一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺的制作方法

1.本发明属于医药生物化工技术领域，具体地说，是关于一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺。


背景技术：

2.6-氟-色满-2-羧酸是重要医药中间体。化学名称是6-氟-3，4-二氢-2h-1-苯并吡喃-2-甲酸，化学分子式是c
10
h9o3f分子量是196.18，结构式为：
[0003][0004]
在许多具有生物活性的分子结构中，都能发现6-氟-色满的色满结构单元的存在。譬如，该结构广泛包含在维生素e及许多拮抗β受体的抗高血压药中。光学纯的6-氟-色满-2-羧酸用于新型降血压药物(s,r,r,r)-奈必洛尔的合成。(s,r,r,r)-奈必洛尔是第三代兼有血管扩张作用的心脏高度选择性β1受体阻滞剂，主要用于治疗原发性高血压，能有效地控制高血压和保持左心室功能，并且具有剂量低、副作用少，耐受性好等优点。
[0005]
杨森制药有限公司提供了一种以6-氟-色满-2-羧酸为起始原料来制备(s,r,r,r)-奈必洛尔的合成路线，合成路线如图1所示。
[0006]
从奈必洛尔的合成路线图中可知，6-氟-色满-2-羧酸的拆分是第一步也是关键的一步。6-氟-色满-2-羧酸的拆分效率是影响合成奈必洛尔的关键环节。因此提高其拆分效率也是值得研究的问题。
[0007]
6-氟-色满-2-羧酸是制备奈必洛尔的关键中间体，其拆分效率决定制备奈必洛尔合成方法的最终结果。但是关于6-氟-色满-2-羧酸(r)-，(s)-光学异构体拆分方法文献报道较少。迄今为止，化学方法、生物拆分法等是几种拆分有机酸常用的办法。化学拆分方法均以外消旋的6-氟色满-2-羧酸化合物为原料，通过与不同手性有机胺反应，形成非对映异构体的酰胺或铵盐，利用非对映异构体酰胺或铵盐在溶剂中的溶解度差异，经重结晶分离出r或s构型的6-氟色满-2-羧酸。但是此方法存在生产成本高，过程较冗长，拆分效率较低，环境污染严重等问题。
[0008]
为此，市面上有部分利用脂肪酶或酯酶选择性水解6-氟色满-2-羧酸甲酯或乙酯，得到光学纯的(r)-6-氟-色满-2-羧酸。此类方法具有操作简便，条件温和，立体选择性高等优点。ep2646426报道过利用来源于真菌ophiostoma novo-ulmi的酯酶拆分外消旋的6-氟-色满-2-羧酸乙酯，分离纯化得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸，ee值是90.72％，转化率是50.28％,其中立体选择性不高。但是目前没有文献关于利用脂肪酶或酯酶拆分制备(s)-6-氟-色满-2-羧酸的报道；因此急需找到其他的高活性和高立体选择性的脂肪酶/酯酶。


技术实现要素：

[0009]
本发明以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在两相反应中，利用高效表达酯酶ests的重组大肠杆菌的冻干菌体(lycests)作为催化剂，选择性催化(s)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解反应，反应结束后，将未反应完底物的有机相投入下一批次反应，投入高效表达酯酶estr的重组大肠杆菌的冻干菌体(lycestr)，选择性催化(r)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解。由此制备获得(s)-6-氟-色满-2-羧酸，其转化率》46％,ee值99％；(r)-6-氟-色满-2-羧酸，其转化率》47％,ee值99％。并依此，本发明继续研究，通过分批投入底物以及交替投入固定化表达酯酶ests的重组大肠杆菌细胞(imcests)和固定化表达酯酶estr的重组大肠杆菌细胞(imcestr)，实现底物最大的拆分效率，以及循环使用甲苯相。因此，本发明的目的是提供一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺。
[0010]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0011]
一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，进行两批次或多批次反应，相邻批次反应交替使用表达ests的重组大肠杆菌或表达estr的重组大肠杆菌作为催化剂，在有机相和水相的双相体系中反应；
[0012]
每批次反应完成后，分离有机相和水相，回收未反应完全底物的有机相用于下一批反应；纯化水相，去除溶剂，获得(s)-6-氟-色满-2-羧酸或(r)-6-氟-色满-2-羧酸；
[0013]
在每个批次后补充水相，用于下一批次反应；在每两个批次后补充底物6-氟-色满-2-羧酸甲酯，用于下一批次反应；如此循环，实现6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分。
[0014]
根据本发明，双水相体系的反应温度为30℃，反应时间为2～40小时。
[0015]
根据本发明，每批次反应完成后，采用过滤方法去除菌体或回收固定化细胞后，其中imcests或imcestr用生理盐水洗涤3遍作为下一批次的催化剂。
[0016]
