降血糖组合物的制作方法

1.本发明属于食品领域，涉及一种功能性营养组合物，更具体的，涉及一种具有降血糖作用的功能性保健或营养组合物。


背景技术：

2.随着生活水平的提高和生活节奏的改变，“三高症”的发病率越来越高，“三高症”是指高血压、高血糖(糖尿病)和高血脂症。属于心脑血管疾病，它们主要是现代文明派生出来的“富贵病”，可能单独存在，也可能相互关联。例如：糖尿病人很容易同时患上高血压或高血糖症，而高血糖又是动脉硬化形成和发展的主要因素，动脉硬化患者血管弹性差，从而加剧血压升高。因此，出现这三种疾患中的任何一种，后期都易发展形成“三高症”，尤其在老年人、机体功能衰退者中发病率最高。
3.从全球看来患有糖尿病的人数每年都在增加，并且并未有明显有效治疗的手段。糖尿病发病率也随年龄的增长而增加，中老年糖尿病患者占糖尿病患者总人数的98％。而且，糖尿病还会引发多种并发症，糖尿病及其并发症会给患者带来肉体和精神的双重伤害，甚至会威胁患者的生命健康，同时也会给患者的家庭带来人力、物力双重损失。因此，预防糖尿病的发生、减轻糖尿病的危害，是我们现今社会急需解决的问题。现今社会多采用控制饮食、口服降血糖药物、注射胰岛素等方式来控制血糖，这不仅使患者摄入食品营养成分的多样性受限，而且还会给患者带来种种痛苦和不便。因此开发一款健康无副作用的降血糖的组合物显得尤为重要。
4.已知的是β-葡聚糖是由葡萄糖单位构成的，在微生物、植物和动物中广泛存在，是葡萄糖的多聚糖单位。结构上它们大部分是以β-1,3键结合，是一种聚合物，具有一定的生物活性。20世纪中叶，外国学者发现酵母细胞壁上存在着一种增强免疫功能的物质，20多年后才确定了这一活性物质就是β-1,3-葡聚糖。近几年的多项试验研究表明，β-葡聚糖在降血糖、减脂和提高免疫能力方面有显著的作用，对人体各种生理功能都有很大的益处。
5.作为β-葡聚糖其中一种来源的酵母葡聚糖来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，由于其特殊的结构具有多种生理活性，并且在美国fda已将它列入gras(通常认为是安全的)中，作为食品原料，被广泛运用于各种食品中。并且在大多数国家也允许其能在各类食品中得到运用。酵母葡聚糖作为膳食纤维，能被肠道细菌分解，促进胃肠蠕动，刺激消化液的分泌，具有辅助消化的功能；可增加肠道的蠕动，促进排便，从而有效防止便秘；可以增加人体肠道对钙、镁和锌的吸收。酵母葡聚糖独特的β-(1
→
3)骨架结构使其具有较强的免疫调节活性，能显著提高人体免疫力。
6.植物甾醇是中国、欧洲、美国等多个国家以及esc/eas等医学协会指南和共识均推荐血糖异常人群食用以帮助降低血糖和预防心血管疾病，推荐剂量为2～3g/天。
7.虽然一些结果显示β-葡聚糖以及植物甾醇似乎存在降血糖的功效，但针对二者的生物学实证研究并不充分(有报道燕麦β-葡聚糖摄入介于3至8周或许有利于2型糖尿病患者的血糖控制，但受限于小样本数，并无充分结论)。而将多种具有保健功效的物质混合使
用在目前最为普遍。例如：
8.引用文献1公开了一种健康食品组合物，由富含植物多酚和甾醇的谷物、中药及酵母组成。本发明通过多种生物活性物质群的综合作用发挥协同降血糖效果，多酚、甾醇、膳食纤维、蛋白质、多肽、低聚肽、β-葡聚糖、黄酮、d-手性肌醇、蜕皮激素等多层次、多靶点、多角度协同增效，在小鼠降血糖实验及临床实验中显示了优异的效果。
9.引用文献2公开了一种降血糖功能食品。该食品包括抗性淀粉、茶多酚及膳食纤维。该功能食品在抑制血糖快速升高方面具有显著效果，对于糖尿病及并发症患者具有良好的日常保健作用。
10.引用文献3公开了一种妊娠糖尿病专用型临床营养配方，其包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、药食同源成分、天然植物化合物以及新资源食品。其中，所述新资源食品选自初乳碱性蛋白、γ-氨基丁酸、壳寡糖、杜仲雄花、竹叶黄酮、酪蛋白磷酸肽、燕麦β-葡聚糖、酵母β-葡聚糖、辣木叶、低聚木糖中的至少一种。
11.引用文献4公开了一种降血糖药物组合物和保健功能性食品。其包括植物甾醇酯、红曲、番茄红、富铬酵母份制成，经试验证明具有显著的降血糖作用。
