1.本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种矫正肿瘤突变负荷的方法及系统。
背景技术：
：：2.pd-l1抑制剂和/或pd-1抑制剂的有效率在未经生物标记物(biomarkers)选择的患者中只有约20％。因此，目前该类抑制剂的疗效预测指标是研究热点。3.在一线非小细胞肺癌的免疫检查点抑制剂单药治疗中，pd-l1表达检测是必要的。然而，pd-l1指标亦存在其局限性。首先，pd-l1表达使用的癌症类型和药物有限。其次，pd-l1表达在肿瘤组织中分布不均，容易造成假阴性结果。另外，不同检测抗体和平台的结果存在不一致。还有，临床场景下获取足够的肿瘤组织来进行分子检测通常面临一定困难，尤其是对于疾病晚期患者来说。4.肿瘤突变负荷是目前研究较多的潜在疗效预测指标。其定义为编码区的体细胞突变的数目，具体地，是指每百万碱基(mb)基因组范围上检测出的编码区的体细胞突变——包括碱基替换(snv)、插入或缺失变异(indel)——的数目的总和。研究表明肿瘤突变负荷，可以用来估计患者整体的新抗原负荷(rizvi,n.a.etal.cancerimmunology.mutationallandscapedeterminessensitivitytopd-1blockadeinnon-smallcelllungcancer.science348,124-128,2015)。研究亦表明，高肿瘤突变负荷患者的客观有效率(orr)、持续临床获益率(dcb％)均优于低肿瘤突变负荷患者。肿瘤突变负荷的检测可以基于肿瘤组织，亦可基于血浆ctdna。相比组织切片而言，血检结果更稳定，不受样本采集时的偏差影响。因此，基于血浆的dna检测技术也越来越多(wan,j.c.etal.liquidbiopsiescomeofage:towardsimplementationofcirculatingtumordna.nat.rev.cancer17,223-238,2017)。5.然而，目前肿瘤突变负荷的评价方法和阈值仍在探索中。技术实现要素：6.根据第一方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的方法，包括：根据取自受试者的待测样本测序数据获得的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正，得到矫正后的肿瘤突变负荷：[0007][0008]式(1)中，α为正数。[0009]根据第二方面，在一实施例中，提供一种预测方法，包括：根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据的矫正后的肿瘤突变负荷，根据肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0010]根据第三方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的系统，包括：突变负荷矫正设备，用于根据待测样本的测序数据的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正：[0011][0012]式(1)中，α为正数。[0013]根据第四方面，在一实施例中，提供一种预测系统，包括：预测设备，用于根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据中矫正后的肿瘤突变负荷，根据肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0014]根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：[0015]存储器，用于存储程序；[0016]处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0017]根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0018]依据上述实施例的一种矫正肿瘤突变负荷的方法及系统，通过对肿瘤突变负荷进行矫正，实现对药物治疗疗效更加准确的区分。附图说明[0019]图1为一种实施例的样本检测流程图。具体实施方式[0020]下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。[0021]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。[0022]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本技术所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。[0023]定义[0024]本文中，除非另有说明，cfdna(circulatingfreedna或cellfreedna)又称循环游离dna或细胞游离dna，是指循环血或其他体液中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性dna。[0025]本文中，除非另有说明，ctdna(circulatingtumordna)是指来自于肿瘤的cfdna，通常是原发肿瘤或者是转移形成的新肿瘤上的细胞破裂后脱落下来，进入外周血循环系统或其他体液的dna片段。[0026]本文中，pr是指部分缓解(partialresponse)，以基线靶病灶半径总和为参考，靶病灶半径总和减少≥30％，至少维持4周。[0027]本文中，pd表示疾病进展(progressivedisease)，以靶病灶半径总和最小值为参照(包括基线靶病灶半径总和)，所有靶病灶半径总和至少增加≥20％；另外，靶病灶半径总和的绝对值至少增加5mm；或出现新病灶。[0028]本文中，sd是指疾病稳定(stabledisease)，以靶病灶半径总和最小值为参照，靶病灶半径综合缩小未达pr标准，且增大未达pd标准。本文中，使用ricist1.1评价疗效，dcb(durableclinicalbenefit，持续临床获益)的定义为pr或sd持续超过6个月。[0029]如本文所用，“最高体细胞突变频率”亦称“最高体细胞突变丰度，”是指检测到的体细胞突变的突变频率的最大值。例如，样本a共检出三个体细胞突变，其突变频率分别为5％、10％和20％，则样本a的最高体细胞突变频率为20％。[0030]如本文所用，“肿瘤突变负荷”是指每百万碱基中被检测出的，体细胞snv和indel变异的总数。[0031]如本文所用，“驱动突变”是指驱动癌症进展的突变。[0032]如本文所用，“indel”亦称indel或indel，是指涉及受试者基因组中核苷酸插入或缺失的突变。[0033]如本文所用，“突变”是指从已知参考序列的变异，并且包括突变，诸如单核苷酸变体(snv)、拷贝数变体或变异(cnv)/畸变、插入或缺失(indel)、基因融合、颠换、易位、移码、复制、重复扩增和表观遗传变体。突变可以是种系突变或体细胞突变。在一些实施方案中，用于比较目的的参考序列是提供测试样品的受试者的物种的野生型基因组序列，通常是人类基因组。[0034]如本文所用，“单核苷酸变体”或“snv”是指发生在基因组中特定位置的单核苷酸的突变或变异。[0035]如本文所用，“第二代测序”又称“二代测序”、“下一代测序”、ngs，相比于传统的基于桑格尔(sanger)和毛细电泳法的方法具有增加的通量，例如能够一次产生数十万相对较小序列读段。二代测序技术的一些实例包括但不限于合成测序、连接测序以及杂交测序。在一实施例中，二代测序的基本原理如下：将dntp的3'-oh以叠氮基团rtg(reversibleterminatinggroup,可逆末端基团)进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；dna合成时，rtg能起到类似于ddntp的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱rtg和荧光分子，进行下一轮循环(参见网址：https://www.jianshu.com/p/c9ade91acced)。