根据本发明，每批次反应完成后，反应液中加入氢氧化钠溶液调节ph至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂，得到(s)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体或(r)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体，未反应完全底物的有机相用于下一批次反应。
[0017]
根据本发明，所述的双相体系，有机相与水相的体积比为1:3，其中，有机相为甲苯，水相为磷酸缓冲液。
[0018]
根据本发明，表达estr的重组大肠杆菌的催化剂为表达estr的重组大肠杆菌的冻干菌体或固定化表达estr的重组大肠杆菌细胞；表达ests的重组大肠杆菌的催化剂为表达ests的重组大肠杆菌的冻干菌体或固定化表达ests的重组大肠杆菌细胞。
[0019]
根据本发明，当使用表达ests的重组大肠杆菌进行拆分时，反应体系的ph控制在7.0-7.1；当使用表达estr的重组大肠杆菌进行拆分时，反应体系的ph控制在7.4-7.5。
[0020]
优选的，当使用表达ests的重组大肠杆菌进行拆分时，双水相体系中流加0.5-1m的naoh，控制ph恒定为7.1；当使用表达estr的重组大肠杆菌进行拆分时，双水相体系中流加0.5-1m的naoh，控制ph恒定为7.4。
[0021]
根据本发明，所述有机相的含量的体积百分比为20％-30％。
[0022]
进一步的，所述有机相为甲苯。
[0023]
根据本发明，所述表达ests的重组大肠杆菌或表达estr的重组大肠杆菌的浓度为10g/l。
[0024]
优选的，外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯的浓度是100-200mm。
[0025]
根据本发明，分批反应时，先投入表达ests的重组大肠杆菌进行拆分反应；下一批次反应，再投入表达estr的重组大肠杆菌进行拆分反应。
[0026]
根据本发明，表达ests的重组大肠杆菌是将具有序列如seq id no.3所示的ests基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中制备获得。
[0027]
进一步的，所述表达载体为pet-28a( )表达载体。
[0028]
根据本发明，表达estr的重组大肠杆菌将具有序列如seq id no.7所示的ests基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中制备获得。
[0029]
进一步的，所述表达载体为pet-28a( )表达载体。
[0030]
本发明的连续双相分批拆分工艺，其有益效果是：具有总拆分效率高、立体选择性强、工艺相对简单等特点，具体如下：
[0031]
1、通过交替投入表达酯酶ests的重组大肠杆菌和表达酯酶estr的重组大肠杆菌，实现底物最大的拆分效率。
[0032]
2、有机相可以循环使用，同时可以回收各批次的表达酯酶ests的重组大肠杆菌和表达酯酶estr的重组大肠杆菌，催化剂利用率高。
[0033]
3、底物转化率高，当交替投入催化剂(即交替投入表达酯酶ests的重组大肠杆菌和表达酯酶estr的重组大肠杆菌)的次数为6次时，底物转化率高达99.1％。
附图说明
[0034]
图1为奈必洛尔的合成路线图。
[0035]
图2为实施例3的有机溶剂比例对反应的影响。
[0036]
图3为实施例3的温度对反应的影响。
[0037]
图4为实施例3的ph对反应的影响。
[0038]
图5为实施例4的(s)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图。
[0039]
图6为实施例7的有机溶剂比例对反应的影响。
[0040]
图7为实施例7的温度对反应的影响。
[0041]
图8为实施例7的ph对反应的影响。
[0042]
图9为实施例8的(s)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图。
[0043]
图10为实施例9的6-氟色满-2-羧酸甲酯的两步拆分结果图。
[0044]
图11为实施例10的6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分结果图。
具体实施方式
[0045]
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
[0046]
实施例1表达酯酶ests的大肠杆菌基因工程菌的构建及酯酶ests的高效表达
[0047]
1.将热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1使用培养基(peptone 5g,meat extract 3g,蒸馏水1l)复苏，在60℃恒温摇床中需氧培养12小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。
[0048]
2.细菌dna提取，使用细菌基因组dna快速提取试剂盒(generay biotech,shanghai,china)进行提取，获得geobacillus thermocatenulatus基因组dna。
[0049]
3.根据geobacillus thermocatenulatus菌株的酯酶ests基因序列设计引物，所设计上游引物和下游引物如下：
[0050]