12.虽然上述现有技术已经通过多种功能性成分的添加在降血糖方面取得了一定的进展，但对于提供一种机理更明确、成分更为简单的降血糖功能性组合物而言，仍然有进一步探讨的空间。
13.引用文献：
14.引用文献1：cn113575928a
15.引用文献2：cn109602013a
16.引用文献3：cn106666728a
17.引用文献4：cn107095974a


技术实现要素：

18.发明要解决的问题
19.如前所述，本领域中已经提出了与血糖控制的各种功能性组合物。但在具体的研究实践中，发明人也发现了如下问题：
20.引用文献1中直接使用各种植物原料，对于有效性物质实际作用和用量并未考察。引用文献2中作为非必要组分中，提出了可以使用各种维生素、甾醇、氨基酸、β-葡聚糖中的一种，但对于单独使用这些组分是否具有降血糖作用并未提及。引用文献3成分复杂，虽然提及了β-葡聚糖，但并非作为必要的组分。引用文献4中虽然提及了植物甾醇的使用，但需要在其他多种物质配合下整体起到降血糖作用，具体协同效应组分之间的关系并不明显。
21.而上述这些现有技术并未提及β-葡聚糖与植物甾醇的协同降血糖的作用，并且在使用植物甾醇时用量通常较高。
22.因此，针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的问题在于提供一种组成简单的具有降血糖功能的组合物，该组合物中β-葡聚糖与植物甾醇在限定用量的配合下，能够获得协同增效作用，并且实验结果也能够显示该组合即使在植物甾醇用量或β-葡聚糖用量较低的情况下也能获得明显的降血糖的效果。
23.此外，本发明所提供的组合物也具有降血脂的效果。
24.用于解决问题的方案
25.通过本发明发明人长期的研究，发现通过以下的技术方案能够解决上述技术问题：
26.[1].本发明首先提供了一种功能性组合物，其中，所述组合物包括：
[0027]
i)一种或多种的植物甾醇；
[0028]
ii)一种或多种的来源的β-葡聚糖，
[0029]
其中，所述组合物中，所述植物甾醇与β-葡聚糖的用量比为45:1以下。
[0030]
[2].根据[1]所述的组合物，其中，所述植物甾醇与β-葡聚糖的用量比为0.01:1以上。
[0031]
[3].根据[1]或[2]所述的组合物，其中，所述植物甾醇选自4-无甲基甾醇、4-甲基甾醇和4,4
’‑
二甲基甾醇中的一种或多种。
[0032]
[4].根据[1]～[3]任一项所述的组合物，其中，所述β-葡聚糖选自来源于植物或者真菌的β-葡聚糖中的一种或多种。
[0033]
[5].根据[1]～[4]任一项所述的组合物，其中，所述植物甾醇的含量为0.1-10％；所述β-葡聚糖的含量为0.01％-0.1％。
[0034]
[6].根据[1]～[5]任一项所述的组合物，其中，所述β-葡聚糖包括酵母β-葡聚糖。
[0035]
[7].根据[1]～[6]任一项所述的组合物，其中，所述植物甾醇与β-葡聚糖的用量比为0.1～30:1。
[0036]
[8].根据[1]～[7]任一项所述的组合物，其中，所述组合物为液体或半固体。
[0037]
[9].进一步本发明提供了一种降血糖组合物，其中，所述组合物包括根据[1]～[8]任一项所述的组合物。
[0038]
[10].此外，本发明还涉及一种兼具降血糖和降血脂功效的食品，其中，所述食品经由以上[1]～[9]任一项所述的组合物而得到。
[0039]
[11].根据[10]所述的食品，其中，所述食品包括面食、饮料、可冲调食品、烘焙糕点、酱料或功能性营补充食品。
[0040]
[12].根据[11]所述的食品，其中，所述饮料包括水果或蔬菜类饮料、茶饮料、奶制品类饮料、维生素类功能性饮料。
[0041]
发明的效果
[0042]
通过上述技术方案的实施，本发明具有如下优势以及能够获得如下的技术效果：
[0043]
1)本发明提供的降血糖功能性组合物，组成简单明确，更有利于方便、准确的复配，也更有利于便利地添加或制备各种食品，尤其是饮料类的食品；
[0044]
