酿酒酵母LJ-1及其应用的制作方法

酿酒酵母lj-1及其应用
技术领域
1.本发明属于酿酒技术领域，具体涉及酿酒酵母lj-1及其应用。


背景技术：

2.酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)在分类学上属于真核生物原界、真菌界、子囊菌门、酵母亚门、半子囊菌纲、酵母目、酵母科、酵母属。酿酒酵母菌落呈圆形，有光泽，平坦，边缘整齐，在yepd培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)中培养细胞呈小圆形或卵圆形。适宜生长温度28～30℃，最适ph值为5～7。酿酒酵母为发酵中最常用的生物种类，其繁殖方式为出芽生殖，其细胞为球形或者卵形。
3.浓香型白酒的生产以泥窖为主要容器和基础，窖泥中栖息着丰富而极其复杂的微生物菌系，为了提高窖泥培养质量，各大企业和专家学者对人工培养窖泥工作开展了大量研究，并总结形成了通过添加营养物质、老窖泥及各类功能菌，营造良好的环境条件，使有益功能菌迅速生长繁殖成优势菌群，从而培养出能够达到老窖泥特性的人工窖泥，人工窖泥一般采用己酸菌为优势菌种扩大培养，菌液中己酸含量较高，存在酸高酯低的情况，且老熟周期在90d以上。酵母菌产生的乙醇和己酸菌代谢产生的己酸发生酯化反应，生成的己酸乙酯是决定浓香型白酒质量的关键香味物质。


技术实现要素：

4.针对传统人工窖泥酸高酯低，老熟周期较长的问题。本发明提供了一种酿酒酵母lj-1。
5.该酿酒酵母lj-1的保藏编号为cctcc no：m 2020932。保藏时间为：2020年12月21日，保藏中心为：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编430072。
6.其中，上述酿酒酵母lj-1基于26s rrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.seq id no:1酿酒酵母lj-1基于26s rrna的核苷酸序列。
8.cggaggaaaagaaaccaaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttcctcgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccg。
9.其中，上述酿酒酵母lj-1的生长条件为：葡萄糖浓度为20～30％，乙醇浓度为12％，发酵温度为28～32℃，ph值为4～6。
10.进一步地，上述酿酒酵母lj-1在葡萄糖发酵培养基中发酵5d后，co2总质量损失量
23.82g，酒精度为9.7℃，残糖为0.27g/100g。
11.本发明还提供了上述酿酒酵母lj-1的筛选及鉴定方法，包括以下步骤：酿酒酵母经过纯种分离、一级初筛、二级筛选后，即获得性能优良的酿酒酵母lj-1。
12.本发明还提供上述酿酒酵母lj-1的扩大培养方法，包括以下步骤：将酿酒酵母lj-1依次经过活化、增殖培养、种子罐yepd液体培养基中培养、发酵罐yepd液体培养基中培养，即可。
13.本发明还提供了上述酿酒酵母lj-1在人工窖泥中的用途。
14.本发明还提供了含有上述酿酒酵母lj-1的人工窖泥在酿酒中的用途。
15.其中，上述酿酒酵母lj-1的人工窖泥在酿酒中的用途中，采用酿酒酵母lj-1菌液和己酸菌液混合培养人工窖泥，并将其应用于酿酒生产中。
16.有益效果：
17.1、本发明提供的经过纯种分离、一级筛选、二级筛选后的酿酒酵母lj-1，具有良好的产酒性能和耐酸性。
18.2、本发明提供的酿酒酵母lj-1通过采用茄子瓶、种子罐和发酵罐生产酵母菌菌液，突出了茄子瓶高密度培养、种子罐放量培养和发酵罐规模化培养，从而极大地减小了菌种接种量、减少了扩培次数，是提高生产效率、节约时间成本、人力成本和减少设备投入的有效途径。
