药理学
[0356]
在整个这些研究中，没有可归因于测试物的不良事件。在prv-2018-027、prv-2019-002和prv-2019-004中来自动物的活体和组织病理学分析的安全性结果在下面章节
中进行讨论。
[0357]
单剂量毒性
[0358]
进行了一系列使用pr006a的非临床研究，以研究在小鼠和猴中的安全性终点。在grn ko小鼠模型中进行了三项研究，其中终点包括神经病理学评价和评估保护活性以及由通过脑室内(icv)注射施用pr006a引起的潜在毒性；在小鼠中icm施用在技术上更困难。这些小鼠模型代表ftd-grn，其中患者在grn基因中具有突变，导致颗粒蛋白前体水平降低。在食蟹猴中，神经病理学也作为将pr006a注射到小脑延髓池(icm)中的试点研究的一部分进行。在食蟹猴中进行glp研究，其中将pr006a递送至icm，并且在第7天、第30天或第183天处将猴处死。除了对完整的组织列表进行解剖病理学评价以外，glp研究还纳入了全面的临床终点列表。为了支持临床中的单剂量施用，进行了以下单剂量研究。
[0359]
在年老的ftd-grn小鼠模型中的最大剂量pr006a(prv-2018-027和prv-2019-002)
[0360]
作为grn ko小鼠中的这些功效研究的一部分，在用赋形剂或pr006a进行icv治疗的小鼠中进行了神经病理学评价。grn ko小鼠具有颗粒蛋白前体的完全丧失，并且由于它们的年龄依赖性表型而广泛用作ftd-grn模型，所述表型包括溶酶体改变、神经元脂褐质积累、小胶质细胞增生和神经炎症。本研究的药理学部分的各方面汇总在上文各章节中，然而本研究中评估的毒理学相关终点汇总如下。在年老的grn ko小鼠模型中进行了pr006a的两项研究。在第一项研究(prv-2018-027)中，9只16月龄的混合性别grn ko小鼠接受了pr006a或赋形剂的icv施用。施用后9周将动物处死。本研究中包括单一pr006a剂量组：10μl未稀释的病毒，总剂量为9.7
×
10
10
vg(2.4
×
10
11
vg/g脑)，并且对照组用10μl赋形剂治疗。
[0361]
表8：研究设计prv-2018-027
[0362][0363]
roa：施用途径
[0364]
作为本研究方案的一部分，评价了各种死后终点，诸如生物分布、溶酶体改变和炎症标志物(参见上文章节)。每天还检查动物存活两次，并且每天测量体重一次。在治疗后2个月安乐死之后，收获靶组织，投下固定在冷冻的4％多聚甲醛中，并储存在4℃下。对完成研究的8只动物的组织进行修剪，加工并包埋在石蜡块中。然后将它们以～5μm切片，用苏木精和曙红(h&e)染色并由委员会认证的兽医病理学家检查。
[0365]
在本研究期间，治疗组中有1只小鼠提前死亡；在尸检期间未记录到死亡动物的异常情况，并且因此不存在已知的死亡原因。未观察到其他死亡或异常情况。所有治疗组在体重方面相似地跟踪，不存在显著差异。
[0366]
在组织病理学检查方面，没有pr006a相关的不良发现。在脑中存在广泛的脂褐质积累，与在grn ko小鼠中的预期发现一致。在pr006a治疗的动物中，在脑的所有区域中存在脂褐质积累的得分严重性的降低。形态学变化也似乎证明了频率和/或严重性得分的轻微降低，特别是对于用pr006a治疗的髓质和脑桥中的神经元坏死。然而，形态学变化的这些趋
势与脂褐质得分的趋势不一致。
[0367]
在胸脊髓中，存在轴索变性，并且观察到极少的(每组4只动物中有1只)很轻微的神经元坏死。在用pr006a治疗的动物中轴索变性的发生率和严重性都有小幅下降。
[0368]
推测与grn纯合敲除小鼠相关的以下发现似乎在用pr006a治疗的动物中具有降低的发生率和/或严重性：肾髓质中的小管扩张、肾中的肾小球病、以及肺中有异物(特征为线性、无细胞、暗粉色结构，通常在气道内并且经常与异物巨大细胞和/或巨噬细胞相关)。关于更明确的结论，需要更大的动物群组。
[0369]
在赋形剂治疗和供试品治疗的动物中观察到的所有其他组织病理学发现被认为是偶然的和/或具有相似的发生率和严重性，并且因此被认为与施用pr006a无关。
[0370]
在第二项研究(prv-2019-002)中，5只14月龄的混合性别grn ko小鼠接受了pr006a或赋形剂的icv施用。施用之后8周时将动物处死。本研究中包括单一pr006a剂量组：10μl未稀释的病毒，总剂量为9.7
×
10
10
vg(2.4
×
10
11
vg/g脑)，并且对照组用10μl赋形剂治疗。
[0371]
表9：研究设计prv-2019-002
[0372][0373]
*在研究结束时的基因型结果证实来自赋形剂组的n＝1只动物是grn杂合的ko而不是预期的grn纯合的ko。
[0374]
以与研究prv-2018-027相同的方式分析动物。每天检查动物存活两次，并且每天测量体重一次。在治疗后2个月安乐死之后，收获靶组织，投下固定在冷冻的4％多聚甲醛中，并储存在4℃下直至评价。
[0375]
在cns中，在脑中观察到与先前在grn ko小鼠中观察到的那些一致的发现(yin等人，j exp med 207(1)：117-128(2010))。具体地，在整个脑中的脂褐质积累普遍增加。还观察到很少的最小神经元坏死(在单只未治疗的早期死亡动物中和在一只赋形剂动物中)。
[0376]
由于低样品数量，无法证实与治疗相关的结果的一致趋势。供试品(pr006a)和赋形剂之间的反应没有一致的差异。
[0377]
对于非cns组织，在肾(单核炎症细胞的小管扩张和浸润)和肝(枯否细胞/窦内衬细胞的空泡化、和枯否细胞微肉芽肿)中观察到被认为与grn ko小鼠的表型一致的发现(yin等人，j exp med 207(1)：117-128(2010))。
[0378]
在经历手术并招募到研究中的所有动物中均观察到“肾小球病”的发现。尽管没有发现该发现作为与标准的、未激发的、grn敲除小鼠相关的变化的公开报道，但是一项研究已经证明了用诱导高同型半胱氨酸血症饮食治疗的颗粒蛋白前体缺陷型小鼠发展出肾小球基底膜增厚和足细胞足底过程消失(fu等人，hypertension 69(2)：259-266(2017))。
[0379]
所有其他发现与在实验室小鼠中通常观察到的那些一致。由于低样品数量，不能显示与治疗相关的确切差异。
[0380]
在成年ftd-grn小鼠模型中的剂量范围pr006a(prv-2019-004)
[0381]
为了进一步评估pr006a的安全性，在成年grn ko小鼠中进行更大的剂量范围研
究。将共40只混合性别小鼠分成4组，并且通过单次单侧icv注射向左半球施用赋形剂或三种剂量之一的pr006a；所有动物(无论是否治疗组)均接受10μl的总剂量体积。在4月龄时治疗小鼠并在治疗后3个月安乐死。另外的野生型(wt)对照组，其包括年龄为大约7个月的未治疗的c57bl/6j小鼠(相同的背景品系)，也被安乐死并进行类似的尸检。
[0382]
根据以下研究设计进行研究：
[0383]
表10：研究设计prv-2019-004
[0384][0385]
在研究期间，每天检查动物存活两次并每周称重一次。在治疗后3个月对小鼠实施安乐死，并且进行各种死后评价以评估pr006a的功效(参见上文章节)。此外，由委员会认证的病理学家评价来自脑、胸脊髓、肝、心脏、脾、肺、肾和生殖腺的h&e染色的切片。
[0386]
在组织病理学检查中，无论是否治疗组，在任何小鼠中都没有不利的pr006a相关发现。
[0387]
发现与grn ko小鼠模型表型一致，诸如在脑的不同区域中的细胞内脂褐质的积累：大脑皮质、大脑细胞核海马体、丘脑/下丘脑、小脑和脑干(特别是脑桥和髓质)。没有观察到在h&e染色的切片上的形态学变化(神经元空泡化和神经胶质增生)的明显证据。脂褐质色素的积累可以在易于检测的形态变化之前进行，并且因此充当功效的适当生物标志物。尽管所有grn纯合的ko组均指示脂褐质积累，但在治疗组之间该发现的严重性存在差异。对于用赋形剂治疗的动物组(第1组)，脂褐质积累的较高得分的频率最大。在用pr006a治疗的那些动物中，在第4组(低剂量pr006a；2.7