2)本发明的组合物中β-葡聚糖与植物甾醇在限定用量的配合下，能够获得协同增效作用，并且该组合即使在植物甾醇用量较低的情况下也能获得明显的降血糖的效果；
[0045]
3)本发明的组合物的β-葡聚糖与植物甾醇用量均在安全用量范围内，因此可以长期使用，同时适用于各种不特定的人群；
[0046]
4)本发明的组合物除了具有明显的血糖调控功效以外，还具有辅助降血脂、抗疲劳以及提高免疫力等功效。
具体实施方式
[0047]
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：
[0048]
本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
[0049]
本说明书中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。
[0050]
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
[0051]
本说明书中，使用“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。
[0052]
本说明书中，所使用的“室温”表示“20℃”的室内环境温度。
[0053]
本说明书中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“％”均表示重量或质量百分含量。
[0054]
本说明书中，使用“基本上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。
[0055]
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
[0056]
《第一方面》
[0057]
本发明的第一方面中，提供了一种包括i)一种或多种的植物甾醇和ii)一种或多种的来源的β-葡聚糖的功能性组合物，该组合物表现出了具有明显的协同增效作用，以能够显著控制和降低人体血糖含量，同时也具有辅助降血脂、抗疲劳等提高免疫力的功效。
[0058]
本发明的技术方案主要是基于如下的见解而得到：
[0059]
本发明首先从(细胞)生物学角度验证了植物甾醇以及β-葡聚糖的安全用量范围，并且在该范围内，分别研究了二者各自的、以及在不同用量配合的情况下的生物学表现，因此，意外的发现了在特定含量的配合下，植物甾醇以及β-葡聚糖在降低人体血糖方面能够产生明显的协同增效作用。
[0060]
(植物甾醇)
[0061]
植物甾醇(phytosterol，亦称为植物固醇)是存在于高等植物中的固醇。在临床试验中，植物甾醇显示出可以阻断人体肠道中的胆固醇吸收位点，因此可以帮助减少人体中的胆固醇水平。
[0062]
植物甾醇的相对密度略大于水，不溶于水、酸和碱，可溶于多种有机溶剂，如溶解于植物油脂、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、二硫化碳和石油醚。植物固醇的物理化学性质主要表现为疏水性，但因其结构上带有羟基，故又具有亲水性，所以植物甾醇通常具有一定的乳化性。
[0063]
本发明中对于植物甾醇的种类没有特别限制，可以为4-无甲基甾醇、4-甲基甾醇和4,4
’‑
二甲基甾醇等中的一种或多种。在一些具体的实施方案中，本发明适用的植物甾醇
可以选自谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和相应的烷醇中的至少一种或它们的混合物。
[0064]
另外，植物固醇含量较高的植物食物包括植物油类、坚果种子类、豆类等。植物油中植物固醇含量以玉米胚芽油最高，其次为芝麻油；坚果种子类中开心果含量最高，其次为黑芝麻；豆类中以黄豆含量最高，其次为青豆；蔬菜水果及薯类中植物固醇含量较低。
[0065]
在本发明中一些具体的实施方案中，对于植物甾醇可以使用含有植物甾醇的植物原料以赋予最终组合物中的一定含量的植物甾醇，另外优选的，也可以直接使用从植物中提取的具有较高纯度的植物甾醇有效成分。
[0066]