在一实施例中，二代测序包括但不限于illumina循环sbs法、华大dna纳米球扩增技术等等，二代测序平台包括但不限于geneseq2000测序平台、mgiseq-t7测序平台、illumina测序平台等等。[0036]程序性死亡受体1(programmeddeathreceptor1，pd－1)和程序性死亡配体1(programmeddeathligand1，pd－l1)的抗体阻止肿瘤细胞免疫抑制途径的活化，pd-1/pd-l1免疫疗法是当前热门的免疫新疗法，旨在利用人体自身免疫系统抵御肿瘤，通过阻断pd-1/pd-l1信号通路，使肿瘤细胞失去自我保护能力，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，有望实质性改善肿瘤患者的总生存期。[0037]pd－1是b7－cd28受体家族的成员，被命名为参与经典程序性细胞死亡受体1，作为免疫检查点，表达于活化的cd4 和cd8 t细胞、天然杀伤(nk)t细胞、b细胞、活化的单核细胞及树突状细胞。pd－1具有两个配体pd－l1和pd－l2(b7－dc)。pd－l1为其同源配体，也被称为白细胞分化抗原274(cd274)或b7同源物(b7－h1)，是一种在人类由cd274基因编码的蛋白质。它在抗原呈递细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞以及免疫特权位点(胎盘、睾丸、眼睛)上以低水平组成型表达，它也在多种恶性肿瘤中表达。pd－l2是pd－1的另一配体，可在激活的树突细胞和巨噬细胞上发现。[0038]pd－1的生理作用是通过限制t细胞的活化和增殖来保证t细胞的体内平衡。因此，在活化的t细胞表面上表达的配体pd－l1与pd－1结合产生抑制信号，减少t细胞的细胞因子产生和增殖。pd－1参与维持自身反应性t细胞的外周自身耐受，抑制活化和/或增殖。即当pd－1与其同源配体pd－l1结合时，发生免疫应答的抑制，导致免疫耐受和预防正常的组织损伤。pd－1/pd－l1信号传导的损伤可能导致自身免疫性疾病的发生。现已将免疫检查点受体pd－1/pd－l1信号传导定义为调节免疫激活和耐受之间平衡的关键途径。在肿瘤细胞中，表达在肿瘤细胞上的pd－l1与表达在t淋巴细胞上pd－1结合导致t细胞增殖，细胞因子分泌的抑制及调节性t细胞(treg)增加，共同导致免疫耐受。实体瘤中的研究已经证明，pd－1/pd－l1信号传导允许逃避免疫监视，将肿瘤微环境转化为肿瘤保护性免疫抑制环境。具体来说，pd－l1在肿瘤细胞上的表达抑制t细胞活化和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)介导的肿瘤裂解。pd－1/pd－l1信号传导促进了肿瘤生长，同时也抑制效应细胞介导的抗肿瘤免疫应答。这些效应细胞能保持功能，并且可能通过阻断pd－1/pd－l1轴而重新活化。pd－l1和pd－1的结合还在肿瘤细胞中产生反向信号，促进肿瘤细胞存活并诱导其对化疗的抗性。使用临床相关的抗pd－1和/或pd－l1单克隆抗体阻断pd－1/pd－l1信号传导可以恢复免疫应答，并在实体瘤(包括黑素瘤和肺癌)中已获得显著的临床效应，为恶性肿瘤的治疗提供了非常有希望的新型免疫治疗策略。[0039]鉴于现有技术存在的缺陷，本领域需要一种有效评估检测到的肿瘤突变负荷的方法，以实现更好的疗效预测效果。[0040]根据第一方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的方法，包括：根据取自受试者的待测样本测序数据获得的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正，得到矫正后的肿瘤突变负荷：[0041][0042]式(1)中，α为正数。由于最大体细胞突变频率的数值可能会比较小，直接用肿瘤突变负荷除以最大体细胞突变频率后的数值会变大，因此，通过乘以常数α，将肿瘤突变负荷调整到一个便于阅读和理解的数量级上，常数α的具体取值可以根据肿瘤突变负荷与最大体细胞突变频率的比值的大小进行确定。常数α的具体取值一经确定后不应更改。[0043]在一实施例中，α为正数。[0044]在一实施例中，0＜α＜1。[0045]在一实施例中，α包括但不限于0.1。[0046]在一实施例中，所述待测样本的测序数据的最大体细胞突变频率≥阈值，换言之，只对最大体细胞突变频率≥阈值(例如，可以为2％)的样本进行矫正。[0047]在一实施例中，所述阈值可以为2％。换言之，最大体细胞突变频率《2％的待测样本不进行肿瘤突变负荷的矫正。我们对最大体细胞突变频率《2％的待测样本不进行肿瘤突变负荷矫正，一方面由于最大体细胞突变频率低的样本的疗效大多会比较好，不需要另外的指标来预测；另一方面，最大体细胞突变频率《2％的样本按此方法矫正后，数值会偏高，容易造成假阳性。[0048]具体的阈值可以根据需要进行确定，还可以是1％等等其他阈值。[0049]在一实施例中，所述体细胞突变的频率≥1‰。[0050]在一实施例中，所述体细胞突变的频率≥5‰。[0051]在一实施例中，所述体细胞突变为snv(单核苷酸变异)和indel(插入\缺失)。[0052]在一实施例中，所述体细胞突变包含同义突变。[0053]同义突变是dna片段中有时某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸。其原因在于该位置的密码子突变前后为简并密码子。如：cta与ctg均编码亮氨酸，若a突变为g，则该变异为同义突变。[0054]在一实施例中，所述体细胞突变不包含驱动突变。[0055]在一实施例中，所述测序数据为cfdna测序数据。[0056]在一实施例中，所述测序数据为第二代测序数据。[0057]在一实施例中，所述肿瘤突变负荷的的检测方法包括：根据待测样本的测序数据，提取编码区的体细胞突变，确定体细胞突变数(即体细胞突变数目)，按如下公式计算肿瘤突变负荷：[0058][0059]在一实施例中，所述突变个数是指体细胞突变个数。[0060]在一实施例中，所述体细胞突变个数是指编码区的体细胞突变个数。[0061]在一实施例中，所述测序长度为测序针对的测定区域的大小，其计算为将各个被设计用来捕获相关基因的探针之间去除重叠部分后累计得到；[0062]在一实施例中，捕获目标区域的相关基因的探针为样本探针，捕获全基因组的相关基因的探针为全基因组探针；[0063]在一实施例中，测定区域为检测目标肿瘤突变负荷时被样本探针捕获测定的上述目标区域，或者检测全基因组肿瘤负荷时被全基因组探针捕获的相应区域。[0064]在一实施例中，所述测序长度为编码区的测序长度，单位为mb，即百万碱基。[0065]在一实施例中，所述测序长度为测序所用的探针靶向捕获的编码区的大小。[0066]在一些实施例中，肿瘤突变负荷包括肿瘤基因组区域内的许多体细胞突变。在一些实施例中，体细胞突变包括非胚系细胞中的dna改变并且通常出现在癌细胞中。在一些实施例中，体细胞突变可以在肿瘤组织样本和/或体液样本中被检测到。[0067]在一些实施例中，体细胞突变是指除性细胞外的体细胞发生的突变，即不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。[0068]在一实施例中，所述测序数据为区域捕获的第二代测序数据，即通过探针捕获、第二代测序得到的数据。[0069]在一实施例中，所述待测样本包括但不限于体液样本。[0070]在一实施例中，所述体液样本包括但不限于血液、血浆中的至少一种。[0071]根据第二方面，在一实施例中，提供一种预测方法，包括：根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据的矫正后的肿瘤突变负荷，根据矫正后的肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0072]需要说明的是，上述判断结果仅仅是中间参考结果，并不能作为最终的诊断结果，实际诊断过程中，通常还需要医生根据受试者的临床症状表现、患病史、家族病史及其他检测结果进行综合判断，例如，对于非小细胞肺癌患者，通常还需要结合x线检查结果、支气管镜检查、细胞学检查、剖胸探查术、ect检查、纵隔镜检查等等，才能得出最终的诊断结果。