×
109vg/g脑)中观察到较高得分的频率，其次为第3组(中剂量pr006a；2.7
×
10
10
vg/g脑)。在第2组(高剂量pr006a；2.7
×
10
11
vg/g脑)中观察到最低的严重性得分。这些发现证明grn纯合敲除小鼠的脑中细胞内脂褐质积累的严重性得分的剂量依赖性降低。在赋形剂和供试品治疗的动物中所有其他组织病理学发现被认为是偶然的和/或具有相似的发生率和严重性，并且因此被认为与施用pr006a无关。
[0388]
猴中的glp单剂量研究(prv-2018-028)
[0389]
研究设计
[0390]
本glp研究的目的是评价供试品pr006a在食蟹猴中通过icm注射施用一次时的毒性和生物分布，其中施用后观察期为6天、29天或182天；在研究第7天、第30天或第183天将动物处死。将研究设计为评价2种剂量水平：最高剂量是用1.2ml体积(施用所经历的最高体积)未稀释的pr006a可达到的最大可行剂量，而较低剂量相当于比高剂量低一个对数单位。剂量相当于4.8
×
10
11
vg的低剂量和4.8
×
10
12
vg的高剂量；在食蟹猴(本研究中使用的nhp物种)中，脑重量估计为74g，这转化为大约6.5
×
109vg/g脑和6.5
×
10
10
vg/g脑。该研究还包
括对照组，其中动物仅接受1.2ml赋形剂(20mm ph 8.0的tris、200mm nacl和1mm mgcl2 0.001％[w/v]普朗尼克f68)。本研究利用雄性和雌性食蟹猴。第7天组包括最高剂量的1只雌性动物，并且被设计为早期毒性的前哨；其余两个时间点(第30天和第183天)包括每个剂量的2只雄性动物和1只雌性动物。除了来自多个脑区域的样品之外，收集外周组织样品用于qpcr分析。分析qpcr呈阳性的所有样品的转基因表达。表11中提供了本研究设计的制表汇总。
[0391]
表11：glp nhp研究prv-2018-028的概述
[0392]
[0393]
[0394][0395]
缩写：f，雌性；icm；小脑延髓池内；m，雄性；mgcl2，氯化镁；nacl，氯化钠；vg，载体基因组；drg，背根神经节；galt，肠相关淋巴样组织。
[0396]
通过多个活体观察和测量来评估食蟹猴nhp，所述多个活体观察和测量包括死亡率/发病率(每天)、临床观察(每天)、体重(基线和此后每周)、食物消耗的视觉检查(每天)、神经学观察(基线和在第2周和第26周期间)、间接检眼镜检查(基线和在第2周和第26周期间)和心电图(ecg)测量(基线和在第2周和第26周期间)。
[0397]
在基线和在第7天、第30天或第183天处死时进行aav9衣壳的中和抗体(nab)分析。基线时(血液检查；一次尿分析)进行两次和在给药阶段的第1周和第13周期间进行一次由血液学、凝血、临床化学和尿分析组成的临床病理学检查。
[0398]
在第7天、第30天或第183天对动物实施安乐死并收获组织。表11中列出的组织(如果存在)收集自所有动物，称重(如果适用)并分成重复样。一份重复样保存在10％中性缓冲福尔马林中(除非当最佳固定需要特殊固定剂时)用于组织病理学评价(所有动物)。收集另外的重复样用于qpcr和转基因表达分析。
[0399]
安全性和毒理学
[0400]
未发生非计划死亡，并且所有动物均存活直至计划尸检。没有不良pr006a相关临床观察结果、体重变化、眼科观察结果、或身体或神经学检查结果；尸检时的肉眼检查显示任何群组中均无药物相关异常。此外，在施用6.5
×
109或6.5
×
10
10
vg/g脑的雄性或组合性别中观察到pr间期、qrs持续时间、qt间期、校正qt(qtc)间期或心率不存在pr006a相关变化。在ecg的定性评估期间未观察到异常ecg波形或心律失常。
[0401]
生物分布
[0402]
使用基于qpcr的测定进行pr006a转基因的生物分布分析。在高剂量组(6.5
×
10
10
vg/g脑)的第183天，存在遍及cns和外周的广泛转导，其中所有组织检查对于载体存在均呈阳性，截止值为50vg/μg dna，其为qpcr测定的定量下限。在图54a中显示了来自从第183天选择代表性区域的数据；第30天数据未显示。在高剂量组(6.5
×
10
10
vg/g脑)的第30天，除硬膜以外，所有检查的cns组织均呈转导阳性。在第183天在cns中用低剂量(6.5
×
109vg/g脑)治疗的动物的组织呈阳性，但外周组织中仅脾和肝呈阳性。此外，用高剂量pr006a治疗的一只雌性nhp在第7天在卵巢中呈阳性，而用高剂量治疗的雄性在第30天和第183天在睾丸中呈阳性。pr006a转导在肝和神经系统组织中最稳健，并且在所检查的其他外周器官中始终较低。在脑中，当与第30天相比时，载体转导在第183天稳定，表明转基因的稳
健且持久的转导。
[0403]
在接受pr006a的icm施用的nhp中，对转基因产物颗粒蛋白前体有显著的同种异体免疫反应，在治疗后第30天和第183天收集的血清和csf样品中检测到抗颗粒蛋白前体抗体；所述免疫反应表明人颗粒蛋白前体蛋白在nhp中表达。使用已建立的免疫测定技术确定了抗药物抗体(ada)水平。数据如图54b所示。
[0404]
使用基于rt-qpcr的测定在mrna水平上以及使用simple western
tm
(jess)分析在蛋白质水平上测量pr006a(grn)的表达。在pr006a转导水平的同时，在第183天收集的选择脑区域(图54c)、肝、生殖腺、脊髓和drg中使用rt-qpcr通过mrna测量观察到转基因的表达。
[0405]
在两种剂量的pr006a下，在脑和肝中的转基因表达都是可测量的，并且表达水平都是剂量依赖性和持久的。在生殖腺中，仅在高剂量下在雄性中的表达是可测量的；在两种剂量下，在雌性中，在第7天和第30天表达是可测量的，但在第183天不可测量。
[0406]
为了证实在所治疗的nhp中产生人颗粒蛋白前体，在simple western
tm
(jess)平台上评价了csf中的蛋白质水平。在实施例14中提供了该方法的细节。通过测量来自ftd-grn患者的csf样品中的颗粒蛋白前体水平并确定它们是来自健康人对照和来自没有grn突变的ftd患者的csf样品中测量的水平的大约一半来鉴定所述方法。来自csf的结果表明，在用低和高剂量pr006a治疗的动物中颗粒蛋白前体的水平均以剂量依赖性方式升高(图54d)。这些结果表明，在icm施用后pr006a在nhp中的有效和广泛转导导致颗粒蛋白前体的水平增加。
[0407]
颗粒蛋白前体蛋白测量集中在csf上，因为simple western
tm
(jess)测定由于高水平的非特异性背景带而不适合于测量脑组织中的颗粒蛋白前体水平。由于高水平的非特异性背景，目前可用的测定不能可靠地测量nhp组织中转基因来源的人颗粒蛋白前体的水平。通常认为csf水平反映相关的脑浓度，并且它们作为翻译生物标志物对临床研究具有特别的价值。
[0408]
概要
[0409]
在排除启动临床研究的任何非临床研究中都没有不良安全性发现或毒性问题，包括在nhp中进行的小型试点非glp研究和在nhp中进行到第183天的glp研究。glp研究中的病理学发现在严重性上始终是最小的，在两个剂量组中受累细胞的数量较少。没有其他活体或验尸pr006a相关不良发现。
[0410]
在患有ftd-grn的人类受试者中的1/2期试验
[0411]