进一步，对于使用提取的植物甾醇的使用方式，没有特别限制，可以直接使用这样的甾醇形成混合物，也可以先将植物甾醇制备为溶液或乳液的方式使用。
[0067]
(β-葡聚糖)
[0068]
beta-葡聚糖(简称β-葡聚糖)，属于纤维类多糖(复合糖)，结构上，它们大部分是以β-1,3键结合的一种聚合物，并且可来源于多种微生物、动物或植物。
[0069]
本发明中对于β-葡聚糖的具体来源没有特别限制，可以适用于本发明的β-葡聚糖的来源包括酵母、燕麦、大麦、真菌(菇类)以及藻类等中的一种或它们的混合物。可以进一步具体列举的例如燕麦β-葡聚糖、海带β-葡聚糖、热凝胶β-葡聚糖、金藻昆布β-葡聚糖、香菇β-葡聚糖、地衣β-葡聚糖、平菇β-葡聚糖、酵母多糖、黑木耳β-葡聚糖、大麦多糖。
[0070]
在本发明一些优选的实施方案中，对于β-葡聚糖，可以使用来自于酵母、燕麦、大麦来源的β-葡聚糖中的一种或它们的混合物，更优选地，选自酵母β-葡聚糖和/或燕麦β-葡聚糖。
[0071]
在本发明中一些具体的实施方案中，对于β-葡聚糖可以使用含有该成分的植物、真菌等原料以赋予最终组合物中的一定含量的β-葡聚糖，另外优选的，也可以直接使用从这些原料中提取的具有较高纯度的β-葡聚糖有效成分。
[0072]
进一步，对于使用提取的β-葡聚糖的使用方式，没有特别限制，可以直接使用这样的β-葡聚糖形成混合物，也可以先将β-葡聚糖制备为溶液或乳液的方式使用。
[0073]
(协同增效)
[0074]
尽管现有技术中，对于植物甾醇和β-葡聚糖的研究有初步的结论显示了二者均可能存在一定的调控血糖的功效，但一方面，对于二者是否存在或者可能形成协同增效的血糖调控能力并无研究和报告，另一方面，目前大部分现有方案在使用植物甾醇时，使用较高的用量以获得所需的效果，但对于植物甾醇是否可以在较低含量下也能与其他组分配合而起到协同增效作用未见研究和报道。
[0075]
本发明中，认为以特定含量将植物甾醇与β-葡聚糖组合使用，能够意外的发现对于血糖控制具有协同增效的现象。此外，也发现，该协同效应也赋予了在使用相对低计量的植物甾醇/β-葡聚糖的使用时也可以获得调控血糖的效果。
[0076]
具体而言，在本发明一些具体的实施方案中，植物甾醇与β-葡聚糖的用量比可以在45:1以下，优选为30:1，更优选在25:1以下，最优选在20:1以下，可以列举的为(17、18或19)：1以下，植物甾醇的比例过高，也存在两种组分的协同效果不佳的担忧。另外，对于该比例的下限，可以在0.01:1以上，优选为0.1:1以上，更优选为0.5:1以上，可以列举的为(0.3、0.8、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)：1以上。如果植物甾醇的比例过低，则存在
植物甾醇在低的绝对用量的情况下，存在两种组分的协同效果不佳的担忧。
[0077]
此外，只要满足上述使用比例，本发明提供的功能性组合物中植物甾醇和β-葡聚糖的用量(尤其是最高用量)在原则上就没有限制。但考虑到不同食品类型以及针对不同食品类型的功能性物质的添加量的食品安全法律法规，因此，在一些具体的实施方案中，以组合物的总质量计，从保证协同效果以及用量安全性的角度考虑，所述植物甾醇的含量可以为0.1质量％以上，优选为0.15～10质量％，更进一步优选为0.2～6质量％，再进一步优选为1～质量5％，更优选为2～3质量％；所述β-葡聚糖的含量可以为0.01质量％以上，优选为0.01～0.2质量％，进一步优选为0.01～0.15，更进一步优选为0.01～0.1％，再进一步优选为0.02～0.08％，更优选为0.02～0.06质量％。含量过低，则在一些情况下有导致协同效果不佳的担忧，含量过高有时也会存在人体安全性不佳的担忧。
[0078]
本发明进一步发现，在保证细胞活性的前提下，单独使用植物甾醇或者单独使用β-葡聚糖对于调控血糖的效果而言并不能说是明显的，有时甚至是相反的。通过上述含量的匹配，则可以在即使较低含量的植物甾醇的含量或较低含量的β-葡聚糖的配合下也能表现出协同控制血糖的效果。
[0079]
(组合物)
[0080]