上游引物：5’cgcggatccatggtcattgttgaaacaga 3’，seq id no.1，其中，下划线部分为bamh i识别位点；
[0051]
下游引物：5’cgcaagcttttacacatgctcgcgaaacc 3’，seq id no.2，其中，下划线部分为hind iii识别位点；
[0052]
4.然后以热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus的基因组dna为模板，利用聚合酶链式反应(pcr)进行基因扩增，获得包含酯酶ests全长基因的pcr产物，核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。其中，pcr扩增体系为primer star max 25μl；正向引物和反向引物各1.5μl；水22μl；模板0.5μl。
[0053]
核苷酸序列：
[0054]
atggtcattgttgaaacagaacggctggctgatgtgccggtgcttcatgttgtcaagccggaaaagcgggacgcacggctgccgctcattttctttattcacggctttacaagcgcgaaagagcataatttgcatttcggctacttgcttgccgaggcaggctatcgcgttgtgcttcccgacgcgctgtttcacggcgagcgggacgaaggtttgagcgagcggaaattgcagctgtcgttttgggacattgtcgtgcgcacgatcaccgaaatcgaggagatgaaaaacgaccttgtcagccgcgggctggctgaccaagaacggattgggctcgctgggacatcgatgggcggcatcgtcacattcggcgcgctcgccgtctatccgtgggtgaaggcggcggtggcgcttatgggctgcccgaactacagcgccttttttgacgcgatgatggaagaagcgaagcggcgtcagatcgacatcccgatgccgccgacgctgttggcgcttgaaagagaaaagctcgctcgctacgatttatccaagcagccggaaacactcgccgggcggccgttgttcatctggcacgggaaagccgaccaagtcgtcccgtatagttatacatatgaattttaccagcaaattaagccgctttatgaaggaaacgaagaccggctgcaattcatcgccgacccgcacgccggccataaagtgacgcgcgaggcgtttttggaaacggtgcgctggtttcgcgagcatgtgtaa，seq id no.3。
[0055]
氨基酸序列：
[0056]
mviveterladvpvlhvvkpekrdarlpliffihgftsakehnlhfgyllaeagyrvvlpdalfhgerdeglserklqlsfwdivvrtiteieemkndlvsrgladqeriglagtsmggivtfgalavypwvkaavalmgcpnysaffdammeeakrrqidipmpptllalereklarydlskqpetlagrplfiwhgkadqvvpysytyefyqqikplyegnedrlqfiadphaghkvtreafletvrwfrehv，seq id no.4。
[0057]
5.将pet-28a( )空载质粒，以及步骤4得到的带有bamh i和hind iii酶切位点的基因(序列如seq id no.3所示)，分别用bamh i和hind iii进行双酶切。回收大片段，用t4dna连接酶连接，热激法转化大肠杆菌bl21，用含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行筛选，pcr法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，从而构建得到酯酶ests基因工程菌株lycests。
[0058]
6.将阳性重组菌株(步骤5的酯酶ests基因工程菌株lycests)接种于含有50μg/ml
卡那霉素的5ml lb培养基中37℃过夜培养，随后以1％转接量接入50ml含有50μg/ml卡那霉素的新鲜lb培养基中继续繁殖，当od600达到0.6～0.8时，加入iptg至终浓度0.1mm。在20℃下诱导16～18小时后，离心收集菌体，然后放在冷冻干燥机冷冻12小时，制备冻干菌粉储存冰箱，备用。
[0059]
实施例2(s)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法
[0060]
在0.1m磷酸盐缓冲液中，用实施例1制备的冻干菌粉(lycests)进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解动力学拆分，但是没有观察到良好的活性和选择性。因此，反应在包含不同有机溶剂的双相体系(有机溶剂与磷酸盐缓冲液)中进行。
[0061]
反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5m氢氧化钠溶液调节ph至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(s)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱chirasil-ad-h)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0ml/ml，检测波长254nm。