将在pr006重组aav的开放标签试验中招募人类受试者(n＝15)。受试者纳入标准包括：30-80岁(包含端值)，具有致病性grn突变，处于症状性疾病阶段，并且在研究性产品给药前有稳定使用背景药物。每名受试者将通过单次icm(小脑延髓池内)注射接受研究性产品。试验将包括3个月生物标志物读数、12个月临床读数以及5年安全性和临床随访。试验将分析：(1)安全性和耐受性；(2)关键生物标志物，包括：颗粒蛋白前体、nfl(神经丝轻链)和体积mri(磁共振成像)；以及(3)功效：cdr加nacc ftld(临床痴呆等级加国家阿尔茨海默病协调中心额颞叶痴呆)；行为、认知、语言、功能和qol(生活质量)的度量。
[0412]
表12：神经退行性疾病的实例
[0413][0414][0415]
表13：突触核蛋白病的实例
[0416][0417]
表14：tau蛋白病的实例
[0418]
[0419]
表15：溶酶体贮积病的实例
[0420][0421][0422]
实施例14：检溅脑脊液中的颗粒蛋白前体的自动化western测定
[0423]
本实验的目的是使用proteinsimple(san jose，ca)自动化western平台jess定量脑脊液(csf)中的颗粒蛋白前体(pgrn)的蛋白质水平。此测试方法可以用于分析非人灵长类(nhp)csf样品。为了确定人颗粒蛋白前体蛋白的表达水平，使用特异性地检测人颗粒蛋白前体蛋白的抗体在simple western
tm
(jess)平台上分析pr006a的转基因产物、来自非人灵长类受试者的csf样品。simple western
tm
平台是基于毛细管的自动化western印迹免疫测定平台，其中所有步骤(包括蛋白质分离、免疫探测、洗涤和通过化学发光进行的检测)均发生在毛细管卡盒中。将样品(以4倍稀释)和针对人颗粒蛋白前体的一抗(adipogen pg-359-7，以10倍稀释)，以及二抗和由proteinsimple生产的所有缓冲液加载到在jess平台上运行的定制卡盒中。在每次运行完成之后自动地进行半定量数据分析，其中使用jess仪器计算参数诸如信号强度、峰面积和信噪比。对于每个单独的样品，颗粒蛋白前体的水平被测量为对抗体的免疫反应性的峰面积。所有分析均使用设盲样品进行。
[0424]
对来自非人灵长类动物研究的csf样品进行本文所述的测定。测试csf样品中颗粒蛋白前体蛋白的存在和水平，以使用编码颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白的raav构建体(pr006；参见图64)研究基因疗法的功效。在此研究中，将赋形剂或pr006以低剂量的pr006
(1.8x10
10
vg/g脑重量)或高剂量的pr006(1.8x10
11
vg/g脑重量)通过小脑延髓池内(icm)注射递送到nhp动物中。每组由3只动物组成。在感染后第180天处死九只nhp动物(表16)，并且使用基于jess的测定分析csf样品。
[0425]
表16：按照分组和给药的nhp动物汇总
[0426][0427]
表17：用于自动化western测定的材料
[0428]
材料描述制造商品目号12-230kda jess分离模块，25个毛细管卡盒proteinsimplesm-w004ez标准包装1，12-230kdaproteinsimpleps-st01ez-8用于jess的抗小鼠检测模块proteinsimpledm-002颗粒蛋白前体单克隆抗体(人)，克隆pg359-7(一抗)adipogenag-20a-0052-c100
[0429]
注：在打开小瓶之前应让所有试剂升至室温。
[0430]
执行此方法时遵循以下程序：
[0431]
储备溶液的制备：
[0432]
1.通过向分离模块ez标准包装中的透明管添加40μl水来制备400mm dtt溶液。轻轻混合。
[0433]
2.为了制备主混合物，将20μl 10x样品缓冲液和20μl 400mm dtt添加到ez粉色主混合物管中。轻轻混合。
[0434]
3.为了制备生物素化分子量标准(ladder)，将20μl水用移液管吸取到带粉红色沉淀的ez透明生物素化分子量标准管中。轻轻混合。
[0435]
4.通过添加相等量的每一种来制备鲁米诺和过氧化物混合物。对于一次运行，向200μl过氧化物中添加200μl鲁米诺。
[0436]
5.通过混合25μl一抗和225μl抗体稀释液2制备一抗稀释液(10倍稀释)。
[0437]
样品的制备：
[0438]
1.将样品稀释在0.1x样品缓冲液中。通过将10μl 10x样品缓冲液添加到990μl水中制备0.1x样品缓冲液。
[0439]
2.必要时稀释样品。例如，在添加主混合物之前将nhp csf样品稀释4倍。将5μl nhp csf添加到15μl 0.1x样品缓冲液中。
[0440]
3.通过将1x主混合物添加到4x样品中来制备样品。为了运行技术重复样，每个样品制备总共15μl的样品加主混合物。例如，向12μl稀释样品中添加3μl主混合物。轻轻混合。
[0441]
4.将样品在95℃下煮沸5分钟。
[0442]
5.使用台式微型离心机将样品短暂离心。在加载样品之前涡旋。
[0443]
将试剂和样品加载到卡盒中：
[0444]
1.根据卡盒的图用移液管吸取所有样品。
[0445]
a.将15μl鲁米诺 过氧化物混合物用移液管吸取到泳道e中的每个孔中。
[0446]
b.将10μl链霉亲和素用移液管吸取到泳道d的第一个孔中。
[0447]
c.将10μl二抗用移液管吸取到泳道d中剩余的24个孔中。
[0448]
d.将10μl抗体稀释液用移液管吸取到泳道c中的第一个孔中。
[0449]
e.将10μl一抗稀释液用移液管吸取到泳道c中剩余的24个孔中。
[0450]
f.将10μl抗体稀释液用移液管吸取到泳道b中的所有孔中。
[0451]
g.将10μl所制备的ez分子量标准用移液管吸取到泳道a中的第一个孔中。
[0452]
h.将5μl样品和主混合物溶液用移液管吸取到泳道a中的一式两份泳道中。
[0453]
2.在室温下以2500rpm将卡盒旋转5分钟。
[0454]
将毛细管和卡盒装入仪器中：
[0455]
1.将毛细管装入槽中。确保灯光变为蓝色。
[0456]
2.将旋转后的卡盒装入仪器中。
[0457]
3.在仪器上的蓝色灯光停止闪烁后按下开始按钮。
[0458]
如果重复样的cv(变异系数)百分比为≤30％，则认为测定系统适用性可接受。
[0459]
在该测定用于检测nhp csf样品中的颗粒蛋白前体之前，如下测试该测定。jess测定的鉴定包括评估稀释线性、选择性和特异性。使用来自bioivt的正常csf样品确定jess测定的稀释线性。将来自具有pgrn突变的额颞叶痴呆(ftd)患者的csf样品(从阿尔茨海默病和相关痴呆的国家集中储存库(ncrad；indianapolis，indiana)获得)用于确定jess测定的选择性和特异性。
[0460]
表18：结果汇总
[0461][0462]
结果和讨论
[0463]
稀释线性
[0464]
在来自可商购获得的(bioivt)正常个体的csf样品中测试由jess检测的pgrn蛋白的稀释线性。测量csf样品中的内源性pgrn水平以确定稀释线性。在2-64倍稀释范围内的2
倍系列稀释中测试了两名个体。
[0465]
表19报告了由jess检测的58kda的pgrn蛋白的峰面积和各稀释度与16倍稀释度的％差异。线性范围内的结果为粗体字体(在100
±
30％差异内)。确定稀释线性在4至16倍稀释内。
[0466]
表19：csf样品中的稀释线性
[0467][0468]
总之，所有测试的基质均具有可接受的线性范围，其通过了0
±
30％的％差异的验收标准，尽管基质之间的稀释范围大小和稀释量不同。确定样品线性mrd为4倍稀释。确定稀释线性在4至16倍稀释度内。表20中描绘了通过csf验收标准的mrd和线性稀释范围汇总。
[0469]
表20：csf的mrd和线性稀释范围
[0470]
组织线性mrd线性稀释范围csf1∶41∶4-1∶16
[0471]
选择性和特异性
[0472]