本发明的功能性组合物至少包括了上文所描述的植物甾醇和β-葡聚糖。对于组合物的形成方式，没有特别的限定，可以由上文所述的包含这些成分的植物、真菌等物质混合而成，也可以是将高纯度的两种提取物进行混合。
[0081]
此外，对于本发明的组合物中还可以使用的其他组分，没有特别限定，在不损害本发明效果的前提下，可以使用本领域常用的其他可食用成分、食品添加剂或溶剂组分等。
[0082]
本发明的功能性组合物可以为液态方式存在，也可以为半固态或固态方式而存在。
[0083]
进一步，本发明的上述组合物通过实验验证，具有改善pa导致的葡萄糖摄入降低现象，表明组合物能够减轻pa诱导的胰岛素抵抗，因此可以具有较为明显的血糖调控的功效，同时也具有改善血脂提高人体免疫力的效用，因此，可以作为一种功能性保健品或功能性保健添加物而被使用。
[0084]
《第二方面》
[0085]
本发明的第二方面中，提供了一种功能性保健食品，尤其是适合于糖尿病患者的控血糖保健食品。其经由根据上述第一方面所描述的功能性组合物而加工得到。
[0086]
对于本发明的食品，没有特别限制，通常可以为面食、饮料、可冲调食品、烘焙糕点、酱料或功能性营养补充食品。
[0087]
对于面食，可以包括作为主食的面粉类原料加工或制作的主食、杂粮类主食等，具体的例如馒头类、饼类、面条类、馅类主食等。
[0088]
对于烘焙糕点，可以为主要基于奶油、鸡蛋和发酵粉类的烘焙蛋糕或饼干等。
[0089]
对于饮料，没有特别限制，可以为水果类饮品、蔬菜类饮品、奶茶类饮品、茶类饮品、牛奶、酸奶、维生素类饮料等。对于水果或蔬菜类饮品，除了可以包括本发明的两种功能性组分以外，还可以包括水果或蔬菜的汁液、或它们的固体成分等。对于维生素饮料，除了可以包括本发明的两种功能性组分以外，还主要的包含功能性的各种维生素以及其他功能性成分，具体可以例如包括白砂糖、甜蜜素、安赛蜜、牛磺酸、山梨酸钾、赖氨酸、肌醇、维生
素pp、维生素b6、维生素b12、柠檬酸等。
[0090]
对于可冲调食品，典型地可以为可冲调的奶粉制品，例如成人奶粉、中老年奶粉等。
[0091]
另外，对于功能性营养补充食品，没有特别限制，可以作为营养补充剂或替代餐而使用，这样的食品中，除了包括本发明的两种功能性组分以外还可以包括如下组分中的一种或多种：蛋白质、脂肪、必要的碳水化合物、膳食纤维、补充元素、维生素、植物或膳食成分等。
[0092]
其中，所述蛋白质选自乳清蛋白粉、大豆分离蛋白、全脂奶粉、全蛋粉、乳铁蛋白、牛初乳、氨基酸、蛋白肽中的至少一种；并且，所述氨基酸选自l-赖氨酸-l-谷氨酸、l一谷氨酸、l一精氨酸、l-色氨酸、l一谷氨酰胺、牛磺酸、l一缬氨酸、l-异亮氨酸、l一亮氨酸中的至少一种；所述蛋白肽选自大豆低聚肽、小麦蛋白肽、蚕蛹蛋白肽、海洋鱼低聚肽粉、可乐肽、氨基肽、卵白蛋白肽中的一种或多种。
[0093]
所述脂肪可以包括饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、opo结构脂、dha、epa、ara、磷脂中的至少一种，更具体地说所述脂肪包括红花籽油、核桃油，花生油，大豆油，阿甘油、橄榄油、茶油、美藤果油、橄榄油、椰子油、紫苏油、深海鱼油、可可油、棕榈油、牛油、奶油、猪油、中链甘油三酯、卵磷脂。
[0094]
所述碳水化合物包括淀粉或改性淀粉。所述膳食纤维包含菊粉、魔芋粉、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆多糖、环糊精、抗性糊精、大豆纤维中的一种或多种。
[0095]
所述补充元素选自柠有机酸类的金属离子盐，例如檬酸钙、l-乳酸钙、磷酸氢钙、葡萄糖酸钾、柠檬酸钠、葡萄糖酸亚铁、碘化钾、葡萄糖酸锌、亚硒酸钠、葡萄糖酸铜、硫酸铬、葡萄糖酸锰和葡萄糖酸镁中的一种或多种。
[0096]
所述维生素选自维生素a、β-胡萝卜素、维生素d3、维生素e、维生素k1、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12、维生素c、泛酸、叶酸、烟酸、胆碱、肌醇、生物素中的一种或多种。
[0097]
所述植物或膳食成分包括谷类、豆类、薯类、蔬菜类、菌藻类、坚果种子类、鱼虾类、禽畜肉类、水果类中的一种或多种。