因此，本发明提供的预测治疗疗效的方法不属于疾病的诊断方法，更不属于疾病的治疗方法。[0073]在一实施例中，如果矫正后的肿瘤突变负荷≥阈值，则预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者，否则，预测受试者为低肿瘤突变负荷受试者。[0074]对于高肿瘤突变负荷患者，可以预测其对免疫治疗类药物会有较好的响应，即治疗疗效好；一个主要的应用场景是在免疫治疗前，对患者进行检测，如果是高肿瘤突变负荷患者，则可以在其治疗方案中考虑特定免疫治疗药物。[0075]在一实施例中，还包括根据矫正后的肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测药物对疾病的治疗疗效。[0076]在一实施例中，通常在没有足够的疗效信息时，采用上四分位数(或其它分位数)；在一些实施例中，如果有完善的疗效结果，可通过本发明的方法进行疗效分析，选择使hr(hazardratio，风险比)最低的数值作为阈值。[0077]在一实施例中，所述疾病包括但不限于癌症。癌症通常是指恶性肿瘤。[0078]在一实施例中，所述癌症包括但不限于非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌等等中的至少一种。此处仅仅是示例性列举，本发明适用于各种癌症。[0079]在一实施例中，所述药物包括但不限于pd-1、pd-l1抑制剂等等中的至少一种，具体可以包括但不限于帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)等等中的至少一种。此处仅仅是示例性列举可使用肿瘤突变负荷预测疗效的药物。[0080]根据第三方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的系统，包括：突变负荷矫正设备，用于根据待测样本的测序数据的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正：[0081][0082]式(1)中，α为正数。[0083]根据第四方面，在一实施例中，提供一种预测系统，包括：预测设备，用于根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据中矫正后的肿瘤突变负荷，根据肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0084]根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：[0085]存储器，用于存储程序；[0086]处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0087]根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0088]根据第七方面，在一实施例中，本发明提供了一种基于二代测序的计算血浆样本肿瘤突变负荷的方法，所述方法包括：[0089]1)获得受试者的dna样本库；[0090]2)使所述dna样本库与靶向捕获探针杂交，对探针捕获序列测序，并确定编码区的体细胞突变，进而确定所述体细胞突变的数目，所述体细胞突变为snv和indel，所述体细胞突变包括同义突变，所述体细胞突变不包括驱动突变；[0091]其中，对于血浆样本，检出的突变丰度(或频率)≥1‰，优选地≥5‰；[0092]3)[0093]其中，编码区的突变是指步骤2)中所述体细胞突变；[0094]编码区的大小是指步骤2)中所述靶向捕获探针编码区的大小(单位：mb，即百万碱基)。[0095]根据第八方面，在一实施例中，本发明提供了一种基于二代测序的矫正血浆样本肿瘤突变负荷的方法，所述方法包括：[0096]1)获取第七方面所述肿瘤突变负荷；[0097]2)其中，α为正数。[0098]在一实施例中，还包括对血浆样本进行质控的步骤：最大体细胞突变丰度(或频率)小于2％的样本，不进行肿瘤突变负荷的矫正。[0099]实施例1[0100]非小细胞肺癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正以及阈值的确定[0101]本实施例中，外周血样本取自非小细胞肺癌患者(癌症类型是医生通过临床诊断确定，临床诊断是由有经验的医生完成，在送样进行本实施例的检测之前就已经确定)。取96例初诊非小细胞肺癌血浆样本，检测、计算和矫正肿瘤突变负荷，并依据总样本的上四分位确定区分肿瘤突变负荷高低的阈值。[0102]1.dna提取[0103]对于全血，首先进行血浆/血细胞分离，具体是采集10ml外周血，及时进行血浆/血细胞分离(edta抗凝管，4h内；streck管，72h内)，分离步骤如下：[0104]首先，在4℃条件下以1600×g离心10min，离心后将上层血浆分装到多个1.5ml或者2.0ml的离心管中。分离血浆后，中间层 底层血细胞留取备用，作为正常对照。然后，在4℃条件下以16000×g离心10min去除残余细胞，将上清转入新的1.5ml或者2.0ml离心管中，即得到所需的血浆。[0105]本实施例采用血细胞的gdna测序结果作为对照，用于排除胚系突变。血浆按照qiaampcirculatingnucleicacidkit(qiagen)提取试剂说明书提取cfdna。血细胞按照qiaampdnaminikit提取试剂说明书提取gdna，然后采用qubit定量，要求血细胞gdna大于100ng，血浆cfdna大于25ng。[0106]2.文库构建[0107]对于血细胞的gdna，先打断到200～250bp，然后按照ultratmiidna文库构建试剂盒的说明书构建样本文库。血浆分离的cfdna按照ultratmiidna文库构建试剂盒说明书构建样本文库。[0108]2.1末端修复及加“a”[0109]按照下表配置末端修复及加“a”反应[0110]表1[0111]组分单反应体积(μl)endprepreactionbuffer7endprepenzymemix3cfdna或片段化dna50总体积60[0112]表1中，endprepreactionbuffer、endprepenzymemix均为ultratmiidna文库构建试剂盒中的试剂。[0113]将表1中的混合物充分振荡混匀并离心，然后按照以下步骤在恒温混匀仪上孵育：首先20℃，孵育30min，然后65℃，孵育30min。孵育完成后，降至室温，高速离心机短暂离心，将管壁上的液体离心至管底。[0114]2.2接头连接[0115]按照下表配置接头连接反应预混物(premix)。[0116]表2[0117][0118]接头加入量随dna起始量变化而变化，对应关系见下表。[0119]表3[0120]样本类型建库起始量15μm接头体积(μl)血细胞800ng4cfdna》25ng4[0121]依次向反应管中加入31μl接头连接反应premix及对应体积的接头，并用ddh2o补充体积至95μl，充分振荡混匀后离心。恒温混匀仪20℃，孵育15min。孵育完成后，微量高速离心机短暂离心，将管壁上的液体离心至管底。[0122]连接反应结束后，使用磁珠纯化接头连接产物，最后回溶至25μlte缓冲液(ph8.0)中。[0123]2.3捕获前pcr(non-c-pcr)引入index[0124]按照下表顺序在pcr管中加入反应组分，并设置阴/阳性对照。