[0062]
实施例3以冻干大肠杆菌菌体(lycests)为催化剂，考察(s)-6-氟-色满-2-羧酸制备的条件
[0063]
反应体系包括：菌体，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯，有机溶剂，反应温度，反应时间，反应ph，底物浓度，buffer，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯即底物。
[0064]
以上述实例1中的重组大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶ests基因工程菌株)为酶源，考察有机溶剂的选择、有机溶剂添加的比例、反应温度、反应ph、底物浓度等因素，以提高目标产物(s)-6-氟-色满-2-羧酸的时空产率。
[0065]
1、考察所选有机溶剂对反应的影响
[0066]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；有机溶剂与pb buffer(ph7.4)的比例是1:4；反应温度为30℃；反应时间为6h。所选的有机溶剂包括异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷、异辛烷。结果见表1。
[0067]
表1有机溶剂对反应的影响
[0068]
有机溶剂log p转化率(％)ee(％)异丙醇0.3865.321.3丁醇0.8810.22.7甲苯2.546.699.0正己烷3.538.481.4正庚烷4.071.727.5异辛烷4.587.824.6
[0069]
结果显示：所选的有机溶剂中，甲苯的转化率和ee值均良好。
[0070]
2、考察甲苯与pb buffer(ph7.4)对反应的影响。
[0071]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；反应温度为30℃；反应ph是7.4；反应时间为6h。所选甲苯占总体积的比例是10％、20％、30％、40％，50％(v/v)。结果如图2所示。
[0072]
图2结果显示，甲苯占总体积的比例为20％和30％时的ee值良好。
[0073]
3、考察温度对反应的影响。
[0074]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；甲苯与pb buffer(ph7.4)的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应温度是20～60℃。结果如图3所示。
[0075]
图3结果显示，当反应温度为30℃和40℃时，ee值和转化率均良好。
[0076]
4、考察ph对反应的影响。
[0077]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；甲苯与buffer的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应ph是6、6.5、7、7.5、8、8.5。结果如图4所示。
[0078]
图4结果显示，当反应ph是7.0时，ee值和转化率均良好。
[0079]
5、考察底物浓度对反应的影响。在10ml的反应体系中，甲苯与buffer的比例是1:3；反应温度为30℃；反应ph是7.0。所选底物浓度是100、200、300、400mm。结果见表2。
[0080]
表2底物浓度对反应的影响
[0081]
底物浓度反应时间转化率(％)ee(％)100mm1.5h48.999.2200mm4h49.199.1300mm6h45.798.8400mm8h38.098.5
[0082]
表2结果显示，当底物浓度为100mm、200mm和300mm时，转化率和ee值均良好。
[0083]
实施例4
[0084]
以大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶ests基因工程菌株)为酶源，酶法拆分(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯生产(s)-6-氟-色满-2-羧酸
[0085]
根据实施例3确定的最佳拆分条件，以上述实例1中冻干大肠杆菌菌体为催化剂，在0.2升反应液中加入菌体2g，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯200mm，甲苯与pb buffer(ph7.0)的比例是1:3；反应温度30℃，转化时间6h，进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解拆分。采用实施例2的(s)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法，(s)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图如图5所示。
[0086]
结果，测定(s)-6-氟-色满-2-羧酸含量为89.3mm；转化率为46.9％；ee值是99.07％。
[0087]
实施例5表达酯酶estr的大肠杆菌基因工程菌的构建及酯酶estr的高效表达