[0098]
实施例
[0099]
以下，将通过具体的实施例对本发明进行进一步具体说明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。
[0100]
《原料》
[0101]
在以下实施例部分中，除非另有说明，否则所使用的原料如下。
[0102]
植物甾醇：上海源叶生物技术有限公司，s26734
[0103]
酵母β葡聚糖：上海统园食品技术有限公司，hh1006
[0104]
在以下部分中，除非另有说明，否则在提及营养组合物中的成分的质量份和比率时，该质量份指的是作为活性成分的植物甾醇、酵母β葡聚糖的质量份，该比率指的是作为活性成分的植物甾醇、酵母β葡聚糖的质量比。
[0105]
通过将植物甾醇、酵母β葡聚糖原料按照以下表1中所示的组分制备各个实验例。
[0106]
表1:
[0107][0108]
《细胞实验实施例》
[0109]
1.材料与方法
[0110]
1.1.实验试剂与耗材
[0111]
实验主要试剂以及来源参见如下表：
[0112]
表2-1:
[0113][0114]
1.2.实验设备
[0115]
本发明实验主要仪器设备参见下表：
[0116]
表2-2：
[0117]
编号仪器名称公司1二氧化碳培养箱美国thermo公司2生物安全柜美国thermo公司3酶标仪美国dynatech公司4手掌式离心机海门其林贝尔仪器公司5台式高速冷冻离心机德国beckman公司6倒置显微镜日本olmpus公司7磁力搅拌器杭州仪表有限公司8漩涡混合器海门其林贝尔仪器公司9恒温水浴槽上海森信实验仪器公司10实时荧光定量pcr美国bio-rad公司
[0118]
1.3.实验方法
[0119]
1.3.1细胞培养
[0120]
hepg2细胞置于含有10％fbs的dmem完全培养基中，37℃，5％co2饱和湿度细胞培养箱中培养，隔天换液。对数生长期汇合度大于80％可以传代，pbs清洗2次，0.25％胰蛋白酶消化细胞10～15min，至细胞脱离瓶壁，转移至离心管中，无菌针头吹至单细胞，以1:3的比例传代培养。取对数生长期细胞进行试验。
[0121]
1.3.2细胞活力检测
[0122]
制备hepg2肝细胞单细胞悬液，将约1
×
104个细胞接种于96孔板中，培养至细胞约占孔80％，进行药物干预。经药物干预24h后，使用移液器向板的每个孔中加入10μl cck8溶液。置于37℃恒温培养箱中孵育4h后，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
[0123]
1.3.3长链脂肪酸酯的制备
[0124]
将棕榈酸(palmitic acid,pa)溶于20ml的无水乙醇中，待脂肪酸完全溶解于无水乙醇后加入用1.6mol/l的氢氧化钠皂化，皂化后的半凝固溶液在通风橱中干燥48h，获得沉淀，待沉淀被完全干燥后，置于80℃水浴锅中加热至完全溶解，待溶液温度降低至50℃左右加入等体积20％(w/v)bsa进行共轭溶解，置于50℃磁力搅拌器中磁力搅拌4h，使得脂肪酸与bsa完全结合，形成脂肪酸-bsa(配制浓度为：3mmol/l)，使用0.22μm滤膜将脂肪酸酯进行过滤除菌备用。
[0125]
1.3.4细胞葡萄糖消耗量检测
[0126]
药物提前干预细胞2h，随后加入0.2mm棕榈酸酯(palmitate,pa)处理24h，吸取培养液上清，通过测定培养液上清葡萄糖含量(北京普利莱葡萄糖消耗测定试剂盒)反应葡萄糖消耗情况，根据试剂盒说明书进行测定，通过葡萄糖消耗量反馈细胞胰岛素抵抗程度，葡萄糖消耗越低表明胰岛素抵抗程度加重，葡萄糖消耗量越高表明胰岛素抵抗程度减弱。
[0127]
1.4.细胞实验分组和剂量
[0128]
具体实验剂量见下表2-3。
[0129]
表2-3:
[0130][0131]
1.5统计分析
[0132]
所有实验独立重复三次，采用spss 22.0统计软件对实验数据进行统计学分析，实验结果通过方差齐性检验，使用单因素方差分析各组间的统计学差异，用均数
±
标准差(x
±
sd)表示。p》0.05表示无统计学意义，p《0.05为差异有统计学意义。