[0125]表4[0126]组分单反应体积(μl)pipeline)，具体方法如下：[0143]4.1基于插入片段两端的序列碱基作为标签，所述插入片段是文库中与接头引物相连接的dna片段，经双末端测序，每个片段形成一对成对测序序列；将成对测序序列的测序序列1的前12bp碱基和测序序列2的前12bp碱基作为标签，字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列的索引，测序序列1的标签在前就标记成正链，测序序列2的标签在前就标记成反链；[0144]4.2对索引进行外部排序，以达到将同一个dna模板的所有测序重复测序序列聚集到一起的目的；[0145]4.3对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过10，以达到区分开拥有相同索引却来自不同dna模板的测序序列的目的；[0146]4.4对步骤4.3中获得的同一个dna模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序列数都达到2对以上，则进行后续分析；[0147]4.5对满足步骤4.4中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列。对于dna模板的每一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80％，且在反链测序序列中的一致率也达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为n，这样便得到了代表原始dna模板序列的新测序序列；[0148]4.6采用bwamem算法将序列比对到参考基因组grch37(hg19)上，筛除比对质量小于30的测序序列；[0149]4.7根据步骤4.6中得到的测序序列标记duplicates，采用picard的markduplicates处理；[0150]4.8参考gatk的最佳实践(bestpractice)，使用gatk的indelrealigner纠正序列末端的indel，采用gatk的baserecalibrator修正序列碱基质量值；[0151]4.9根据步骤4.8中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计目标区域覆盖大小、平均测序深度、正反链互配率和低频突变率；[0152]4.10callsnv/indel：根据受试样本与对照样本信息比对，采用mutect2和realdcaller流程进行体细胞snv/indelcalling(不涉及sv和cnv信息分析)；所使用的筛选参数为：对照位点变异率≤2％，纠错后变异测序序列条数≥2，突变预测p值≤0.05；[0153]4.11变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异记忆有变异数据库中的该变异的情况。[0154]5.计算肿瘤突变负荷[0155]5.1根据血浆样本测序数据的有效深度要求，确定纳入计算的snv和indel的频率≥5‰；[0156]5.2本实施例中计算tmb的编码区大小为1mb。[0157]本实施例中，肿瘤突变负荷的矫正公式如下：[0158][0159]6.检测结果[0160]本实施例的检测结果如下：[0161]表7[0162][0163][0164][0165]表7中的样本是没有疗效信息的样本，即没有使用抑制剂治疗样本所属受试者，该表的数据用于评估总体tmb-h比例。[0166]非小细胞肺癌血浆样本的矫正前肿瘤突变负荷的上四分位为9.36，矫正后肿瘤突变负荷的上四分位为12.15，因此，本实施例选择9和12分别作为矫正前后区分肿瘤突变负荷高低的阈值，具体是将矫正前肿瘤突变负荷≥9或矫正后肿瘤突变负荷≥12的受试者，判断为高肿瘤突变负荷的受试者。[0167]实施例2[0168]非小细胞肺癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正以及疗效预测分析[0169]本实施例中，非小细胞肺癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正参照实施例1进行。[0170]本实施例的检测结果如下：[0171]表8[0172][0173][0174]上表中各样本所属受试者在接受药物治疗时，使用的药物包括atezolizumab、durvalumab、nivolumab、bgb-a317、ibi308、ipilimumab、君实a、君实b、百济。[0175]从上表可以看出，当选择矫正前肿瘤突变负荷9作为阈值时，本实施例50例非小细胞肺癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变负荷患者的风险比为0.78(95％ci0.42-1.45，log-rankp＝0.3966)；而当选择矫正后肿瘤突变负荷12作为阈值时，本实施例50例非小细胞肺癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变患者的风险比为0.48(95％ci0.27-0.85，log-rankp＝0.0060)。矫正前，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为38％(12/32)和17％(3/18)，fisher’sexacttestp＝0.1990；矫正后，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为45％(10/22)和18％(5/28)，fisher’sexacttestp＝0.0608。上述结果表明，矫正后肿瘤突变负荷比矫正前具有更好的疗效预测性能。[0176]本实施例的样本所述患者使用的抑制剂，以往的研究以及本身的临床试验数据显示，对高肿瘤突变负荷的患者更有效，因此，我们的数据结果中，如果高突变负荷组与低突变负荷组的风险比越小、高突变负荷组的dcb越高、低突变负荷组的dcb越低，表明本实施例的预测方法更准确。[0177]在生存分析中，风险比是指一个解释变量的两个水平所描述的风险率的比值。例如，在药物试验中，治疗组患者单位时间内死亡比率是对照组患者的2倍，则风险比为2。风险比是通过prismgraphpad8软件或r包survminer和survival、采用log-rank法计算的。计算过程是行业内通用的。[0178]本实施例采用btmb除以msaf的方法矫正，而现有技术仅采用计算低频突变(4.5％或5％以下的)的方法矫正。本实施例的优势在于：在风险比相当的水平下，筛选出的阳性人群是互补的，即本实施例可以筛选出现有技术未筛选出的潜在获益患者。[0179]实施例3[0180]食管癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正[0181]本实施例中，食管癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正参照实施例1进行。[0182]本实施例中，食管癌矫正前后肿瘤突变负荷阈值采用实施例1设定。[0183]本实施例的检测结果如下：[0184]表9[0185][0186][0187][0188]上表中各样本所属受试者接受药物治疗时，所使用的药物为信达ibi308，是一种pd-1抗体。[0189]从上表可以看出，当选择矫正前肿瘤突变负荷9作为阈值时，本实施例54例食管癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变负荷患者的风险比为0.82(95％ci0.46-1.47，log-rankp＝0.4523)；而当选择矫正后肿瘤突变负荷12作为阈值时，本实施例54例食管癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变患者的风险比为0.52(95％ci0.27-1.00，log-rankp＝0.0777)。矫正前，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为24％(8/33)和10％(2/21)，fisher’sexacttestp＝0.2838；矫正后，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为33％(3/9)和16％(7/45)，fisher’sexacttestp＝0.3425。上述结果表明，矫正后肿瘤突变负荷比矫正前有更好的疗效预测性能。[0190]本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。[0191]以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