[0088]
1.将热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus strain bgsc 93a1使用培养基(peptone 5g,meat extract 3g,蒸馏水1l)复苏，在60℃恒温摇床中需氧培养12小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。
[0089]
2.细菌dna提取，使用细菌基因组dna快速提取试剂盒(generay biotech,shanghai,china)进行提取，获得geobacillus thermocatenulatus基因组dna。
[0090]
3.根据geobacillus thermocatenulatus菌株的酯酶estr基因序列设计引物，所设计上游引物和下游引物如下：
[0091]
上游引物：5’cgcggatccgtgcaagaccagtttttttc 3’，seq id no.5，其中，下划线部分为bamh i识别位点；
[0092]
下游引物：5’cgcaagctttcattgttcaccctcctccg 3’，seq id no.6，其中，下划线部
分为hind iii识别位点；
[0093]
4.然后以热链状地芽孢杆菌geobacillus thermocatenulatus的基因组dna为模板，利用聚合酶链式反应(pcr)进行基因扩增，获得包含酯酶estr全长基因的pcr产物，核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。其中，其中，pcr扩增体系为primer star max 25μl；正向引物和反向引物各1.5μl；水22μl；模板0.5μl。
[0094]
核苷酸序列：
[0095]
gtgcaagaccagtttttttcggtcgccaagccgccgacaaaagaacaacggccgccgacggctgaaacaaggcaacatgacgagaaaatggatattgttgctcttggcgattcgttgacgagaggaacgggcgatgaaagcggcaaagggtatgttggctatatggtcgatgcgcttcgccggcaaacggatcggccgatccgtgtgacgaatttggccatccgcggccttcgctccgacgggctgcttcgccagcttggccagcctgagattcaacggcaagtcgccatggcggatttgatcgtgatgacgatcggcggcaacgacttgtttcaagggggggaagcgcttcggttgaacgccaagcagctggatgaagcgaagcgccggtatgcagccaacctagaccacattttcgccgcgctgcgccgcttcaacagcgaagcggtcatttttgcaatcggtttgtacaacccgtttggcgatttaaacgatgccaaacggacgtcggccgttgtgcgcgattggaattttgcatcagcggaagtggcggcccgctatccgaacatcgtcgcggtgccgacgtttgatttgtttgccctccatgtcaatgactatttgtacagcgaccattttcatccaaacgcggcaggctacaagcggattggagagcgcgtcgcctcgctcatcacgttgacggaggagggtgaacaatga，seq id no.7。
[0096]
氨基酸序列：
[0097]
vqdqffsvakpptkeqrpptaetrqhdekmdivalgdsltrgtgdesgkgyvgymvdalrrqtdrpirvtnlairglrsdgllrqlgqpeiqrqvamadlivmtiggndlfqggealrlnakqldeakrryaanldhifaalrrfnseavifaiglynpfgdlndakrtsavvrdwnfasaevaarypnivavptfdlfalhvndylysdhfhpnaagykrigervaslitlteegeq，seq id no.8。
[0098]
5.将pet-28a( )空载质粒，以及步骤4得到的带有bamh i和hind iii酶切位点的基因(序列如seq id no.3所示)，分别用bamh i和hind iii进行双酶切。回收大片段，用t4dna连接酶连接，热激法转化大肠杆菌bl21，用含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行筛选，pcr法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，从而构建得到酯酶estr基因工程菌株lycestr。
[0099]
6.将阳性重组菌株(步骤5的酯酶estr基因工程菌株lycestr)接种于含有50μg/ml卡那霉素的5ml lb培养基中37℃过夜培养，随后以1％转接量接入50ml含有50μg/ml卡那霉素的新鲜lb培养基中继续繁殖，当od600达到0.6～0.8时，加入iptg至终浓度0.1mm。在20℃下诱导16～18小时后，离心收集菌体，然后放在冷冻干燥机冷冻12小时，制备冻干菌粉储存冰箱，备用。
[0100]
实施例6(r)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法