19.3、通过本发明方法培养的酵母菌菌液，质量稳定，混合传统人工窖泥培养采用的己酸菌液，在丰富窖泥的菌群结构同时有效促进酯化反应的进行，加速了窖泥的老熟，缩短了窖泥老熟周期，提高了新窖的出酒率和酒质。
20.本发明的酿酒酵母lj-1的保藏编号为cctcc no：m 2020932。保藏时间为：2020年12月21日，保藏中心为：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编430072。分类命名为saccharomyces cerevisiae酿酒1号(lj-1)。
附图说明
21.图1为本发明酿酒酵母lj-1基于26s rdna d1/d2区序列扩增结果电泳图谱；其中，m代表marker；1代表cctcc no：m 2020932；
22.图2为本发明酿酒酵母lj-1基于26s rdna d1/d2区序列测序构建酵母菌株系统发育树。
具体实施方式
23.针对传统人工窖泥酸高酯低，老熟周期较长的问题。
24.a、本发明提供了一种酿酒酵母lj-1。该酿酒酵母lj-1的保藏编号为cctcc no：m2020932。保藏时间为：2020年12月21日，保藏中心为：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编430072。
25.b、本发明还提供了上述酿酒酵母lj-1的筛选鉴定方法，包括以下步骤：酿酒酵母经过纯种分离、一级初筛、二级筛选后，即获得产酒性能及耐酸性优良的酿酒酵母lj-1。
26.其中，酵母菌的分离纯化是在yepd固体培养基上划线分离3次以上，结合光学显微
镜进行个体形态观察，挑选圆形或者卵圆形，大小(1～5)um*(5～30)um，大小均匀较一致、均匀，有明显的出芽细胞的菌株。
27.其中，一级初筛是在30℃培养24h后的yepd固体培养基上，倒入ttc(2，3，5－氯化三苯基四氮唑)上层培养基，避光保存2h观察菌落颜色深浅，挑选出显色深的菌株。
28.其中，二级筛选是将筛选的显色深的产酒酵母接入25ml麦芽汁培养基中，28～30℃、160～200r/min扩培24～32h。扩培结束后，镜检计数，再按10％比例接种至250ml葡萄糖发酵培养基中，每株2个平行，密封发酵3～6d。
29.进一步地，二级筛选镜检计数酵母菌数量在3.0
×
108个/ml以上。
30.进一步地，yepd固体培养基的化学成分为：蛋白胨10g/l，酵母浸膏20g/l，葡萄糖20g/l，腺嘌呤硫酸盐0.03g/l，琼脂20g/l，ph自然。
31.进一步地，ttc上层培养基：yepd固体培养基灭菌后临用前冷却至45℃左右时，加入ttc溶液。ttc在培养基中的质量浓度为0.05％。
32.葡萄糖发酵培养基：葡萄糖20％、酵母膏1％、(nh4)2so
4 0.1％、kh2po
4 0.1％、mgso4·
7h2o 0.1％，余量为蒸馏水，组分均按重量百分比。
33.进一步地，二级筛选发酵过程每天同一时间记录co2总质量损失量(质量损失小于0.2g视为发酵结束)、发酵结束后采用直接滴定法测定样液中的残糖，比重法测定100ml蒸馏样液中的酒精度。
34.进一步的，酿酒酵母cctcc no：m 2020932在30℃密封发酵5d后，co2总质量损失量22.39g，酒精度为8.9℃，残糖为0.389g/100g。
35.进一步的，酿酒酵母cctcc no：m 2020932在葡萄糖发酵培养基上进行单因素实验，结果表明：该菌株在葡萄糖浓度为20～30％，乙醇浓度为12％左右，发酵温度为28～32℃，ph值为4～6时发酵性能良好，在最适条件下，葡萄糖发酵培养基验证实验发酵5d后，co2总质量损失量23.82g，酒精度为9.7℃，残糖为0.27g/100g。