在来自ncrad的pr006 ftd患者样品的csf样品中测试由jess检测的pgrn蛋白的选择性和特异性。从杂合的ftd患者(a组)、家族性非携带者(b组或c组)和正常个体(b组或c组)中收集三各组(a组、b组和c组)的csf样品。每组分析六个样品。各组的样品列于表16ftd患者csf样品信息中。
[0473]
将csf样品在由proteinsimple提供的0.1x样品缓冲液中稀释4倍，并以技术重复样进行测试。重新分析结果％cv大于20％的重复样。％cv小于20％的结果报告于表22中。表22报告了通过jess检测的58kda的pgrn蛋白的峰面积和一式两份之间的％cv。结果显示，与a组相比，b组和c组中的pgrn水平高约两倍，这表明jess测定在确定csf样品的pgrn水平方面的选择性和特异性(图55)。
[0474]
表21：ftd患者csf样品信息
0018yek-ki01)进行分析。来自elisa的结果(图56)显示与jess相似的组间pgrn水平的趋势，并且证明了jess测定适合用于评估csf样品中的pgrn水平。
[0479]
总之，此proteinsimple自动化western jess测定被确定为适合用于评估nhp csf样品中的pgrn水平。
[0480]
表23中显示了nhp csf样品的jess数据。每个样品代表两个技术重复样之间的平均值。报告了样品泳道中58kd条带的峰面积。数据表示为技术重复样的平均峰面积和调整的稀释倍数。
[0481]
表23：nhp csf样品的jess数据
[0482]
样品id剂量组峰面积(58kd)prv-028 d180 csf 101低剂量4944754prv-028 d180 csf 102对照4449066prv-028 d180 csf 103低剂量6222881prv-028 d180 csf 104高剂量5499901prv-028 d180 csf 105低剂量4293853prv-028 d180 csf 106高剂量10149400prv-028 d180 csf 107对照1360173prv-028 d180 csf 108对照5742081prv-028 d180 csf 109高剂量9658597
[0483]
此测定的目标是证实在pr006转导后用于nhp研究的所关注组织区域中颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白表达水平的水平。这使用自动化western平台来进行，其中使用单克隆抗体检测颗粒蛋白前体蛋白。在对照和pr006治疗的nhp两者的csf中颗粒蛋白前体表达是可测量的；该测定没有在内源性颗粒蛋白前体蛋白和pr006a诱导的颗粒蛋白前体蛋白之间作出区分。
[0484]
本技术以引用方式整体并入以下文件的内容：国际pct申请公开号wo 2019/070893；国际pct申请公开号wo 2019/070891；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的美国临时申请序列号62/567,296；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的62/567,311；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的62/567,319；2018年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的62/567,301；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的62/567,310；2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的62/567,303；和2017年10月3日提交的标题为“用于溶酶体病症的基因疗法(gene therapies for lysosomal disorders)”的62/567,305。
[0485]
已经如此描述了本发明的至少一个实施方案的若干方面，应当理解，本领域技术人员将容易地想到各种改变、修改和改进。此类改变、修改和改进旨在是本公开的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为实例。
[0486]
虽然本文已经描述和说明了本发明的几个实施方案，但是本领域的普通技术人员
将容易地想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造都意味着是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教导的一种或多种具体应用。本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以按不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，如果此类特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互不一致的，则两种或更多种此类特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合都包括在本发明的范围内。
[0487]
如本文在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个”和“一种”应该理解为意指“至少一个”，除非清楚地相反指示。
[0488]
如本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即要素在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在。除了由“和/或”条款具体指明的要素之外可以任选地存在其他要素，无论与具体指明的那些要素相关还是不相关，除非明确地相反指示。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言诸如“包含”使用时，对“a和/或b”的提及在一个实施方案中可以是指a而没有b(任选地包括除b以外的要素)；在另一个实施方案中，指b而没有a(任选地包括除a以外的要素)；在再一个实施方案中，指a和b两者(任选地包括其他要素)；等等。
[0489]
如本文在说明书和权利要求中所用，“或”应理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含许多要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，另外的未列出的项目。清楚地相反指示的仅有术语，诸如“其中的仅一个”或“其中的确切地一个”，或当在权利要求中使用时，“由......组成”将是指包含许多要素或要素列表中的确切一个要素。一般而言，如本文所用的术语“或”应仅被解释为表示排他性替代物(即，“一个或另一个但不是两者”)，在其之前是排他性术语，诸如“任一个”、“其中的一个”、“其中的仅一个”或“其中的确切一个”。
[0490]
如本文在说明书和权利要求中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素可以任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或等效地，“a或b中的至少一个”或等效地“a和/或b中的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个，任选地包括多于一个a，而没有b存在(并且任选地包括除b以外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个b而没有a存在(并且任选地包括除a以外的要素)；在再一个实施方案中，是指至少一个(任选地包括多于一个)a以及至少一个(任选地包括多于一个)b(以及任选地包括其他要素)；等等。