[0101]
在0.1m磷酸盐缓冲液中，用实施例1制备的冻干菌粉(lycestr)进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解动力学拆分，但是没有观察到良好的活性和选择性。因此，反应在包含不同有机溶剂的双相体系(有机溶剂与磷酸盐缓冲液)中进行。
[0102]
反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5m氢氧化钠溶液调节ph11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱chirasil-ad-h)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙
醇(90:10)，流速1.0ml/ml，检测波长254nm。
[0103]
实施例7以冻干大肠杆菌菌体(lycestr)为催化剂，考察(r)-6-氟-色满-2-羧酸制备的条件
[0104]
反应体系包括：菌体，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯，有机溶剂，反应温度，反应时间，反应ph，底物浓度，buffer，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯即底物。
[0105]
以上述实施例5中的重组大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶estr基因工程菌株)为酶源，考察有机溶剂的选择、有机溶剂添加的比例、反应温度、反应ph、底物浓度等因素，以提高目标产物(r)-6-氟-色满-2-羧酸的时空产率。
[0106]
1、考察所选有机溶剂对反应的影响
[0107]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；有机溶剂与pb buffer(ph7.4)的比例是1:4；反应温度为30℃；反应时间为12h。所选的有机溶剂包括异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷、异辛烷。结果见表3。
[0108]
表3有机溶剂对反应的影响
[0109]
有机溶剂log p转化率(％)ee(％)异丙醇0.3852.345.3丁醇0.887.81.6甲苯2.548.695.6正己烷3.542.589.7正庚烷4.026.611.6异辛烷4.55.42.1
[0110]
结果显示：所选的有机溶剂中，甲苯的转化率和ee值均良好。
[0111]
2、考察甲苯与pb buffer(ph7.4)对反应的影响。
[0112]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；反应温度为30℃；反应ph是7.4；反应时间为12h。所选甲苯占总体积的比例是10％、20％、30％、40％，50％(v/v)。结果如图6所示。
[0113]
图6结果显示，甲苯占总体积为20-30％时，转化率和ee值均良好。
[0114]
3、考察温度对反应的影响。
[0115]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；甲苯与pb buffer(ph7.4)的比例是1:3；反应时间为6h。所选反应温度是10～50℃。结果如图7所示。
[0116]
图7结果显示，反应温度为30℃时，转化率和ee值均良好。
[0117]
4、考察ph对反应的影响。
[0118]
在10ml的反应体系中，菌体浓度10g/l；(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯用量为100mm；甲苯与buffer的比例是1:3；反应时间为6h。结果如图8所示。
[0119]
图8结果显示，所选反应ph是6、6.5、7、7.5、8、8.5，优选为7.5。
[0120]
5、考察底物浓度对反应的影响。在10ml的反应体系中，甲苯与buffer的比例是1:3；反应温度为30℃；反应ph是7.5。所选底物浓度是100、200、300、400mm，结果见表4。
[0121]
表4底物浓度对反应的影响
[0122]
底物浓度反应时间转化率(％)ee(％)
100mm2.5h50.295.6200mm4h50.995.4300mm7h49.294.7400mm12h36.693.5
[0123]
表4结果显示，所选底物浓度为100mm、200mm和300mm时，转化率和ee值均良好。
[0124]
实施例8
[0125]
以大肠杆菌菌体(步骤5的酯酶estr基因工程菌株)为酶源，酶法拆分(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯生产(r)-6-氟-色满-2-羧酸
[0126]
根据实施例6确定的最佳拆分条件，以上述实施例5中冻干大肠杆菌菌体为催化剂，在0.2升反应液中加入菌体2g，(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯300mm，甲苯与pb buffer(ph7.5)的比例是1:3；反应温度30℃，转化时间12h，进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的水解拆分。采用与实施例2的(r)-6-氟-色满-2-羧酸的分离纯化以及液相检测方法，(r)-6-氟-色满-2-羧酸的液相图如图9所示。