技术领域：
：的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。当前第1页12当前第1页12
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：：2.pd-l1抑制剂和/或pd-1抑制剂的有效率在未经生物标记物(biomarkers)选择的患者中只有约20％。因此，目前该类抑制剂的疗效预测指标是研究热点。3.在一线非小细胞肺癌的免疫检查点抑制剂单药治疗中，pd-l1表达检测是必要的。然而，pd-l1指标亦存在其局限性。首先，pd-l1表达使用的癌症类型和药物有限。其次，pd-l1表达在肿瘤组织中分布不均，容易造成假阴性结果。另外，不同检测抗体和平台的结果存在不一致。还有，临床场景下获取足够的肿瘤组织来进行分子检测通常面临一定困难，尤其是对于疾病晚期患者来说。4.肿瘤突变负荷是目前研究较多的潜在疗效预测指标。其定义为编码区的体细胞突变的数目，具体地，是指每百万碱基(mb)基因组范围上检测出的编码区的体细胞突变——包括碱基替换(snv)、插入或缺失变异(indel)——的数目的总和。研究表明肿瘤突变负荷，可以用来估计患者整体的新抗原负荷(rizvi,n.a.etal.cancerimmunology.mutationallandscapedeterminessensitivitytopd-1blockadeinnon-smallcelllungcancer.science348,124-128,2015)。研究亦表明，高肿瘤突变负荷患者的客观有效率(orr)、持续临床获益率(dcb％)均优于低肿瘤突变负荷患者。肿瘤突变负荷的检测可以基于肿瘤组织，亦可基于血浆ctdna。相比组织切片而言，血检结果更稳定，不受样本采集时的偏差影响。因此，基于血浆的dna检测技术也越来越多(wan,j.c.etal.liquidbiopsiescomeofage:towardsimplementationofcirculatingtumordna.nat.rev.cancer17,223-238,2017)。5.然而，目前肿瘤突变负荷的评价方法和阈值仍在探索中。技术实现要素：6.根据第一方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的方法，包括：根据取自受试者的待测样本测序数据获得的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正，得到矫正后的肿瘤突变负荷：[0007][0008]式(1)中，α为正数。[0009]根据第二方面，在一实施例中，提供一种预测方法，包括：根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据的矫正后的肿瘤突变负荷，根据肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0010]根据第三方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的系统，包括：突变负荷矫正设备，用于根据待测样本的测序数据的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正：[0011][0012]式(1)中，α为正数。[0013]根据第四方面，在一实施例中，提供一种预测系统，包括：预测设备，用于根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据中矫正后的肿瘤突变负荷，根据肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0014]根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：[0015]存储器，用于存储程序；[0016]处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0017]根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0018]依据上述实施例的一种矫正肿瘤突变负荷的方法及系统，通过对肿瘤突变负荷进行矫正，实现对药物治疗疗效更加准确的区分。附图说明[0019]图1为一种实施例的样本检测流程图。具体实施方式[0020]下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。[0021]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。[0022]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本技术所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。[0023]定义[0024]本文中，除非另有说明，cfdna(circulatingfreedna或cellfreedna)又称循环游离dna或细胞游离dna，是指循环血或其他体液中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性dna。[0025]本文中，除非另有说明，ctdna(circulatingtumordna)是指来自于肿瘤的cfdna，通常是原发肿瘤或者是转移形成的新肿瘤上的细胞破裂后脱落下来，进入外周血循环系统或其他体液的dna片段。[0026]本文中，pr是指部分缓解(partialresponse)，以基线靶病灶半径总和为参考，靶病灶半径总和减少≥30％，至少维持4周。[0027]本文中，pd表示疾病进展(progressivedisease)，以靶病灶半径总和最小值为参照(包括基线靶病灶半径总和)，所有靶病灶半径总和至少增加≥20％；另外，靶病灶半径总和的绝对值至少增加5mm；或出现新病灶。[0028]本文中，sd是指疾病稳定(stabledisease)，以靶病灶半径总和最小值为参照，靶病灶半径综合缩小未达pr标准，且增大未达pd标准。本文中，使用ricist1.1评价疗效，dcb(durableclinicalbenefit，持续临床获益)的定义为pr或sd持续超过6个月。[0029]如本文所用，“最高体细胞突变频率”亦称“最高体细胞突变丰度，”是指检测到的体细胞突变的突变频率的最大值。例如，样本a共检出三个体细胞突变，其突变频率分别为5％、10％和20％，则样本a的最高体细胞突变频率为20％。[0030]如本文所用，“肿瘤突变负荷”是指每百万碱基中被检测出的，体细胞snv和indel变异的总数。[0031]如本文所用，“驱动突变”是指驱动癌症进展的突变。[0032]如本文所用，“indel”亦称indel或indel，是指涉及受试者基因组中核苷酸插入或缺失的突变。[0033]如本文所用，“突变”是指从已知参考序列的变异，并且包括突变，诸如单核苷酸变体(snv)、拷贝数变体或变异(cnv)/畸变、插入或缺失(indel)、基因融合、颠换、易位、移码、复制、重复扩增和表观遗传变体。突变可以是种系突变或体细胞突变。在一些实施方案中，用于比较目的的参考序列是提供测试样品的受试者的物种的野生型基因组序列，通常是人类基因组。[0034]如本文所用，“单核苷酸变体”或“snv”是指发生在基因组中特定位置的单核苷酸的突变或变异。[0035]如本文所用，“第二代测序”又称“二代测序”、“下一代测序”、ngs，相比于传统的基于桑格尔(sanger)和毛细电泳法的方法具有增加的通量，例如能够一次产生数十万相对较小序列读段。二代测序技术的一些实例包括但不限于合成测序、连接测序以及杂交测序。