[0491]
在权利要求中使用序数术语如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素，其本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先性、优先级或顺序或者其
中执行方法行为的时间顺序，而是仅用作区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但使用序数术语)的标记，以区分权利要求要素。
[0492]
还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文所要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于陈述所述方法的步骤或动作的顺序。
[0493]
在本技术中提及的每一个美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均以引用方式整体并入本文。
[0494]
序列
[0495]
在一些实施方案中，编码一种或多种基因产物(例如第一、第二和/或第三基因产物)的表达盒包含seq id no：1-91中任一个所示的序列或由其组成(或编码具有seq id no：1-91中任一个所示的序列的肽)。在一些实施方案中，基因产物由seq id no：1-91中任一个的一部分(例如片段)编码。
[0496]
编号的实施方案
[0497]
尽管有随附的权利要求，但是本公开提出了以下编号的实施方案：
[0498]
1.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的gcase蛋白的表达构建体，其中
[0499]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0500]
(ii)所述gcase蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0501]
2.如实施方案1所述的分离的核酸，其中所述gcase蛋白包含如seq id no：14所示的氨基酸序列或其部分。
[0502]
3.如实施方案1或2所述的分离的核酸，其中所述gcase蛋白由密码子优化的核酸序列、任选地如seq id no：15所示的核酸序列编码。
[0503]
4.如实施方案1至3中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0504]
5.如实施方案1至4中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0505]
6.如实施方案1至5中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0506]
7.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的鞘脂激活蛋白原蛋白的表达构建体，其中
[0507]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0508]
(ii)所述鞘脂激活蛋白原蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0509]
8.如实施方案7所述的分离的核酸，其中所述鞘脂激活蛋白原蛋白包含如seq id no：16所示的氨基酸序列或其部分。
[0510]
9.如实施方案7或8所述的分离的核酸，其中所述鞘脂激活蛋白原蛋白由密码子优化的核酸序列、任选地如seq id no：17所示的核酸序列编码。
[0511]
10.如实施方案7至9中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对
于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0512]
11.如实施方案7至10中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0513]
12.如实施方案7至11中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0514]
13.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的scarb2蛋白的表达构建体，其中
[0515]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0516]
(ii)所述scarb2蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0517]
14.如实施方案13所述的分离的核酸，其中所述scarb2蛋白包含如seq id no：18所示的氨基酸序列或其部分。
[0518]
15.如实施方案13或14所述的分离的核酸，其中所述scarb2蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：19所示的核酸序列编码。
[0519]
16.如实施方案13至15中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0520]
17.如实施方案13至16中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0521]
18.如实施方案13至17中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0522]
19.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的gba2蛋白的表达构建体，其中
[0523]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0524]
(ii)所述gba2蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0525]
20.如实施方案19所述的分离的核酸，其中所述gba2蛋白包含如seq id no：30所示的氨基酸序列或其部分。
[0526]
21.如实施方案19或20所述的分离的核酸，其中所述gba2蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：31所示的核酸序列编码。
[0527]
22.如实施方案19至21中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0528]
23.如实施方案19至22中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0529]
24.如实施方案19至23中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0530]
25.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的galc蛋白的表达构建体，其中
[0531]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0532]
(ii)所述galc蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0533]