[0127]
结果，测定(r)-6-氟-色满-2-羧酸含量为138.8mm；转化率为48.7％；ee值是95.47％。
[0128]
实施例9 6-氟色满-2-羧酸甲酯的两步拆分
[0129]
在200ml的反应体系中，称取实施例1制备的冻干菌粉lycests 2g，投入底物6-氟色满-2-羧酸甲酯0.04mol(相当于200mm)，甲苯与pb buffer(磷酸盐缓冲液，0.2m，ph7.1)的比例是1:3，反应温度30℃，并且控制ph7.1恒定，磁力搅拌反应3h，进行(
±
)-6-氟-色满-2-羧酸甲酯的选择性水解拆分。反应完成后，采用过滤方法去除菌体后，加入5m氢氧化钠溶液调节ph至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节ph至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(s)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。高效液相色谱(手性柱chirasil-ad-h)分析，测定底物转化率和产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷:异丙醇(90:10)，流速1.0ml/ml，检测波长254nm。测定(s)-6-氟-色满-2-羧酸含量为0.01786mol；转化率为46.9％；ee值是97.47％(见图10)。
[0130]
2.将未反应完全底物的甲苯相转移到下一次反应体系，投入实施例5制备的冻干菌粉lycestr 2g，加入pb buffer(0.2m ph7.5)150ml,反应温度30℃，并且控制ph7.5恒定，磁力搅拌反应5h。反应完成后，采用上述的分离纯化以及液相检测方法，测定(r)-6-氟-色满-2-羧酸含量为0.01872mol；转化率为49.3％；ee值是99.07％(见图10)。
[0131]
实施例10 6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分
[0132]
本实施例采用固定化细胞进行试验。固定化细胞流程如下:
[0133]
在实施例1的步骤6获得表达酯酶ests的基因工程菌和实施例5的步骤6获得表达酯酶ests的基因工程菌后，即分别离心收菌，将4g聚乙烯醇和1g海藻酸钠添加到50ml盐溶液中，在80℃恒温水浴中搅拌溶解。待溶液完全溶解并冷却至20℃后，将溶液与质量浓度为20％的相同体积的细菌液体均匀混合，获得混合物。然后通过注射器将混合物滴入含质量浓度为2％氯化钙的饱和硼酸溶液中，并储存4h以形成凝胶微球。形成的凝胶微球用生理盐水冲洗三次，分别获得表达酯酶ests的基因工程菌细胞imcests和表达酯酶estr的基因工程菌细胞imcestr，然后在4℃的磷酸盐缓冲液中储存，备用。
[0134]
第一批次反应：在100ml的反应体系中，包含75ml磷酸盐缓冲液(0.2m，ph7.0)，
25ml甲苯，100mm底物6-氟色满-2-羧酸甲酯，表达酯酶ests的基因工程菌细胞imcests 10g,反应温度30℃，并且控制ph7.1恒定，磁力搅拌反应3h，在反应结束后，imcests通过过滤收集并用生理盐水洗涤3遍作为第三批次的催化剂。反应液是加氢氧化钠溶液调节ph至10-11，分离水相和有机相，水相是通过加盐酸调节ph至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍获得(s)-6-氟-色满-2-羧酸，未反应完全底物的甲苯相用于下一批次反应。
[0135]
第二批次反应：包含上批次未反应完全底物的甲苯相，75ml磷酸盐缓冲液(0.2mph7.4)，表达酯酶estr的基因工程菌细胞imcestr 10g，反应温度30℃，并且控制ph7.5恒定，磁力搅拌反应5h。反应完成后，imcestr通过过滤收集并用生理盐水洗涤3遍作为第四批次的催化剂。采用实施例9中的分离纯化方法从水相中得到(r)-6-氟-色满-2-羧酸。包含少量底物的有机相重新加入100mm底物(6-氟色满-2-羧酸甲酯)用于下批次反应,第三和第四批次反应分别是通过imcests(第一批次回收)和imcestr(第二批次回收)催化的。反应过程和产物分离过程与前面反应一致。如此循环，实现6-氟色满-2-羧酸甲酯的连续分批拆分。
[0136]
如图11所示，重复利用5批次后，imcests剩余最初活力的65％，imcestr由于在双相反应中细胞裂解而显著失去活性。在经过总的10批次反应，获得了229.3mm(s)-6-氟-色满-2-羧酸(96.9％ee)和224.1mm(r)-6-氟-色满-2-羧酸(99.1％ee)，总的转化率达到93.5％。其中，在前6批次反应，转化率高达99.1％。
[0137]
综上所述，本发明提供了一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺，其通过交替投入表达酯酶ests的重组大肠杆菌和表达酯酶estr的重组大肠杆菌，实现了底物最大的拆分效率。且其有机相可以循环使用，同时可以回收各批次的表达酯酶ests的重组大肠杆菌和表达酯酶estr的重组大肠杆菌，催化剂利用率高。
[0138]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。