[0133]
2.实验结果
[0134]
2.1.各样品对hepg2细胞安全剂量的筛选
[0135]
表2-4显示了酵母β葡聚糖对hepg2细胞活力的影响；表2-5显示了植物甾醇对hepg2细胞活力的影响。
[0136]
表2-4：
[0137][0138]
注：
**
表示与对照组比，p＜0.01；
***
表示与对照组比，p＜0.001；
[0139]
表2-5：
[0140][0141]
注：因植物甾醇水溶性不佳，为乙醇配制。
[0142]
cck-8细胞增殖检测试剂盒是一种基于wst-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速灵敏度试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下，wst-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，其颜色的深浅与存活细胞数目的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定od值，可以间接反映活细胞的数量，检测的od值越高，表明活细胞数目越多，od值越低，表明存活细胞数越少。
[0143]
2.2各样品对hepg2细胞胰岛素抵抗的影响
[0144]
为了衡量混合营养或单独营养处理对pa诱导的hepg2细胞胰岛素抵抗的影响，我们评估了细胞葡萄糖消耗的比例，以估计改善血糖的效果。表2-6表示了包含酵母β葡聚糖、植物甾醇的不同营养组合物样品对胰岛素抵抗的影响
[0145]
表2-6：
[0146][0147]
注：
*
与空白对照组比较p＜0.05，
**
与空白对照组比较p＜0.01；
∧
与阳性对照组比较p＜0.05，
∧∧
与阳性对照组比较p＜0.01，
∧∧∧
与阳性对照组比较p＜0.001
[0148]
胰岛素抵抗会导致细胞消耗葡萄糖的速率下降，通过检测细胞葡萄糖的消耗量反应细胞胰岛素抵抗的程度，葡萄糖消耗量低则细胞胰岛素抵抗程度高，葡萄糖消耗高则其胰岛素抵抗程度低。
[0149]
样品处理结果显示，与模型对照组相比，植物甾醇和酵母β葡聚糖单独使用时，在保证细胞活性的情况下，没有表现出减轻pa诱导的胰岛素抵抗的效果或者这样的效果有限。但是当二者复配使用时，尤其是将植物甾醇：酵母β葡聚糖的计量比控制在45:1以下时，能够获得明显的减轻pa诱导的胰岛素抵抗的效果。
[0150]
具体而言，以实验例1、实验例4和实验例7相比较而说明，相对于细胞实验对照组而言，细胞实验实验例1、4分别使得pa诱导胞内萄糖消耗比例增加了0.000和-0.005，而细胞实验实验例7使得胞内萄糖消耗比例增加了0.016，其大于前两者之和(0.000 -0.005)，表明两种组分之间存在协同效应，能够协同地增加萄糖消耗比例，辅助降血糖。同时，也惊讶的发现，上述数据也显示了低剂量的植物甾醇搭配低剂量的酵母β葡聚糖就也可以起到很好的改善胰岛素抵抗、辅助降血糖的效果。
[0151]
本发明的有益效果：本发明提供了植物甾醇、酵母β葡聚糖组合物对降血糖，尤其是对改善pa诱导的胰岛素抵抗的影响，为未来功能性食品的开发提供了新思路。植物甾醇、酵母β葡聚糖在机体改善血糖方面的前景广阔。我们的研究表明，在体外模型中，使用酵母β
葡聚糖、植物甾醇的组合处理的hepg2细胞，胰岛素抵抗得到了明显的改善，组分之间具有较好的协同效应。
[0152]
《应用例》
[0153]
以下应用例中的“份”均为重量份数，成分的％含量均为重量％含量。
[0154]
另外，在以下各应用例中，除非另有说明，否则所使用的以下原料来源如下。
[0155]
生牛乳：黑龙江飞鹤乳业有限公司
[0156]
全脂乳粉：黑龙江飞鹤乳业有限公司
[0157]
植物甾醇酯：秦皇岛金海特种食用油工业有限公司
[0158]
酵母β葡聚糖：上海统园食品技术有限公司，hh1006
[0159]
复配维生素：帝斯曼维生素(上海)有限公司
[0160]
复配矿物质：帝斯曼维生素(上海)有限公司
[0161]
固体玉米糖浆:保龄宝生物股份有限公司
[0162]
乳糖：美国hilmar