26.如实施方案25所述的分离的核酸，其中所述galc蛋白包含如seq id no：33所示的氨基酸序列或其部分。
[0534]
27.如实施方案25或26所述的分离的核酸，其中所述galc蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：34所示的核酸序列编码。
[0535]
28.如实施方案25至27中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0536]
29.如实施方案25至28中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0537]
30.如实施方案25至29中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0538]
31.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的ctsb蛋白的表达构建体，其中
[0539]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0540]
(ii)所述ctsb蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0541]
32.如实施方案31所述的分离的核酸，其中所述ctsb蛋白包含如seq id no：30所示的氨基酸序列或其部分。
[0542]
33.如实施方案31或32所述的分离的核酸，其中所述ctsb蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：36所示的核酸序列编码。
[0543]
34.如实施方案31至33中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0544]
35.如实施方案31至34中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0545]
36.如实施方案31至35中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0546]
37.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的smpd1蛋白的表达构建体，其中
[0547]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0548]
(ii)所述smpd1蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0549]
38.如实施方案37所述的分离的核酸，其中所述smpd1蛋白包含如seq id no：37所示的氨基酸序列或其部分。
[0550]
39.如实施方案37或38所述的分离的核酸，其中所述smpd1蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：38所示的核酸序列编码。
[0551]
40.如实施方案37至39中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0552]
41.如实施方案37至40中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0553]
42.如实施方案37至41中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0554]
43.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的gch1蛋白的表达构建体，其中
[0555]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0556]
(ii)所述gch1蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0557]
44.如实施方案43所述的分离的核酸，其中所述gch1蛋白包含如seq id no：45所示的氨基酸序列或其部分。
[0558]
45.如实施方案43或44所述的分离的核酸，其中所述gch1蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：46所示的核酸序列编码。
[0559]
46.如实施方案43至45中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0560]
47.如实施方案43至46中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0561]
48.如实施方案43至47中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0562]
49.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的rab7l蛋白的表达构建体，其中
[0563]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0564]
(ii)所述rab7l蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0565]
50.如实施方案49所述的分离的核酸，其中所述rab7l蛋白包含如seq id no：47所示的氨基酸序列或其部分。
[0566]
51.如实施方案49或50所述的分离的核酸，其中所述rab7l蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：48所示的核酸序列编码。
[0567]
52.如实施方案49至51中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0568]
53.如实施方案49至52中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0569]
54.如实施方案49至53中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0570]
55.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的vps35蛋白的表达构建体，其中
[0571]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0572]
(ii)所述vps35蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0573]
56.如实施方案55所述的分离的核酸，其中所述vps35蛋白包含如seq id no：49所示的氨基酸序列或其部分。
[0574]
57.如实施方案55或56所述的分离的核酸，其中所述vps35蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：50所示的核酸序列编码。
[0575]
58.如实施方案55至57中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0576]
59.如实施方案55至58中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0577]
60.如实施方案55至59中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0578]