36.本发明所提供的酿酒酵母cctcc no：m 2020932生理生化实验结果如表1-3所示：
37.表1菌株对氮源的同化情况：
38.氮源蛋白胨硫酸铵硝酸钾l-赖氨酸同化情况 －－
39.注：“ ”表示可以同化，“－”表示不能同化
40.表2菌株对糖类的发酵情况：
41.糖类葡萄糖麦芽糖半乳糖乳糖棉子糖木糖蔗糖发酵情况 － －
42.注：“ ”表示可以利用，“－”表示不能利用
43.表3菌株的其它生理生化指标：
44.生理生化指标水解淀粉产酯产酸结果
45.注：“ ”表示可以阳性，“－”表示不能阴性
46.菌种鉴定：将菌株寄送生工生物(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在ncbi网站上进行blast序列对比，确定为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，命名为酿
酒酵母酿酒1号(lj-1)。
47.c、本发明还提供上述酿酒酵母lj-1的扩大培养方法，包括以下步骤：将酿酒酵母lj-1依次经过活化、增殖培养、种子罐yepd液体培养基中培养、发酵罐yepd液体培养基中培养，即可。
48.本发明所述的酿酒酵母lj-1的培养方法，是将酿酒酵母lj-1经过茄子瓶yepd固体培养基上增殖培养、种子罐yepd液体培养基中培养、发酵罐yepd液体培养基中培养，满足酵母菌液使用条件后用于人工窖泥的培养。具体操作为：
49.a、酿酒酵母lj-1的活化、增殖培养
50.将已筛选出的酿酒酵母lj-1菌种于无菌条件下接种至yepd液体培养基中28～30℃、160～200r/min活化培养24～32h，再接种500ul至茄子瓶斜面yepd固体培养基中，28～30℃恒温培养1～2d，用500ml无菌水洗下茄子瓶斜面培养基上的酵母菌。
51.其中，制成酿酒酵母lj-1菌悬液使菌种数量初始浓度≥3.0
×
109个/ml。
52.b、酿酒酵母lj-1种子罐培养
53.将步骤a得到的酵母菌悬液以1～10％接种量接种至yepd液体培养基的种子罐中，28～30℃恒温培养1～3d，制得种子罐酿酒酵母lj-1菌液。
54.其中，菌种数量初始浓度≥3.0
×
108个/ml；
55.c、酿酒酵母lj-1发酵罐扩大培养
56.将步骤b得到的酿酒酵母lj-1菌液以1～10％接种量接种至yepd液体培养基的发酵罐中，28～30℃恒温培养1～3d，制得发酵罐酿酒酵母lj-1菌液。
57.其中，菌种数量初始浓度≥3.0
×
107个/ml；
58.其中，yepd液体培养基的组蛋白胨10g/l，酵母浸膏20g/l，葡萄糖20g/l，腺嘌呤硫酸盐0.03g/l，ph自然，组分均按重量百分比。
59.其中，菌体个数分析方法为血球计数板法。
60.进一步的是，酿酒酵母lj-1酵母菌液在使用前需满足色泽：淡黄色或浅黄色，气味：香气纯正，浓郁持久，具有酵母菌特有的气味，形态：淡黄色或浅黄色浊液，面层有丰富气泡。d、本发明还提供了上述酿酒酵母lj-1在人工窖泥中的用途。
61.首先，先用本发明酿酒酵母菌液生产人工窖泥，方法包括：是在人工窖泥培养初期以1～10％的接种量进行接种酿酒酵母lj-1酵母菌液。发酵60d后，窖泥呈黄褐色、柔熟、泡气、具有浓郁的酯香及窖泥复合香味。
62.本发明还提供了含有上述酿酒酵母lj-1的人工窖泥在酿酒中的用途。
63.其中，上述酿酒酵母lj-1的人工窖泥在酿酒中的用途中，采用酿酒酵母lj-1菌液和己酸菌液混合培养人工窖泥，并将其应用于酿酒生产中。
64.下面将通过具体实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
65.若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
66.实施例1酿酒酵母lj-1的筛选及鉴定