[0163]
脱脂乳粉：爱尔兰kerry
[0164]
低聚异麦芽糖：保龄宝生物股份有限公司
[0165]
单双甘油脂肪酸酯：丹尼斯克(中国)有限公司
[0166]
应用例1
[0167]
含有植物甾醇和酵母β葡聚糖的调制乳粉，适用于中老年食用，每1000份调制乳粉由如下重量份的组分制得：
[0168]
本发明的奶粉所用的原料有：全脂乳粉436份、植物甾醇酯8.08份(每份中植物甾醇99％)、酵母β葡聚糖0.51份(每份中酵母β葡聚糖98.0％)、脱脂乳粉250份、乳糖83.41份、固体玉米糖浆179份、低聚异麦芽糖40份、复配维生素2份、复配矿物质1份；将上述原料混合均匀后，经巴氏杀菌、均质、蒸发浓缩和喷雾干燥成粉状半成品，将混合均匀后的奶粉充氮包装即得终产品。产品中植物甾醇0.8％，酵母β葡聚糖含量0.05％，比例为16:1。
[0169]
应用例2
[0170]
含有植物甾醇和酵母β葡聚糖的调制乳粉，适用于中老年食用，每1000份调制乳粉由如下重量份的组分制得：
[0171]
本发明的奶粉所用的原料有：全脂乳粉436份、植物甾醇酯12.12份(每份中植物甾醇99％)、酵母β葡聚糖0.26份(每份中酵母β葡聚糖98.0％)、脱脂乳粉250份、乳糖79.62份、固体玉米糖浆179份、低聚异麦芽糖40份、复配维生素2份、复配矿物质1份；将上述原料混合均匀后，经巴氏杀菌、均质、蒸发浓缩和喷雾干燥成粉状半成品，将混合均匀后的奶粉充氮包装即得终产品。产品中植物甾醇1.2％，酵母β葡聚糖含量0.025％，比例为48:1。
[0172]
应用例3
[0173]
含有植物甾醇和酵母β葡聚糖的调制乳粉，适用于中老年食用，每1000份调制乳粉由如下重量份的组分制得：
[0174]
本发明的奶粉所用的原料有：全脂乳粉436份、植物甾醇粉2.42份(每份中植物甾醇99％)、酵母β葡聚糖0.61份(每份中酵母β葡聚糖98.0％)、脱脂乳粉250份、乳糖88.97份、固体玉米糖浆179份、低聚异麦芽糖40份、复配维生素2份、复配矿物质1份；将上述原料混合均匀后，经巴氏杀菌、均质、蒸发浓缩和喷雾干燥成粉状半成品，将混合均匀后的奶粉充氮
包装即得终产品。产品中植物甾醇0.24％，酵母β葡聚糖含量0.06％，比例为4:1。
[0175]
应用例4
[0176]
含有植物甾醇和酵母β葡聚糖的调制乳，每1000份调制乳由如下重量份的组分制得：
[0177]
本发明的调制乳，生牛乳990.29份、酵母β葡聚糖0.51份(每份中酵母β葡聚糖98.0％)、植物甾醇粉0.40份(每份中植物甾醇99％)、低聚果糖8.3份、单双甘油脂肪酸酯0.5份；将上述原料混合、均质、uht杀菌、均质，无菌灌装即得终产品。产品中植物甾醇0.04％，酵母β葡聚糖含量0.05％，比例为0.8:1。
[0178]
应用例5
[0179]
含有植物甾醇和酵母β葡聚糖的调制乳，每1000份调制乳由如下重量份的组分制得：
[0180]
本发明的调制乳，生牛乳983.04份、酵母β葡聚糖0.61份(每份中酵母β葡聚糖98.0％)、植物甾醇粉0.29份(每份中植物甾醇99％)、低聚果糖15.56份、单双甘油脂肪酸酯0.5份；将上述原料混合、均质、uht杀菌、均质，无菌灌装即得终产品。产品中植物甾醇0.029％，酵母β葡聚糖含量0.06％，比例为0.48:1。
[0181]
应用例6
[0182]
含有植物甾醇和酵母β葡聚糖的调制乳，适用于中老年食用，每1000份调制乳由如下重量份的组分制得：
[0183]
本发明的奶粉所用的原料有：全脂乳粉436份、植物甾醇粉12.12份(每份中植物甾醇99％)、酵母β葡聚糖0.51份(每份中酵母β葡聚糖98.0％)、脱脂乳粉250份、乳糖79.37份、固体玉米糖浆179份、低聚异麦芽糖40份、复配维生素2份、复配矿物质1份；将上述原料混合均匀后，经巴氏杀菌、均质、蒸发浓缩和喷雾干燥成粉状半成品，将混合均匀后的奶粉充氮包装即得终产品。产品中植物甾醇1.2％，酵母β葡聚糖含量0.05％，比例为24:1。
[0184]
产业上的可利用性
[0185]
本发明所提供的功能性组合物可以在工业上制备，并适用于血糖调控。