61.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的il-34蛋白的表达构建体，其中
[0579]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0580]
(ii)所述il-34蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0581]
62.如实施方案61所述的分离的核酸，其中所述il-34蛋白包含如seq id no：55所示的氨基酸序列或其部分。
[0582]
63.如实施方案61或62所述的分离的核酸，其中所述il-34蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：56所示的核酸序列编码。
[0583]
64.如实施方案61至63中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0584]
65.如实施方案61至64中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0585]
66.如实施方案61至65中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0586]
67.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的trem2蛋白的表达构建体，其中
[0587]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0588]
(ii)所述trem2蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0589]
68.如实施方案67所述的分离的核酸，其中所述trem2蛋白包含如seq id no：57所示的氨基酸序列或其部分。
[0590]
69.如实施方案67或68所述的分离的核酸，其中所述trem2蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：58所示的核酸序列编码。
[0591]
70.如实施方案67至69中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0592]
71.如实施方案67至70中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0593]
72.如实施方案67至71中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0594]
73.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列
(itr)的tmem106b蛋白的表达构建体，其中
[0595]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0596]
(ii)所述tmem106b蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0597]
74.如实施方案73所述的分离的核酸，其中所述tmem106b蛋白包含如seq id no：63所示的氨基酸序列或其部分。
[0598]
75.如实施方案73或74所述的分离的核酸，其中所述tmem106b蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：64所示的核酸序列编码。
[0599]
76.如实施方案73至75中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0600]
77.如实施方案73至76中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0601]
78.如实施方案73至77中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0602]
79.一种分离的核酸，其包含编码侧接有两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的颗粒蛋白前体(pgrn)蛋白的表达构建体，其由
[0603]
(i)相对于野生型aav2 itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区；和/或
[0604]
(ii)所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列编码。
[0605]
80.如实施方案79所述的分离的核酸，其中所述pgrn蛋白包含如seq id no：67所示的氨基酸序列或其部分。
[0606]
81.如实施方案79或80所述的分离的核酸，其中所述pgrn蛋白由密码子优化的核酸序列或如seq id no：68所示的核酸序列编码。
[0607]
82.如实施方案79至81中任一项所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0608]
83.如实施方案79至82中任一项所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0609]
84.如实施方案79至83中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0610]
85.一种包含编码第一基因产物和第二基因产物的表达构建体的分离的核酸，其中每个基因产物独立地选自如表1中所示的基因产物或其部分。
[0611]
86.如实施方案85所述的分离的核酸，其中所述第一基因产物是gcase蛋白或其部分。
[0612]
87.如实施方案85或86所述的分离的核酸，其中所述第二基因产物是limp2或其部分、或鞘脂激活蛋白原或其部分。
[0613]
88.如实施方案85至87中任一项所述的分离的核酸，其还编码干扰核酸(例如shrna、mirna、dsrna等)，任选地其中所述干扰核酸抑制α-syn或tmem106b的表达。
[0614]
89.如实施方案85至88中任一项所述的分离的核酸，其还包含一种或多种启动子，任选地其中所述一种或多种启动子中的每一种独立地为鸡β肌动蛋白(cba)启动子、cag启
动子、cd68启动子或jet启动子。
[0615]
90.如实施方案85至89中任一项所述的分离的核酸，其还包含内部核糖体进入位点(ires)，任选地其中所述ires位于所述第一基因产物和所述第二基因产物之间。
[0616]
91.如实施方案85至90中任一项所述的分离的核酸，其还包含自切割肽编码序列，任选地其中所述自切割肽是t2a。
[0617]
92.如实施方案85至91中任一项所述的分离的核酸，其中所述表达构建体包含位于所述第一基因产物和所述第二基因产物侧翼的两个腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)，任选地其中所述itr序列中的一个缺乏功能性末端分辨位点。
[0618]
93.如实施方案92所述的分离的核酸，其中相对于野生型aav2itr(seq id no：29)，所述itr中的至少一个包含经修饰的“d”区。
[0619]
94.如实施方案93所述的分离的核酸，其中所述经修饰的“d”区是相对于所述表达构建体位于所述itr外部的“d”序列。
[0620]
95.如实施方案93或94所述的分离的核酸，其中包含所述经修饰的“d”序列的所述itr是3