在一实施例中，二代测序的基本原理如下：将dntp的3'-oh以叠氮基团rtg(reversibleterminatinggroup,可逆末端基团)进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；dna合成时，rtg能起到类似于ddntp的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱rtg和荧光分子，进行下一轮循环(参见网址：https://www.jianshu.com/p/c9ade91acced)。在一实施例中，二代测序包括但不限于illumina循环sbs法、华大dna纳米球扩增技术等等，二代测序平台包括但不限于geneseq2000测序平台、mgiseq-t7测序平台、illumina测序平台等等。[0036]程序性死亡受体1(programmeddeathreceptor1，pd－1)和程序性死亡配体1(programmeddeathligand1，pd－l1)的抗体阻止肿瘤细胞免疫抑制途径的活化，pd-1/pd-l1免疫疗法是当前热门的免疫新疗法，旨在利用人体自身免疫系统抵御肿瘤，通过阻断pd-1/pd-l1信号通路，使肿瘤细胞失去自我保护能力，具有治疗多种类型肿瘤的潜力，有望实质性改善肿瘤患者的总生存期。[0037]pd－1是b7－cd28受体家族的成员，被命名为参与经典程序性细胞死亡受体1，作为免疫检查点，表达于活化的cd4 和cd8 t细胞、天然杀伤(nk)t细胞、b细胞、活化的单核细胞及树突状细胞。pd－1具有两个配体pd－l1和pd－l2(b7－dc)。pd－l1为其同源配体，也被称为白细胞分化抗原274(cd274)或b7同源物(b7－h1)，是一种在人类由cd274基因编码的蛋白质。它在抗原呈递细胞、血管内皮细胞、胰岛细胞以及免疫特权位点(胎盘、睾丸、眼睛)上以低水平组成型表达，它也在多种恶性肿瘤中表达。pd－l2是pd－1的另一配体，可在激活的树突细胞和巨噬细胞上发现。[0038]pd－1的生理作用是通过限制t细胞的活化和增殖来保证t细胞的体内平衡。因此，在活化的t细胞表面上表达的配体pd－l1与pd－1结合产生抑制信号，减少t细胞的细胞因子产生和增殖。pd－1参与维持自身反应性t细胞的外周自身耐受，抑制活化和/或增殖。即当pd－1与其同源配体pd－l1结合时，发生免疫应答的抑制，导致免疫耐受和预防正常的组织损伤。pd－1/pd－l1信号传导的损伤可能导致自身免疫性疾病的发生。现已将免疫检查点受体pd－1/pd－l1信号传导定义为调节免疫激活和耐受之间平衡的关键途径。在肿瘤细胞中，表达在肿瘤细胞上的pd－l1与表达在t淋巴细胞上pd－1结合导致t细胞增殖，细胞因子分泌的抑制及调节性t细胞(treg)增加，共同导致免疫耐受。实体瘤中的研究已经证明，pd－1/pd－l1信号传导允许逃避免疫监视，将肿瘤微环境转化为肿瘤保护性免疫抑制环境。具体来说，pd－l1在肿瘤细胞上的表达抑制t细胞活化和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)介导的肿瘤裂解。pd－1/pd－l1信号传导促进了肿瘤生长，同时也抑制效应细胞介导的抗肿瘤免疫应答。这些效应细胞能保持功能，并且可能通过阻断pd－1/pd－l1轴而重新活化。pd－l1和pd－1的结合还在肿瘤细胞中产生反向信号，促进肿瘤细胞存活并诱导其对化疗的抗性。使用临床相关的抗pd－1和/或pd－l1单克隆抗体阻断pd－1/pd－l1信号传导可以恢复免疫应答，并在实体瘤(包括黑素瘤和肺癌)中已获得显著的临床效应，为恶性肿瘤的治疗提供了非常有希望的新型免疫治疗策略。[0039]鉴于现有技术存在的缺陷，本领域需要一种有效评估检测到的肿瘤突变负荷的方法，以实现更好的疗效预测效果。[0040]根据第一方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的方法，包括：根据取自受试者的待测样本测序数据获得的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正，得到矫正后的肿瘤突变负荷：[0041][0042]式(1)中，α为正数。由于最大体细胞突变频率的数值可能会比较小，直接用肿瘤突变负荷除以最大体细胞突变频率后的数值会变大，因此，通过乘以常数α，将肿瘤突变负荷调整到一个便于阅读和理解的数量级上，常数α的具体取值可以根据肿瘤突变负荷与最大体细胞突变频率的比值的大小进行确定。常数α的具体取值一经确定后不应更改。[0043]在一实施例中，α为正数。[0044]在一实施例中，0＜α＜1。[0045]在一实施例中，α包括但不限于0.1。[0046]在一实施例中，所述待测样本的测序数据的最大体细胞突变频率≥阈值，换言之，只对最大体细胞突变频率≥阈值(例如，可以为2％)的样本进行矫正。[0047]在一实施例中，所述阈值可以为2％。换言之，最大体细胞突变频率《2％的待测样本不进行肿瘤突变负荷的矫正。我们对最大体细胞突变频率《2％的待测样本不进行肿瘤突变负荷矫正，一方面由于最大体细胞突变频率低的样本的疗效大多会比较好，不需要另外的指标来预测；另一方面，最大体细胞突变频率《2％的样本按此方法矫正后，数值会偏高，容易造成假阳性。[0048]具体的阈值可以根据需要进行确定，还可以是1％等等其他阈值。[0049]在一实施例中，所述体细胞突变的频率≥1‰。[0050]在一实施例中，所述体细胞突变的频率≥5‰。[0051]在一实施例中，所述体细胞突变为snv(单核苷酸变异)和indel(插入\缺失)。[0052]在一实施例中，所述体细胞突变包含同义突变。[0053]同义突变是dna片段中有时某个碱基对的突变并不改变所编码的氨基酸。其原因在于该位置的密码子突变前后为简并密码子。如：cta与ctg均编码亮氨酸，若a突变为g，则该变异为同义突变。[0054]在一实施例中，所述体细胞突变不包含驱动突变。[0055]在一实施例中，所述测序数据为cfdna测序数据。[0056]在一实施例中，所述测序数据为第二代测序数据。[0057]在一实施例中，所述肿瘤突变负荷的的检测方法包括：根据待测样本的测序数据，提取编码区的体细胞突变，确定体细胞突变数(即体细胞突变数目)，按如下公式计算肿瘤突变负荷：[0058][0059]在一实施例中，所述突变个数是指体细胞突变个数。[0060]在一实施例中，所述体细胞突变个数是指编码区的体细胞突变个数。[0061]在一实施例中，所述测序长度为测序针对的测定区域的大小，其计算为将各个被设计用来捕获相关基因的探针之间去除重叠部分后累计得到；[0062]在一实施例中，捕获目标区域的相关基因的探针为样本探针，捕获全基因组的相关基因的探针为全基因组探针；[0063]在一实施例中，测定区域为检测目标肿瘤突变负荷时被样本探针捕获测定的上述目标区域，或者检测全基因组肿瘤负荷时被全基因组探针捕获的相应区域。[0064]在一实施例中，所述测序长度为编码区的测序长度，单位为mb，即百万碱基。[0065]在一实施例中，所述测序长度为测序所用的探针靶向捕获的编码区的大小。[0066]在一些实施例中，肿瘤突变负荷包括肿瘤基因组区域内的许多体细胞突变。在一些实施例中，体细胞突变包括非胚系细胞中的dna改变并且通常出现在癌细胞中。在一些实施例中，体细胞突变可以在肿瘤组织样本和/或体液样本中被检测到。[0067]在一些实施例中，体细胞突变是指除性细胞外的体细胞发生的突变，即不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变。[0068]在一实施例中，所述测序数据为区域捕获的第二代测序数据，即通过探针捕获、第二代测序得到的数据。[0069]在一实施例中，所述待测样本包括但不限于体液样本。[0070]在一实施例中，所述体液样本包括但不限于血液、血浆中的至少一种。[0071]根据第二方面，在一实施例中，提供一种预测方法，包括：根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据的矫正后的肿瘤突变负荷，根据矫正后的肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0072]需要说明的是，上述判断结果仅仅是中间参考结果，并不能作为最终的诊断结果，实际诊断过程中，通常还需要医生根据受试者的临床症状表现、患病史、家族病史及其他检测结果进行综合判断，例如，对于非小细胞肺癌患者，通常还需要结合x线检查结果、支气管镜检查、细胞学检查、剖胸探查术、ect检查、纵隔镜检查等等，才能得出最终的诊断结果。