67.取种：从怀玉制曲生态园选择皮张薄、菌丝好、曲香浓储存3个月的有机大曲。
68.富集培养：将样品磨碎混匀，取10g样，加入90ml麦芽汁培养基中，于28～30℃、160
～200r/min富集培养24～32h。
69.纯种分离：将富集好的菌悬液稀释6个梯度，取25微升涂布平板，30℃倒置培养2d。从上述培养好的平板中挑选菌落直径在2.0mm左右，圆形，表面光滑，凸起，乳白色或白色、有光泽等符合酵母菌菌落特征菌落。将单菌落在yepd固体培养基进行3次划线，结合光学显微镜进行个体形态观察，挑选圆形或者卵圆形，大小(1～5)um*(5～30)um，大小均匀较一致、均匀，有明显的出芽细胞的菌株。选取37株，试管斜面4℃低温保存。
70.一级筛选：在培养24h的yepd固体培养基上，倒入ttc上层培养基，避光保存2h观察菌落颜色深浅。由于ttc可与酵母的代谢产物产生显色反应，酵母的产酒精能力越强则与ttc反应后菌落的呈色越深；登记颜色深浅对应菌株编号，选取颜色较深的菌株14株进行下一步产酒实验。
71.二级筛选：将筛选的显色深的产酒酵母接入25ml麦芽汁培养基中，28～30℃、160～200r/min扩培24～32h。扩培结束后，镜检计数，再按10％比例接种至250ml葡萄糖发酵培养基中，每株2个平行，密封发酵3～6d(co2总质量损失量较小后，结束发酵)，每天记录co2总质量损失量、发酵结束后采用直接滴定法测定样液中的残糖，比重法测定100ml蒸馏样液中的酒精度，选取发酵性能最好的1株进行菌种鉴定和下一步扩大培养。
72.yepd液体培养基：蛋白胨10g/l，酵母浸膏20g/l，葡萄糖20g/l，腺嘌呤硫酸盐0.03g/l，ph自然。
73.ttc上层培养基：yepd固体培养基灭菌后临用前冷却至45℃左右时，加入ttc溶液。ttc在培养基中的质量浓度为0.05％。
74.葡萄糖发酵培养基：葡萄糖20％，酵母膏1％，(nh4)2so
4 0.1％，kh2po
4 0.1％，mgso4·
7h2o0.1％，余量为蒸馏水，组分均按重量百分比。
75.菌种鉴定：将菌株寄送生工生物(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在ncbi网站上进行blast序列对比，确定为酿酒酵母，分类命名为saccharomyces cerevisiae，lj-1。于2020年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编430072。保藏编号为cctcc no：m 2020932。
76.实施例2酿酒酵母lj-1的扩大培养
77.a、酿酒酵母lj-1的活化、增殖培养
78.将已筛选出的酿酒酵母lj-1菌种于无菌条件下接种至yepd液体培养基中28～30℃、160～200r/min活化培养24～32h，再接种至茄子瓶斜面yepd固体培养基中，28～30℃恒温培养1～2d，用无菌水洗下茄子瓶斜面培养基上的酵母，制成酿酒酵母lj-1菌悬液使菌种数量在初始浓度≥3.0
×
109个/ml；
79.b、酿酒酵母lj-1种子罐培养
80.将步骤a得到的酵母菌悬液以1～10％接种量接种至yepd液体培养基的种子罐中，28～30℃恒温培养1～3d，制得种子罐酿酒酵母lj-1菌液使菌种数量在初始浓度≥3.0
×
108个/ml；
81.c、酿酒酵母lj-1发酵罐扩大培养
82.将步骤b得到的酵母菌悬液以1～10％接种量接种至yepd液体培养基的发酵罐中，28～30℃恒温培养1～3d，制得发酵罐酿酒酵母lj-1菌液使菌种数量在初始浓度≥3.0
×
107个/ml；
83.上述yepd液体培养基：蛋白胨10g/l，酵母浸膏20g/l，葡萄糖20g/l，腺嘌呤硫酸盐0.03g/l，ph自然；固体培养基加入20g/l的琼脂。