′
itr。
[0621]
96.如实施方案85至95中任一项所述的分离的核酸，其还包含try序列，任选地其中所述try序列如seq id no：28所示。
[0622]
97.一种分离的核酸，其具有如seq id no：1至91中任一个所示的序列。
[0623]
98.一种载体，其包含如实施方案1至97中任一项所述的分离的核酸。
[0624]
99.如实施方案98所述的载体，其中所述载体是质粒。
[0625]
100.如实施方案98所述的载体，其中所述载体是病毒载体，任选地其中所述病毒载体是重组aav(raav)载体或杆状病毒载体。
[0626]
101.一种组合物，其包含如实施方案1至97中任一项所述的分离的核酸或如实施方案98至100中任一项所述的载体。
[0627]
102.一种宿主细胞，其包含如实施方案1至97中任一项所述的分离的核酸或如实施方案98至100中任一项所述的载体。
[0628]
103.一种重组腺相关病毒(raav)，其包含：
[0629]
(i)衣壳蛋白；以及
[0630]
(ii)如实施方案1至97中任一项所述的分离的核酸、或如实施方案98至100中任一项所述的载体。
[0631]
104.如实施方案103所述的raav，其中所述衣壳蛋白能够穿过血脑屏障，任选地其中所述衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白或aavrh.10衣壳蛋白。
[0632]
105.如实施方案103或104所述的raav，其中所述raav转导中枢神经系统(cns)的神经元细胞和非神经元细胞。
[0633]
106.一种用于治疗患有或疑似患有帕金森病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施方案1至97中任一项所述的分离的核酸、如实施方案98至100中任一项所述的载体、如实施方案101所述的组合物或如实施方案103至105中任一项所述的raav。
[0634]
107.如实施方案106所述的方法，其中所述施用包括直接注射到所述受试者的cns，任选地其中所述直接注射是脑内注射、实质内注射、鞘内注射、小脑延髓内注射或其任何组合。
[0635]
108.如实施方案107所述的方法，其中直接注射到所述受试者的cns包括对流增强递送(ced)。
[0636]
109.如实施方案106至108中任一项所述的方法，其中所述施用包括外周注射，任选地其中所述外周注射是静脉内注射。
[0637]
110.一种用于治疗患有或疑似患有具有grn突变的额颞叶痴呆的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用重组腺相关病毒(raav)，所述raav包含：
[0638]
(i)包含含有表达构建体的核酸的raav载体，所述表达构建体包含与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；以及
[0639]
(ii)aav9衣壳蛋白。
[0640]
111.如实施方案110所述的方法，其中所述raav以从约1
×
10
13
个载体基因组(vg)至约7
×
10
14
vg范围内的剂量施用于所述受试者。
[0641]
112.如实施方案110或111所述的方法，其中所述raav通过注射到小脑延髓池中来施用。
[0642]
113.如实施方案110-112中任一项所述的方法，其中所述启动子是鸡β肌动蛋白(cba)启动子。
[0643]
114.如实施方案110-113中任一项所述的方法，其中所述raav载体还包含巨细胞病毒(cmv)增强子。
[0644]
115.如实施方案110-114中任一项所述的方法，其中所述raav载体还包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
[0645]
116.如实施方案110-115中任一项所述的方法，其中所述raav载体还包含牛生长激素聚a信号尾。
[0646]
117.如实施方案110-116中任一项所述的方法，其中所述核酸包含位于所述表达构建体侧翼的两个腺相关病毒反向末端重复(itr)序列。
[0647]
118.如实施方案117所述的方法，其中每个itr序列是野生型aav2 itr序列。
[0648]
119.如实施方案110-118中任一项所述的方法，其中所述raav载体还包含在5
′
itr与所述表达构建体之间的try区，其中所述try区包含seq id no：28。
[0649]
120.一种用于治疗患有或疑似患有具有grn突变的额颞叶痴呆的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用raav，所述raav包含：
[0650]
(i)包含核酸的raav载体，所述核酸按5
′
至3
′
顺序包含：
[0651]
(a)aav2 itr；
[0652]
(b)cmv增强子；
[0653]
(c)cba启动子；
[0654]
(d)编码pgrn蛋白的转基因插入物，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；
[0655]
(e)wpre；
[0656]
(f)牛生长激素聚a信号尾；和
[0657]
(g)aav2 itr；以及
[0658]
(ii)aav9衣壳蛋白。
[0659]
121.如实施方案120所述的方法，其中所述raav以约1
×
10
13
vg至约7
×
10
14
vg范围内的剂量施用于所述受试者。
[0660]
122.如实施方案120或121所述的方法，其中所述raav通过注射到小脑延髓池中来施用。
[0661]
123.如实施方案110-122中任一项所述的方法，其中所述raav以包含约20mm ph 8.0的tris、约1mm mgcl2、约200mm nacl和约0.001％w/v泊洛沙姆188的制剂施用。
[0662]
124.一种药物组合物，其包含：
[0663]
(i)包含以下项的raav：
[0664]
(a)包含含有表达构建体的核酸的raav载体，所述表达构建体包含与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；和
[0665]
(b)aav9衣壳蛋白；以及
[0666]
(ii)约20mm ph 8.0的tris，
[0667]
(iii)约1mm mgcl2，
[0668]
(iv)约200mm nacl，和
[0669]
(v)约0.001％w/v泊洛沙姆188。
[0670]
125.一种raav，其包含：
[0671]
(a)包含含有表达构建体的核酸的raav载体，所述表达构建体包含与编码pgrn蛋白的转基因插入物可操作地连接的启动子，其中所述转基因插入物包含seq id no：68的核苷酸序列；和
[0672]
(b)aav9衣壳蛋白，
[0673]
其用于治疗受试者的具有grn突变的额颞叶痴呆的方法中。
[0674]
126.一种定量脑脊液(csf)样品中的pgrn蛋白水平的方法，所述方法包括：
[0675]
(1)在含有二硫苏糖醇(dtt)和样品缓冲液的主混合物中稀释所述csf样品；
[0676]
(2)将稀释后的csf样品、抗颗粒蛋白前体抗体、检测所述抗颗粒蛋白前体抗体的二抗、鲁米诺和过氧化物加载到毛细管卡盒的孔中；
[0677]
(3)将所述毛细管卡盒装入自动化western印迹免疫测定仪器中；
[0678]
(4)使用所述自动化western印迹免疫测定仪器计算信号强度、峰面积和信噪比；以及
[0679]
(5)将所述csf样品中的颗粒蛋白前体蛋白水平定量为对于所述抗颗粒蛋白前体抗体的免疫反应性的峰面积。
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