因此，本发明提供的预测治疗疗效的方法不属于疾病的诊断方法，更不属于疾病的治疗方法。[0073]在一实施例中，如果矫正后的肿瘤突变负荷≥阈值，则预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者，否则，预测受试者为低肿瘤突变负荷受试者。[0074]对于高肿瘤突变负荷患者，可以预测其对免疫治疗类药物会有较好的响应，即治疗疗效好；一个主要的应用场景是在免疫治疗前，对患者进行检测，如果是高肿瘤突变负荷患者，则可以在其治疗方案中考虑特定免疫治疗药物。[0075]在一实施例中，还包括根据矫正后的肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测药物对疾病的治疗疗效。[0076]在一实施例中，通常在没有足够的疗效信息时，采用上四分位数(或其它分位数)；在一些实施例中，如果有完善的疗效结果，可通过本发明的方法进行疗效分析，选择使hr(hazardratio，风险比)最低的数值作为阈值。[0077]在一实施例中，所述疾病包括但不限于癌症。癌症通常是指恶性肿瘤。[0078]在一实施例中，所述癌症包括但不限于非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌等等中的至少一种。此处仅仅是示例性列举，本发明适用于各种癌症。[0079]在一实施例中，所述药物包括但不限于pd-1、pd-l1抑制剂等等中的至少一种，具体可以包括但不限于帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)等等中的至少一种。此处仅仅是示例性列举可使用肿瘤突变负荷预测疗效的药物。[0080]根据第三方面，在一实施例中，提供一种矫正肿瘤突变负荷的系统，包括：突变负荷矫正设备，用于根据待测样本的测序数据的肿瘤突变负荷，使用如下公式进行矫正：[0081][0082]式(1)中，α为正数。[0083]根据第四方面，在一实施例中，提供一种预测系统，包括：预测设备，用于根据第一方面所述的方法获得受试者的待测样本测序数据中矫正后的肿瘤突变负荷，根据肿瘤突变负荷与阈值的大小关系，预测受试者为高肿瘤突变负荷受试者或低肿瘤突变负荷受试者。[0084]根据第五方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：[0085]存储器，用于存储程序；[0086]处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0087]根据第六方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面和/或第二方面所述的方法。[0088]根据第七方面，在一实施例中，本发明提供了一种基于二代测序的计算血浆样本肿瘤突变负荷的方法，所述方法包括：[0089]1)获得受试者的dna样本库；[0090]2)使所述dna样本库与靶向捕获探针杂交，对探针捕获序列测序，并确定编码区的体细胞突变，进而确定所述体细胞突变的数目，所述体细胞突变为snv和indel，所述体细胞突变包括同义突变，所述体细胞突变不包括驱动突变；[0091]其中，对于血浆样本，检出的突变丰度(或频率)≥1‰，优选地≥5‰；[0092]3)[0093]其中，编码区的突变是指步骤2)中所述体细胞突变；[0094]编码区的大小是指步骤2)中所述靶向捕获探针编码区的大小(单位：mb，即百万碱基)。[0095]根据第八方面，在一实施例中，本发明提供了一种基于二代测序的矫正血浆样本肿瘤突变负荷的方法，所述方法包括：[0096]1)获取第七方面所述肿瘤突变负荷；[0097]2)其中，α为正数。[0098]在一实施例中，还包括对血浆样本进行质控的步骤：最大体细胞突变丰度(或频率)小于2％的样本，不进行肿瘤突变负荷的矫正。[0099]实施例1[0100]非小细胞肺癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正以及阈值的确定[0101]本实施例中，外周血样本取自非小细胞肺癌患者(癌症类型是医生通过临床诊断确定，临床诊断是由有经验的医生完成，在送样进行本实施例的检测之前就已经确定)。取96例初诊非小细胞肺癌血浆样本，检测、计算和矫正肿瘤突变负荷，并依据总样本的上四分位确定区分肿瘤突变负荷高低的阈值。[0102]1.dna提取[0103]对于全血，首先进行血浆/血细胞分离，具体是采集10ml外周血，及时进行血浆/血细胞分离(edta抗凝管，4h内；streck管，72h内)，分离步骤如下：[0104]首先，在4℃条件下以1600×g离心10min，离心后将上层血浆分装到多个1.5ml或者2.0ml的离心管中。分离血浆后，中间层 底层血细胞留取备用，作为正常对照。然后，在4℃条件下以16000×g离心10min去除残余细胞，将上清转入新的1.5ml或者2.0ml离心管中，即得到所需的血浆。[0105]本实施例采用血细胞的gdna测序结果作为对照，用于排除胚系突变。血浆按照qiaampcirculatingnucleicacidkit(qiagen)提取试剂说明书提取cfdna。血细胞按照qiaampdnaminikit提取试剂说明书提取gdna，然后采用qubit定量，要求血细胞gdna大于100ng，血浆cfdna大于25ng。[0106]2.文库构建[0107]对于血细胞的gdna，先打断到200～250bp，然后按照ultratmiidna文库构建试剂盒的说明书构建样本文库。血浆分离的cfdna按照ultratmiidna文库构建试剂盒说明书构建样本文库。[0108]2.1末端修复及加“a”[0109]按照下表配置末端修复及加“a”反应[0110]表1[0111]组分单反应体积(μl)endprepreactionbuffer7endprepenzymemix3cfdna或片段化dna50总体积60[0112]表1中，endprepreactionbuffer、endprepenzymemix均为ultratmiidna文库构建试剂盒中的试剂。[0113]将表1中的混合物充分振荡混匀并离心，然后按照以下步骤在恒温混匀仪上孵育：首先20℃，孵育30min，然后65℃，孵育30min。孵育完成后，降至室温，高速离心机短暂离心，将管壁上的液体离心至管底。[0114]2.2接头连接[0115]按照下表配置接头连接反应预混物(premix)。[0116]表2[0117][0118]接头加入量随dna起始量变化而变化，对应关系见下表。[0119]表3[0120]样本类型建库起始量15μm接头体积(μl)血细胞800ng4cfdna》25ng4[0121]依次向反应管中加入31μl接头连接反应premix及对应体积的接头，并用ddh2o补充体积至95μl，充分振荡混匀后离心。恒温混匀仪20℃，孵育15min。孵育完成后，微量高速离心机短暂离心，将管壁上的液体离心至管底。[0122]连接反应结束后，使用磁珠纯化接头连接产物，最后回溶至25μlte缓冲液(ph8.0)中。[0123]2.3捕获前pcr(non-c-pcr)引入index[0124]按照下表顺序在pcr管中加入反应组分，并设置阴/阳性对照。[0125]表4[0126]组分单反应体积(μl)pipeline)，具体方法如下：[0143]4.1基于插入片段两端的序列碱基作为标签，所述插入片段是文库中与接头引物相连接的dna片段，经双末端测序，每个片段形成一对成对测序序列；将成对测序序列的测序序列1的前12bp碱基和测序序列2的前12bp碱基作为标签，字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列的索引，测序序列1的标签在前就标记成正链，测序序列2的标签在前就标记成反链；[0144]4.2对索引进行外部排序，以达到将同一个dna模板的所有测序重复测序序列聚集到一起的目的；[0145]4.3对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过10，以达到区分开拥有相同索引却来自不同dna模板的测序序列的目的；[0146]4.4对步骤4.3中获得的同一个dna模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序列数都达到2对以上，则进行后续分析；[0147]4.5对满足步骤4.4中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列。