84.酿酒酵母lj-1菌液培养后使用前需要满足的鉴定条件如表4：
85.表4酿酒酵母lj-1菌液培养后使用前需要满足的鉴定条件
[0086][0087]
菌体个数分析方法为血球计数板法。
[0088]
实施例3酿酒酵母lj-1菌液应用于人工窖泥培养
[0089]
将地面清洗干净，把黄泥均匀铺在地面上，泼上一定数量的黄水和尾水，然后按比例及顺序将泥炭、麸皮、豆粕、曲粉、窖皮泥、老窖泥层层均匀铺在黄泥上面，再根据需要泼上一定的黄水和尾水，最后均匀洒上磷酸氢二钾。
[0090]
使用耙梳和铁铲将原料和黄泥拌和均匀，窖泥功能菌液采用泼洒的方式，边泼洒菌液边用搅拌机拌和窖泥，并根据水分情况添加尾水控制窖泥水分在35％～45％。
[0091]
待所有原辅料拌和均匀后且窖泥柔熟之后，将窖泥收堆成长条状，用铁铲拍光，盖上窖皮，四周用黄泥压封，采用丢糟覆盖保温使其在30～40℃的环境下密封发酵60d。
[0092]
表5酿酒酵母lj-1菌液应用于人工窖泥培养方式
[0093]
方案编号1#2#3#菌液类型酵母菌液己酸菌液酵母菌 己酸菌液
[0094]
按照表5以上三种方案分别以接种量10％，三种方案人工窖泥除菌液不同外，其余培养条件均一致。
[0095]
培养人工窖泥进行对比分析如下。
[0096]
表6不同菌液应用于人工窖泥培养微生物数量及感官评判
[0097][0098]
注：窖泥微生物计数方法：稀释平板法。
[0099]
从表6可知，发酵60d后，采用酿酒酵母lj-1菌液和己酸菌液混合培养的人工窖泥感官评判已达到柔熟、泡气的成熟标准，且具有浓郁的窖泥复合香味。
[0100]
采用酿酒酵母lj-1菌液和己酸菌液混合培养的人工窖泥细菌总量和酵母菌数量均高于采用单种菌液培养的人工窖泥。
[0101]
实施例4酿酒酵母lj-1菌液人工窖泥培养应用于酿酒生产
[0102]
将实施例3所述的三种方案培养的人工窖泥应用于同一车间3口窖池中，将每种方案的窖泥分别应用于窖池四壁和窖皮。按照以下浓香型白酒生产工艺进行生产：
[0103]
润粮：单甑投粮220kg，润料水温在85℃以上，润粮水总用量为投料量的55％～60％，润粮4～6h。
[0104]
拌糟：按照相同的粮糟比，用糠量(≤26％)，将粮食、糟醅、糠壳拌和均匀。
[0105]
上甑：轻撒匀铺、探气上甑，上甑时间控制在35～45min。
[0106]
蒸馏：缓火蒸馏，保证流酒温度25～35℃。
[0107]
取酒：分段摘酒、计重。
[0108]
出甑、打量水：量水温度要求在85℃以上，控制入窖糟水分在52～55％范围内。
[0109]
加曲摊晾：曲药用量20％。
[0110]
入窖：平地温入窖。
[0111]
发酵：发酵周期为60d。采用续糟配料生产工艺，连续跟踪3排。下表数据为3排数据的平均值。
[0112]
表7不同菌液培养人工窖泥应用于酿酒基础酒质量
[0113] 1#2#3#己酸乙酯(g/l)2.02842.46612.8979乙酸乙酯(g/l)1.09351.16981.5743乳酸乙酯(g/l)0.27380.20490.6121丁酸乙酯(g/l)0.05300.05590.1264己酸(g/l)0.20730.11870.0739
乙酸(g/l)0.59160.69880.5922丁酸(g/l)0.05050.06080.1479总酸(g/l)1.321.451.67总酯(g/l)4.924.845.32出酒率(％)34.135.439.2尝评结果绵甜醇厚、余味悠长窖香浓郁窖香浓郁、香味协调
[0114]
从表7可知，采用酿酒酵母lj-1菌液和己酸菌液混合培养的人工窖泥应用于生产中，能够有效提高新窖的出酒率10.7％；使浓香型白酒基酒中主体香味成分己酸乙酯含量增加17.5％，总酯含量明显增加10％；尝评结果表明，基酒窖香浓郁、香味协调，酒质更佳。