对于dna模板的每一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80％，且在反链测序序列中的一致率也达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为n，这样便得到了代表原始dna模板序列的新测序序列；[0148]4.6采用bwamem算法将序列比对到参考基因组grch37(hg19)上，筛除比对质量小于30的测序序列；[0149]4.7根据步骤4.6中得到的测序序列标记duplicates，采用picard的markduplicates处理；[0150]4.8参考gatk的最佳实践(bestpractice)，使用gatk的indelrealigner纠正序列末端的indel，采用gatk的baserecalibrator修正序列碱基质量值；[0151]4.9根据步骤4.8中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计目标区域覆盖大小、平均测序深度、正反链互配率和低频突变率；[0152]4.10callsnv/indel：根据受试样本与对照样本信息比对，采用mutect2和realdcaller流程进行体细胞snv/indelcalling(不涉及sv和cnv信息分析)；所使用的筛选参数为：对照位点变异率≤2％，纠错后变异测序序列条数≥2，突变预测p值≤0.05；[0153]4.11变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异记忆有变异数据库中的该变异的情况。[0154]5.计算肿瘤突变负荷[0155]5.1根据血浆样本测序数据的有效深度要求，确定纳入计算的snv和indel的频率≥5‰；[0156]5.2本实施例中计算tmb的编码区大小为1mb。[0157]本实施例中，肿瘤突变负荷的矫正公式如下：[0158][0159]6.检测结果[0160]本实施例的检测结果如下：[0161]表7[0162][0163][0164][0165]表7中的样本是没有疗效信息的样本，即没有使用抑制剂治疗样本所属受试者，该表的数据用于评估总体tmb-h比例。[0166]非小细胞肺癌血浆样本的矫正前肿瘤突变负荷的上四分位为9.36，矫正后肿瘤突变负荷的上四分位为12.15，因此，本实施例选择9和12分别作为矫正前后区分肿瘤突变负荷高低的阈值，具体是将矫正前肿瘤突变负荷≥9或矫正后肿瘤突变负荷≥12的受试者，判断为高肿瘤突变负荷的受试者。[0167]实施例2[0168]非小细胞肺癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正以及疗效预测分析[0169]本实施例中，非小细胞肺癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正参照实施例1进行。[0170]本实施例的检测结果如下：[0171]表8[0172][0173][0174]上表中各样本所属受试者在接受药物治疗时，使用的药物包括atezolizumab、durvalumab、nivolumab、bgb-a317、ibi308、ipilimumab、君实a、君实b、百济。[0175]从上表可以看出，当选择矫正前肿瘤突变负荷9作为阈值时，本实施例50例非小细胞肺癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变负荷患者的风险比为0.78(95％ci0.42-1.45，log-rankp＝0.3966)；而当选择矫正后肿瘤突变负荷12作为阈值时，本实施例50例非小细胞肺癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变患者的风险比为0.48(95％ci0.27-0.85，log-rankp＝0.0060)。矫正前，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为38％(12/32)和17％(3/18)，fisher’sexacttestp＝0.1990；矫正后，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为45％(10/22)和18％(5/28)，fisher’sexacttestp＝0.0608。上述结果表明，矫正后肿瘤突变负荷比矫正前具有更好的疗效预测性能。[0176]本实施例的样本所述患者使用的抑制剂，以往的研究以及本身的临床试验数据显示，对高肿瘤突变负荷的患者更有效，因此，我们的数据结果中，如果高突变负荷组与低突变负荷组的风险比越小、高突变负荷组的dcb越高、低突变负荷组的dcb越低，表明本实施例的预测方法更准确。[0177]在生存分析中，风险比是指一个解释变量的两个水平所描述的风险率的比值。例如，在药物试验中，治疗组患者单位时间内死亡比率是对照组患者的2倍，则风险比为2。风险比是通过prismgraphpad8软件或r包survminer和survival、采用log-rank法计算的。计算过程是行业内通用的。[0178]本实施例采用btmb除以msaf的方法矫正，而现有技术仅采用计算低频突变(4.5％或5％以下的)的方法矫正。本实施例的优势在于：在风险比相当的水平下，筛选出的阳性人群是互补的，即本实施例可以筛选出现有技术未筛选出的潜在获益患者。[0179]实施例3[0180]食管癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正[0181]本实施例中，食管癌血浆样本肿瘤突变负荷的检测、计算和矫正参照实施例1进行。[0182]本实施例中，食管癌矫正前后肿瘤突变负荷阈值采用实施例1设定。[0183]本实施例的检测结果如下：[0184]表9[0185][0186][0187][0188]上表中各样本所属受试者接受药物治疗时，所使用的药物为信达ibi308，是一种pd-1抗体。[0189]从上表可以看出，当选择矫正前肿瘤突变负荷9作为阈值时，本实施例54例食管癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变负荷患者的风险比为0.82(95％ci0.46-1.47，log-rankp＝0.4523)；而当选择矫正后肿瘤突变负荷12作为阈值时，本实施例54例食管癌患者中，高肿瘤突变负荷患者相对于低肿瘤突变患者的风险比为0.52(95％ci0.27-1.00，log-rankp＝0.0777)。矫正前，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为24％(8/33)和10％(2/21)，fisher’sexacttestp＝0.2838；矫正后，高低肿瘤突变负荷患者的dcb分别为33％(3/9)和16％(7/45)，fisher’sexacttestp＝0.3425。上述结果表明，矫正后肿瘤突变负荷比矫正前有更好的疗效预测性能。[0190]本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。[0191]以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
技术领域：
：的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。当前第1页12当前第1页12
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